间充质干细胞分化的制作方法
【专利说明】间充质干细胞分化
[0001 ]本申请是申请人于2010年7月13日提交的题为“间充质干细胞分化”的中国专利申请201080031985.4的分案申请。
[0002]对相关申请的交叉参考引用
[0003]本申请根据美国法典35第1.119(e)款，要求美国临时申请号61/225,293(2009年7月14日递交)的权利，该临时申请的全部内容通过参考引用并入本文。
[0004]发明背景
[0005]骨关节炎(OA)是最常见的肌骨疾病。目前，大约有4千万美国人患有该病，由于人口老龄化和平均寿命的增加，该数字在接下来的20年内预计将增加到6千万，使得该疾病成为导致残疾的第四位主要原因。OA的特征在于关节的缓慢退行性降解，包括关节软骨(含有为关节提供润滑和缓冲的细胞和基质)和位于关节软骨下的软骨下骨。目前，对OA的疗法包括以口服NSAIDs或选择性环加氧酶2(C0X-2)抑制剂来减轻痛苦、以例如皮质类固醇和透明质素等药剂进行关节内(IA)注射、以及外科手术的方法。
[0006]间充质干细胞(MSCs)存在于成人的关节软骨中，其分离后能够在体外被程序化以经历分化而成软骨细胞和其它间充质细胞谱系。这部分地受生长因子(TGFi3s、BMPs)、血清条件和细胞-细胞接触的调节。
发明概要
[0007]本发明提供了改善或防止哺乳动物关节炎或关节损伤的方法。在一些实施方案中，本发明方法包括对哺乳动物的关节施用组合物，所述组合物包含有效量的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或25具有至少95%同一性的氨基酸序列，从而改善或防止哺乳动物关节炎或关节损伤。
[0008]在一些实施方案中，个体具有关节炎或关节损伤。在一些实施方案中，个体没有关节炎或关节损伤，但具有关节炎或关节损伤的风险。
[0009]在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1或25。
[0010]在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID N0s:2、3、4、26、27或28具有至少95%同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID N0s:2、3、4、26、27或28。
[0011]在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NOs:5-24之任一至少80%相同。在一些实施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID NOs:5-24之任一。
[0012]在一些实施方案中，关节炎选自骨关节炎、创伤性关节炎和自身免疫性关节炎。
[0013]在一些实施方案中，哺乳动物为人。
[0014]在一些实施方案中，组合物还包括透明质酸。
[0015]本发明也提供了诱导间充质干细胞分化形成软骨细胞的方法，所述软骨细胞形成软骨基质。在一些实施方案中，本发明方法包括使间充质干细胞与足够量的多肽接触以诱导干细胞分化形成软骨细胞，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或25具有至少95%同一性的氨基酸序列。
[0016]在一些实施方案中，本发明方法在体外进行。在一些实施方案中，本发明方法在体内进行，干细胞存在于哺乳动物体内。在一些实施方案中，哺乳动物为人。
[0017]在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1或25。
[0018]在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID N0s:2、3、4、26、27或28具有至少95%同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID N0s:2、3、4、26、27或28。
[0019]在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NOs:5-24之任一至少80%相同。在一些实施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID NOs:5-24之任一。
[0020]本发明也提供了用于关节内递送和全身递送的药物组合物。在一些实施方案中，组合物包含药学有效量的多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:1或25具有至少95%同一性的氨基酸序列。
[0021]在一些实施方案中，组合物还包括透明质酸。
[0022]在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:1或25。
[0023]在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NOs:2、3、4、26、27或28具有至少95%同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID N0s:2、3、4、26、27或28。
[0024]在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID NOs:5_24之任一至少80%相同。在一些实施方案中，氨基酸序列包含SEQ ID NOs:5-24之任一。
[0025]本发明的其它特征、优点和实施方案可以从以下详细描述和权利要求中得到阐明或显而易见。此外，应理解的是，上述发明概述和以下的详细描述均是举例说明性的，旨在提供进一步的解释而不是限制本发明的保护范围。
[0026]定义
[0027]术语“肽模拟物”(peptidomimetic)和“模拟物”(mimetic)指合成的化学化合物，所述化合物与天然或非天然产生的多肽(例如，ANGPTL3)具有基本上相同的结构和功能特征。肽类似物普遍用在制药业中，作为与模板肽具有类似特性的非肽药物。这些类型的非肽化合物被称为“肽模拟物” (peptide mime tics 或peptidomime tics) (Fauchere ,J.Adv.DrugRes.15:29(1986);Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；和Evans等，J.Med.Chem.30:1229(1987)，通过参考引用将它们整合到本文中)。可以使用在结构上与治疗有用的肽相似的肽模拟物来产生等效的或增强的治疗或预防效果。通常，肽模拟物在结构上与范例多肽(paradigm polypeptide)(即，具有生物学或药理学活性的多肽)相似，例如在目的多肽中所发现的，但是其一个或多个肽键任选地被选自如下的键替代:例如-CH2NH-、-CH2S-、_CH2-CH2-、-CH=CH-(顺式和反式)、-C0CH2-、_CH(OH)CH2-、和-CH2S0-。模拟物可以完全由合成的、非天然的氨基酸类似物组成，或者是由部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物组成的嵌合分子。模拟物也可以并入任何数量的天然氨基酸保守性替换，只要该替换不实质性地改变模拟物的结构和/或活性。例如，如果模拟组合物能够执行目的多肽的至少一种活性，它就属于本发明的范围内。
[0028]术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可替换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，以及适用于其中一个或多个氨基酸残基为对应的天然氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。
