一种诱导羊膜间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法
【专利摘要】本发明提供了一种诱导羊膜间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，所述分化方法步骤为：将羊膜间充质干细胞种于培养瓶中，用正常培养液培养至其汇合度达到80?90％；在培养液中加入25μmol/L的5?氮胞苷，处理24小时；将细胞培养液更换为诱导培养液：IMEM基础培养基+2％FBS+20ng/ml HGF+20ng/ml FGF2+2.5mmol/L nicotinamide+10μmol/L SB431542，每隔2天换液，共7天；将细胞培养液更换为成熟培养液：IMEM+2％FBS+20ng/ml HGF+20ng/mlOSM+1μmol/L Dex，每隔两天换液，共14天。本发明诱导效率高，所述方法操作简单，可为临床提供很好地细胞来源。
【专利说明】
一种诱导羊膜间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种诱导羊膜间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法。
【背景技术】
[0002]肝脏是人体内脏中最大的器官，是人体消化系统中最大的消化腺，同时还是人体新陈代谢的重要器官。正是由于肝脏功能的重要且不可替代性，因此预防和治疗肝脏相关疾病就显得尤为必要。然而，多种因素都可以导致肝脏的急慢性损伤，如:肝炎病毒、酗酒、药物过量使用、过食肥甘厚味等。各种急慢性肝脏损伤如果得不到及时治疗，就会逐渐恶化，最终导致肝脏功能的衰竭。
[0003]目前的研究证实，对于终末期肝脏疾病，唯一有效的治疗方法就是肝脏移植。但是这一治疗方法又受限于供体不足、可能引起免疫排斥反应和后期感染等因素。近些年来，干细胞分化而来的肝脏细胞移植成为肝病(如急慢性肝炎、肝纤维化及肝坏死等)治疗的一个新手段。其中，间充质干细胞由于其来源广泛、分离简单且免疫原性低而备受关注。本研究所致力于通过多种生长因子诱导，高效地将羊膜来源的间充质干细胞分化为具有功能的肝脏样细胞，并已取得可观进展。
【发明内容】
[0004]针对上述技术现状，本发明提供一种诱导羊膜间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，通过21天的生长因子诱导，使原有的羊膜间充质干细胞变化为肝脏细胞样形态。
[0005]为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案:
[0006]一种诱导羊膜间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，所述方法步骤为:
[0007]A)将胎盘羊膜中分离出来的间充质干细胞，用含有10%胎牛血清和10ng/ml EGF的低糖DMEM培养液在37°C、5% CO2及饱和湿度的孵箱中进行培养；
[0008]当细胞传至第五代时，通过流式分析对其表面标志物进行检测以及通过成脂、成骨分化实验验证其具有多潜能分化能力；
[0009]将鉴定好的高纯度的间充质干细胞按5X 1Vcm2的密度种于T75培养瓶中，力口入15ml正常培养液进行培养；待其汇合度达到80-90%时，在培养液中加入25 μ mol/L的5-氮胞苷进行预处理，其目的是抑制细胞增殖；预处理24小时后，进入步骤B ；
[0010]B)将细胞培养瓶中原有培养液吸走，加入15ml 37°C预热的诱导培养液；所述诱导培养液的配方为:MEM 基础培养基+2% FBS+20ng/ml HGF+20ng/ml FGF2+2.5mmol/Lnicotinamide+10 μ mol/L SB431542 ;每隔2天更换一次诱导培养液,诱导时间为7天；
[0011]C)在第8天时，将细胞培养瓶中原有的诱导培养液吸走，加入15ml 37°C预热的成熟培养液，所述成熟培养液的配方为:IMEM基础培养基+2% FBS+20ng/ml HGF+20ng/mlOSM+1 μ mol/L Dex ;每隔2天更换一次成熟培养液，成熟时间为14天。
[0012]作为优选技术方案，步骤B中的诱导培养液以及步骤C中的成熟培养液采用现配现用的方法配制得到。
[0013]本发明所带来的有益效果是:通过诱导羊膜间充质杆细胞使其分化为肝脏样细胞，诱导效率高，所述方法操作简单，可为临床提供很好地细胞来源。
