蛋白质中”B10rganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521_1524;Chin等(2002) “向大肠杆菌的遗传密码添加对-叠氮-L-苯丙氨酸” J Am Chern Soc 124:9026-9027;以及国际公布号W02006/034332，2005年9月20日递交，每一文献的内容均就其全部通过参考引用整合到本文中。另外的细节见于美国专利号 7，045，337、7，083，970、7，238，510、7，129，333、7，262，040、7，183，082、7，199，222和7，217，809。
[0064]“非天然编码氨基酸”是指非常见氨基酸或吡咯赖氨酸或砸代半胱氨酸的氨基酸。可以使用的与术语“非天然编码氨基酸”同义的其它术语有“非-天然的氨基酸”、“非天然氨基酸”、“非天然存在的氨基酸”，以及它们的各种带连字符和不带连字符的形式。术语“非天然编码氨基酸”也包括但不限于通过修饰(例如，翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括但不限于20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和砸代半胱氨酸)而产生的氨基酸，但是其自身不通过翻译复合物天然整合进正在生长的多肽链中。这样的非天然存在的氨基酸的例子包括但不限于N-乙酰氨基葡萄糖基(gluCOsaminyl)-L-丝氨酸、N-乙酰氨基葡萄糖基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。
[0065]非天然编码氨基酸典型地为具有不用于20种天然氨基酸中的任何取代侧链的任何结构。因为本发明的非天然编码氨基酸典型地仅在侧链的结构上不同于天然氨基酸，故非天然编码氨基酸与其它氨基酸(包括但不限于天然或非天然编码的)形成酰胺键，形成方式与在天然存在的多肽中酰胺键的形成方式相同。然而，非天然编码氨基酸具有与天然氨基酸不同的侧链基团。例如，R任选地包括烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、链烯基、炔基、醚、硫醇、砸基、磺酰基、硼酸、硼酸酯(boronate)、磷酸、磷酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或它们的任何组合。可适用于在本发明中应用的其它目的非天然存在的氨基酸包括但不限于，包含光激活交联剂的氨基酸；自旋标记氨基酸;荧光氨基酸;金属结合氨基酸;含金属氨基酸;放射性氨基酸;具有新官能基团的氨基酸；与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸;photocaged和/或光致异构化的氨基酸;包含生物素或生物素类似物的氨基酸;糖基化的氨基酸(例如糖取代的丝氨酸)；其它碳水化合物修饰的氨基酸；含酮氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸;可化学断裂和/或光断裂的氨基酸;与天然氨基酸相比具有延长的侧链的氨基酸，所述侧链包括但不限于聚醚或长链烃(包括但不限于多于约5个或多于约10个碳原子)；包含与碳连接的糖的氨基酸;具有氧化还原活性的氨基酸;包含氨基硫代酸的氨基酸；以及包含一个或多个毒性结构组分的氨基酸。
[0066]可适用于在本发明中应用并可用于与水溶性聚合物反应的示例性非天然编码氨基酸包括但不限于，那些具有羰基、氨基氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮和炔反应基团的氨基酸。在一些实施方案中，非天然编码氨基酸包含糖结构组分(moiety)。这样的氨基酸的例子包括N-乙酰-L-氨基葡萄糖基-L-丝氨酸、N-乙酰-L-氨基半乳糖基-L-丝氨酸、N-乙酰-L-氨基葡萄糖基-L-苏氨酸、N-乙酰-L-氨基葡萄糖基-L-天冬酰胺和O-氨基甘露糖基-L-丝氨酸。这样的氨基酸的例子也包括在氨基酸和糖之间的天然N-或O-连接被在天然中不常见的共价键(包括但不限于烯烃、肟、硫醚、酰胺等)替代的例子。这样的氨基酸的例子也包括在天然存在的蛋白质中不常见的糖，例如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。
