一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法

专利名称：：一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法
技术领域：
：本发明涉及一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，属于植物育种
技术领域：
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背景技术：
：游离小孢子培养是在花药培养基础上发展起来的一项新兴技术，是植物细胞工程领域最活跃的研究课题之一。小孢子具有单倍性，这在作物育种上具有重要的应用价值，具体表现在(1)通过单倍体的染色体加倍即可获得纯合的二倍体，从而大幅度縮短育种所需的年限。一般常规育种至少需5-7年才能筛选出纯合稳定的自交系，而利用游离小孢子培养技术获得纯合自交系只需1-2年。(2)对单倍体或由其加倍而成的双单倍体(DH)的选择实质上是孢子选择，这比常规育种从F2代群体中对一个特定基因型选择的效果大为提高。尤其是倍性性状的选择，如对具有隐性基因个体，DH群体中频率为1/64，而在F2群体中频率仅为1/4096。单倍体植物的单套染色体不存在显性基因掩盖隐性基因的现象，因此单倍体植株的表现型和基因型是一致的，这在杂交育种和诱变育种中可避免"误选"，从而大大提高工作效率。游离小孢子培养技术在自交系纯化尤其是及縮短品种更新周期中发挥了重大作用。常规育种获得一个遗传稳定的自交系一般需要5~8年的时间，而利用小孢子培养技术只需要12年。另外，游离小孢子培养技术也为现代基因工程研究提供了很好的受体材料。正是由于其上述优点，故在许多作物中均开展工作了游离小孢子培养的研究工作。利用游离小孢子培养来加速育种材料快速纯化的技术已在国外种苗公司广泛用于十字花科作物育种上，几乎成为一项常规的育种技术。而在我国，这项技术仅在甘蓝型油菜、白菜等少数十字花科作物的品种选育上应用。比较突出的实例有2个，一个是北京巿农林科学院蔬菜研究中心利用这一技术选育出了"桔红心"大白菜；另一个是河南省农科院利用DH群体选育成豫白菜7号。而在其他十字花科蔬菜作物如花椰菜、绿菜花、萝卜等尚处于由试验阶段向育种实践的应用中。萝卜是异花授粉作物，其杂种优势十分明显。利用游离小孢子培养技术可在较短时间内固定杂种优势。与常规育种技术相比，具有效率高、工作量小等优点。从亲缘关系上来讲，萝卜属与芸薹属同属于十字花科作物，具有一定的血缘关系。但该属是十字花科作物中最不容易进行游离小孢子培养成功的材料之一。对其小孢子培养研究表明，该属是十字花科作物中最不容易进行游离小孢子培养成功的材料，目前只见到2篇成功的报道。一篇是日本学者YoshihitoTakahata(1996)在日本萝卜的6个品种中获得了胚状体，成胚率为0.2-8.3个/105个小孢子；另一篇为我课题组的报道，成胚率为16.0个/105个小孢子。从目前研究水平来看，萝卜小孢子培养的成胚率较低，成胚基因型范围狭窄，尤其在目标基因型中尚不能获得胚状体，这些严重限制了该技术在萝卜育种上的应用。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种有效提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，包括如下步骤(1)灭菌花蕾用60-80%酒精灭菌20—40秒(优选30秒)，再用含1-3%(体积百分比浓度，优选2%)有效氯离子的次氯酸钠溶液灭菌10-20分钟；在用无菌水冲洗2-4次(优选3次)，每次2-6分钟(优选5分钟)；(2)花药预处理在无菌条件下取出花药，接种在Bs-13(含13%蔗糖，添加甘露醇浓度15g/L)培养基和Bs-13(含13n/。蔗糖，添加加秋水仙素浓度20mg/L)培养基上，每培养皿中接种30个花药；将接种后的花药在4'C低温条件下低温培养2-4天(优选3天)；(3)分离小孢子将低温处理后的花药，在无菌条件下分别取出，在研钵中用研棒轻轻挤压花药使小孢子游离出来，经400目尼龙网过滤后收集在10ml的离心管中，用Bs-13培养基洗涤2-4次(优选3次)，每次2-4分钟(优选3分钟)；(4)小孢子培养将小孢子在1/2NLN液体培养基中培养，用血球计数板将小孢子终浓度调整为12Xl()S个/ml，25。