【附图说明】
[0014]图1是本发明所述方法流程示意图。
[0015]图2是羊膜间充质干细胞分化前后的形态图(放大倍数200X)。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0017]一种诱导羊膜间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，所述方法步骤为:
[0018]A)将胎盘羊膜中分离出来的间充质干细胞，用含有10%胎牛血清和10ng/ml EGF的低糖DMEM培养液在37°C、5% CO2及饱和湿度的孵箱中进行培养；
[0019]当细胞传至第五代时，通过流式分析对其表面标志物进行检测以及通过成脂、成骨分化实验验证其具有多潜能分化能力；
[0020]将鉴定好的高纯度的间充质干细胞按5X 1Vcm2的密度种于T75培养瓶中，力口入15ml正常培养液进行培养；待其汇合度达到80-90%时，在培养液中加入25 μ mol/L的5-氮胞苷进行预处理，其目的是抑制细胞增殖；预处理24小时后，进入步骤B ；
[0021]B)将细胞培养瓶中原有培养液吸走，加入15ml 37°C预热的诱导培养液；所述诱导培养液的配方为:MEM 基础培养基+2% FBS+20ng/ml HGF+20ng/ml FGF2+2.5mmol/Lnicotinamide+10 μ mol/L SB431542 ;每隔2天更换一次；诱导培养液，诱导时间为7天；
[0022]C)在第8天时，将细胞培养瓶中原有的诱导培养液吸走，加入15ml 37°C预热的成熟培养液，所述成熟培养液的配方为:IMEM基础培养基+2% FBS+20ng/ml HGF+20ng/mlOSM+1 μ mol/L Dex ;每隔2天更换一次成熟培养液，成熟时间为14天。
[0023]其中，所述步骤B中的诱导培养液以及步骤C中的成熟培养液采用现配现用的方法配制得到。
[0024]另外，根据实验需要，可在诱导和成熟的不同时间点观察细胞形态的变化并收集细胞进行肝细胞相关标志物如(α-甲胎蛋白、白蛋白和α 1-抗胰蛋白酶等)和功能(如糖原蓄积能力)的检测。
[0025]图1为本发明所述实施例的方法流程图，图2所示为羊膜间充质干细胞在经过上述方法步骤后的变化图，由此可见本发明所述实施例的优点是:诱导效率高，所述方法操作简单，可为临床提供很好地细胞来源。
[0026]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
【主权项】
1.一种诱导羊膜间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，其特征在于，所述方法步骤为: A)将胎盘羊膜中分离出来的间充质干细胞，用含有10%胎牛血清和10ng/mlEGF的低糖DMEM培养液在37°C、5% CO2及饱和湿度的孵箱中进行培养； 当细胞传至第五代时，通过流式分析对其表面标志物进行检测以及通过成脂、成骨分化实验验证其具有多潜能分化能力； 将鉴定好的高纯度的间充质干细胞按5X 1Vcm2的密度种于T75培养瓶中，加入15ml正常培养液进行培养；待其汇合度达到80-90%时，在培养液中加入25 μ mo I/L的5-氮胞苷进行预处理，其目的是抑制细胞增殖；预处理24小时后，进入步骤B ； B)将细胞培养瓶中原有培养液吸走，加入15ml37°C预热的诱导培养液；所述诱导培养液的配方为:IMEM 基础培养基 +2 % FBS+20ng/ml HGF+20ng/ml FGF2+2.5mmol/Lnicotinamide+10 μ mol/L SB431542 ;每隔2天更换一次诱导培养液，诱导时间为7天； C)在第8天时，将细胞培养瓶中原有的诱导培养液吸走，加入15ml37°C预热的成熟培养液，所述成熟培养液的配方为:IMEM基础培养基+2% FBS+20ng/ml HGF+20ng/mlOSM+1 μ mol/L Dex ;每隔2天更换一次成熟培养液，成熟时间为14天。2.根据权利要求1所述的一种诱导羊膜间充质干细胞分化为肝脏样细胞的方法，其特征在于，步骤B中的诱导培养液以及步骤C中的成熟培养液采用现配现用的方法配制得到。
【文档编号】C12N5/0775GK105886453SQ201410448790
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年9月5日
【发明人】阎影, 林元楷, 唐娜
【申请人】阎影, 林元楷, 唐娜