[0067]另一类能够可选地引入到本发明ANGPTL3蛋白中的修饰(例如，在多肽链内部或在N-或C-端)(例如，为了延长体内半衰期)是聚乙二醇化或长链聚乙二醇(PEG)聚合物的掺入。引入PEG或长链PEG聚合物可以增加本发明多肽的有效分子量，例如以防止快速过滤到尿液中。在一些实施方案中，ANGPTL3序列中的赖氨酸残基直接或通过接头缀合PEG。这样的接头可以是，例如Glu残基或包含硫醇官能团的酰基残基，以用于连接到经合适修饰的PEG链。用于引入PEG链的另一可选方法是首先在C-末端或在溶剂暴露残基处(例如替换Arg或Lys残基)引入Cys残基。该Cys残基随后位点特异性地连接到包含例如马来酰亚胺官能的PEG链。用于掺入PEG或PEG长链聚合物的方法在本领域公知，其描述于例如Veronese，F.M.等，Drug Disc.Today 10:1451-8(2005) ;Greenwald，R.B.等，Adv.Drug Deliv.Rev.55:217-50(2003) !Roberts,M.J.等，Adv.Drug Deliv.Rev.,54:459-76(2002)，其内容通过参考引用并入本文。其它在本领域已知的聚合物缀合方法也可以用于本发明中。在一些实施方案中，将聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)(PMPC)作为聚合物引入与本发明的ANGPTL3蛋白连接(见例如，师2008/098930;1^￥丨3等，8丨0(301^1^ Chem.，19: 2144-55(2008))。在一些实施方案中，与ANGPTL3蛋白缀合的含磷酸胆碱的聚合物可以用于本发明中。技术人员十分明了，可利用其他生物相容的聚合物缀合物。
[0068]最近报道了通过掺入非天然氨基酸(如以上所描述)来掺入PEG或PEG聚合物的可供选择的方法，可以对本发明的多肽使用此方法。该方法利用进化的tRNA/tRNA合成酶对(在表达质粒中由琥珀抑制密码子编码)(Deiters，A.等(2004)Bia-arg.Med.Chem.Lett.14,5743-5)。例如，可以将P-叠氮基苯丙氨酸掺入进本发明的多肽，然后P-叠氮基苯丙氨酸在能够促进称为“Huisgen[3+2]环加成”的有机反应的还原剂和铜离子的存在下，和具有乙炔部分的PEG聚合物进行反应。
[0069]在某些实施方案中，本发明涉及ANGPTL3蛋白的特定突变以改变多肽的糖基化。可以对这样的突变进行选择以引入或消除一个或多个糖基化位点，所述糖基化位点包括但不限于O-连接的或N-连接的糖基化位点。在某些实施方案中，与天然存在的ANGPTL3蛋白相比较，本发明的ANGPTL3蛋白具有未经改变的糖基化位点和模式。在某些实施方案中，ANGPTL3蛋白的变体包括糖基化变体，与天然存在的ANGPTL3蛋白相比较，变体中糖基化位点的数量和/或类型已经被改变了。在某些实施方案中，与天然的多肽相比较，多肽的变体包含更多或更少数量的N-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化位点以序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr为特征，其中标为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸以外的其它任何氨基酸残基。通过对氨基酸残基的替换来获得该序列，可以提供用于添加N-连接的糖链的潜在新位点。可选地，消除该序列的替换将移去已存的N-连接的糖链。在某些实施方案中，提供对N-连接的糖链的重排，其中消除一个或多个N-连接的糖基化位点(典型地那些天然存在的位点)并建立一个或多个新的N-连接位点。
[0070]示例性ANGPTL3蛋白变体包括半胱氨酸变体，与天然存在的ANGPTL3蛋白的氨基酸序列相比较，变体中的一个或多个半胱氨酸残基被缺失或被另外的氨基酸(例如，丝氨酸)替代。在某些实施方案中，当ANGPTL3蛋白必须重折叠成生物活性构象时(例如在分离不溶性包涵体后)，半胱氨酸变体可能是有用的。在某些实施方案中，半胱氨酸变体具有比天然多肽更少的半胱氨酸残基。在某些实施方案中，半胱氨酸变体具有偶数个半胱氨酸残基以使由于不成对的半胱氨酸导致的相互作用降到最低。
[0071 ]在一些实施方案中，ANGPTL3蛋白的功能性变体或修饰形式包括本发明ANGPTL3蛋白和一个或多个融合结构域的融合蛋白。融合结构域的众所周知例子包括但不限于多聚组氣Sg、Glu-Glu、谷耽甘妝S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链丨旦定区(Fe)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、或人血清白蛋白。可以对融合结构域进行选择以赋予期望特性。例如，一些融合结构域对通过亲和层析来分离融合蛋白特别有用。为了亲和纯化目的，可以使用相关的亲和层析基质，例如谷胱甘肽_、淀粉酶_、镍-或钴-缀合的树脂。许多这样的基质可以以“试剂盒”的形式获得，例如Pharmacia GST纯化系统和与(HIS6)融合配偶体一起使用的QIAexpress?系统(Qiagen)。作为另一个例子，可以对融合结构域进行选择以方便ANGPTL3蛋白的检测。这样的检测结构域的例子包括各种荧光蛋白(例如，GFP)以及“表位标签”，所述表位标签通常是可获得特异性抗体的短肽序列。众所周知的特异性单克隆抗体容易获得的表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶切割位点(例如对于因子Xa或凝血酶)，这允许相关蛋白酶部分地消化融合蛋白从而将重组蛋白从其中释放出来。然后可以利用随后的层析分离从融合结构域中分离释放的蛋白质。在某些实施方案中，将ANGPTL3蛋白与在体内稳定ANGPTL3蛋白的结构域(“稳定者”结构域)融合。“稳定”意指增加血清半衰期的任何事件，不管是因为降低破坏、降低肾清除，还是由于其它药代动力学效应。已知与免疫球蛋白Fe部分的融合可以赋予许多蛋白质期望的药代动力学特性。类似地，与人血清白蛋白的融合能够赋予期望特性。可以选择的其它类型融合结构域包括多聚化(例如，二聚化、四聚化)结构域和功能性结构域(即赋予所需要的额外的生物学功能的结构域)。