[0029]术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸、以及以和天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸、以及随后被修饰的氨基酸(例如，羟脯氨酸、T -羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物是指具有和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留了和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和砸代半胱氨酸。
[0030]“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。就具体的核酸序列而言，保守修饰变体是指那些编码相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或是在核酸不编码氨基酸序列时编码基本相同的序列的核酸。因为遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质都可以由许多功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个由密码子规定丙氨酸的位置，该密码子可以改变为任何上述相应的密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异为“沉默变异”，它属于保守修饰变异的一种。在本文中每一个编码多肽的核酸序列也描述该核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员知道，可以对核酸中的每一个密码子进行修饰(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子；以及TGG，它通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能相同的分子。因此，每一个所描述的序列都隐含编码多肽的核酸的每一个沉默变异。
[0031]关于氨基酸序列，技术人员知道，导致编码序列中单氨基酸或小百分数氨基酸改变、添加或缺失的核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单替换、缺失或插入，当该改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸替换时，是“保守修饰变体”。提供功能类似的氨基酸的保守置换表在本领域公知。这样的保守修饰变体另外附加于并且不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。
[0032]以下八组中每一组包含互相之间保守替换的氨基酸:
[0033]I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
[0034]2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
[0035]3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
[0036]4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);
[0037]5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);
[0038]6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
[0039]7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);以及
[0040]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(见，例如Creighton ,Proteins (1984))。
[0041]通过在比较窗口内对两个最佳比对的序列进行比较来确定“序列同一性百分比”，其中，与不包含添加或缺失的参考序列(例如，本发明的多肽)相比较，多核苷酸序列在比较窗内的部分可以包含添加或缺失(即，空位)，以获得两个序列的最佳比对。百分比的计算如下:计算两个序列中一致的核酸碱基或氨基酸残基出现的位置的数量以得到匹配位置的数量，以匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数并将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。
[0042]在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”是指，两个或更多个序列或子序列是相同的序列。当使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视检查进行测定时，当为在比较窗口或指定区域内获得最大对应性而进行比较和比对时，如果两个序列具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域上，或在未规定时，在整个序列上，60%相同，任选地65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同)，则两个序列是“基本相同的”。本发明提供分别与本文中例示的多肽(例如，SEQ ID NOs:1-28之任一)基本相同的多肽，以及这些多肽的应用，包括但不限于用于治疗或预防关节炎或关节损伤。可选地，同一性存在于参考序列的至少约50个核苷酸长度的区域上，或更优选地，存在于100至500个、或1000个或更多个核苷酸长度的区域上或整个长度上。
[0043]为了进行序列比较，典型地，一个序列充当参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，指定子序列的坐标，如果需要的话，指定序列算法的程序参数。可以使用默认的程序参数，或指定替代参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
[0044]本文中所使用的“比较窗口”包括具有选自以下的任一数量的连续位置的区段:20至600、通常约50至约200、更多地是约100至约150，在该区段中在对两个序列进行最优比对后，可以将序列与具有相同数量的连续位置的参考序列进行比较。用于进行比较的序列比对方法在本领域公知。用于进行比较的最优序列比对可以按以下方法来进行:例如，Smith和Waterman(1970) (Adv.Appl.Math.2: 482c)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch(1970)(J.Mol.B11.48:443)的同源性比对算法，Pear son和Lipman (1988) (Proc.Nat ’1.Acad.Sc1.USA 85:2444)的相似性搜索方法，以计算机执行这些算法(Wisconsin遗传学软件包(Computer Group , 575Science Dr.,Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA 和TFASTA)，或手工比对和目视检查(见，例如Ausubel等，Current Protocols in MolecularB1logy( 1995年增刊)。
[0045]两个适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST2.0,它们分别描述于Altschul 等(1977) Nuc.Ac ids Res.25: 3 389-340 2和Altschu I 等(1990)J.Mol.B11.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可以从美国国家生物技术信息中心公开获取。该算法包括首先