[0072]ΙΠ.促血管生成素样3蛋白质的疾病适应症
[0073]可以想到的是，本发明的多肽、组合物和方法可以用于治疗或防止任何类型的关节炎或关节损伤。还可以想到的是，本发明的多肽、组合物和方法可以用于治疗或防止各种软骨病症(cartilaginous disorders)。在一些实施方案中，施用本发明的蛋白质以防止关节炎或关节损伤，例如在有关节炎或关节损伤的遗传或家族史时或在关节外科手术之前或期间。可以以本发明的多肽、组合物和方法进行治疗或预防的示例性病情(condit1ns)或病症包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、幼年慢性关节炎、骨关节炎、退行性椎间盘病、脊椎关节病、系统性硬化病(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、Sjogren综合征、系统性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫性全血细胞减少症、阵发性睡眠性血红蛋白尿)、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少症)、甲状腺炎(Graves病、桥本氏甲状腺炎、幼年型淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎(atrophic thyroiditic))、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球肾炎、肾小管间质性肾炎)、中枢神经系统和周围神经系统的脱髓鞘病(例如多发性硬化、特发性脱髓鞘性多发性神经病或Gui I Iain-Barr综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病)、肝胆疾病(例如传染性肝炎(甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎和其它非嗜肝病毒)、自身免疫性慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿性肝炎、硬化性胆管炎)、炎性肠病(溃疡性结肠炎:克罗恩病)、麸质过敏性肠病、Whipple病、自身免疫或免疫介导的皮肤病(包括大疱性皮肤病、多形红斑和接触性皮炎、牛皮癣)、过敏性疾病(例如哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏反应和荨麻疹)、肺部免疫性疾病(例如嗜酸性粒细胞性肺炎、特发性肺纤维化和过敏性肺炎)、移植相关疾病(包括移植排斥和移植物抗宿主病)。在本发明的一些实施方案中，本发明的多肽、组合物和方法可以用于治疗骨关节炎。
[0074]在一些实施方案中，本发明的多肽、组合物和方法提供用于在因创伤性损伤或软骨病而已被损坏的软骨组织中刺激软骨细胞增殖和软骨产生的方法。对于治疗特别重要的是展示关节面的组织，例如脊椎、肩、肘、腕、指关节、髋、膝、踝和足关节。可以通过治疗而获益的疾病的例子包括骨关节炎、类风湿性关节炎、其他自身免疫病、或分离性骨软骨炎。此夕卜，软骨畸形常见于人的侏儒症中，表明本发明的多肽、组合物和方法可对这些病人有用。
[0075]可以想到的是，本发明的多肽、组合物和方法可以用来治疗哺乳动物。文中所使用的“哺乳动物”是指任何分类为哺乳动物的哺乳动物，包括人、家畜及农场动物，以及动物园动物、运动动物或宠物动物、例如牛(例如奶牛)、马、狗、棉羊、猪、兔、山羊、猫等。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物为人。
[0076]在一些实施方案中，本发明的多肽可以与待治疗的哺乳动物异源。例如，使用牛ANGPTL3蛋白或其片段，S卩来源于牛ANGPTL3蛋白的蛋白质或肽(例如，修饰的牛ANGPTL3蛋白、牛ANGPTL3蛋白的保守变体、来源于牛ANGPTL3蛋白的肽模拟物)治疗人类患者。在一些实施方案中，可以使用异源的ANGPTL3蛋白扩增培养中的软骨细胞群以用于移植。在一些实施方案中，然后将扩增的培养物和与待治疗的哺乳动物同源的多肽和组合物混合，施用于关节间隙或直接施用于软骨缺损处。可选地，本发明的多肽来源于相同的物种，即，使用人ANGPTL3蛋白或其片段——来源于人ANGP