C暗培养10-20天；培养中的小孢子经32-35°C(优选33-C)热激24小时后，于25。C进行暗培养，直至长出胚状体。发明的优点是本发明经过了大量的实验，对数据进行分析和优选，最终获得了提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法。本方法在进行萝卜小孢子培养之前，将花药离体，并在合适的培养基上进行低温预处理，这种预处理对萝卜小孢子培养产生两方面的影响①使未成胚的萝卜品种产生了胚状体；②使成胚萝卜品种的成胚率有所提高，从16.0个/105个小孢子提高到40.0个/105个小孢子，提高了2.5倍。利用该方法进行中国萝卜游离小孢子培养，可获得较高的频率的胚状体，解决了中国萝卜游离小孢子培养胚状体再生的难题。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为未经预处理小孢子少量成胚或未成胚。图2为花药经低温预处理后成胚率提高。图3为花药低温处理使未成胚萝卜品种形成胚状体。图4为花药低温处理使成胚萝卜品种的成胚率提高。图5为胚状体正常绿化。图6为胚状体正常成苗。具体实施例方式实施例1:(1)灭菌取盛花期的花蕾，花蕾用70%酒精灭菌30秒，再用含2%有效氯离子的次氯酸钠溶液灭菌15分钟；在用无菌水冲洗3次，每次5分钟。(2)花药预处理在无菌条件下取出花药，接种在Bs-13(含13%蔗糖，添加甘露醇浓度15g/L)培养基上，每培养皿中接种30个花药；将接种后的花药在4t低温条件下低温培养3天。(3)分离小孢子将低温处理后的花药，在无菌条件下分别取出，在研钵中用研棒轻轻挤压花药使小孢子游离出来，经400目尼龙网过滤后收集在10ml的离心管中，用Bs-13培养基洗涤3次，每次2-4分钟3分钟。(4)小孢子培养将小孢子在1/2NLN液体培养基中培养，用血球计数板将小孢子终浓度调整为l-2Xl()S个/m1,培养中的小孢子经33'C热激24小时后，于25'C进行暗培养，直至长出胚状体。将胚状体转至B5-2生芽培养基中，置于25'C的光照培养箱中培养，直至长成小孢子植株；选择生长正常的小孢子植株，切下腋芽，置于Bs-2生根培养基上生根，最终获得小孢子植株再生苗。3周后统计出胚数。以不经低温处理的花蕾为对照。统计结果见表l。表1<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明所述的各种培养基及其配制方法为本领域公知常识，典型成份如下B5-13培养基每升培养基中含大量元素硝酸钾(KN03)2527.5毫克，硫酸镁(MgS04'7H20)246.5毫克，氯化f5(CaCl2'2H20)150毫克，硫酸铵((NH4)2S04)134毫克，磷酸二氢钠(NaH2P04H20)150毫克；微量元素硫酸锰(MnS04H20)10毫克，硼酸(H3B03)3.0毫克，硫酸锌(ZnS047H2O)2.0毫克，钼酸钠(Na2Mo04'2H2O)0.25毫克，硫酸铜(CuSO4'7&0)0.025毫克，氯化钴(CoCl261120)0.025毫克，碘化钾(KI)0.75毫克；有机物肌醇100毫克，烟酸1毫克，盐酸吡哆醇l毫克，盐酸硫胺素10毫克；EDTA铁钠盐40毫克；蔗糖浓度13%。配制及灭菌方法Bs-2固体培养基大量元素、微量元素、有机物及铁盐含量均与B5-13相同，蔗糖浓度为2%，琼脂浓度0.8%。1/2NLN培养基每升培养基中含大量元素硝酸钾(KN03)62.5毫克，硫酸镁(MgS04'7H20)62.5毫克，硝酸钙(Ca(N03)24H2O)250毫克，磷酸二氢钾(101204)62.5毫克；微量元素硫酸锰(MnS04'4H20)22.3毫克，硼酸(H3B03)6.2毫克，硫酸锌(ZnS04*7H20)8.6毫克，钼酸钠(Na2Mo04'2H20)0.25毫克，硫酸铜(CuS04'5820)0.025毫克，氯化钴(CoCl26H2O)0.025毫克；有机物甘氨酸2毫克，烟酸5毫克，盐酸吡哆醇0.5毫克，盐酸硫胺素0.5毫克，叶酸0.5毫克，生物素0.05毫克，肌醇100毫克，还原型谷胱甘肽30毫克，谷氨酰胺800毫克，丝氨酸100毫克；EDTA铁钠40毫克；蔗糖浓度13%。权利要求1.一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，其特征在于包括如下步骤(1)灭菌花蕾用60-80％酒精灭菌20-40秒，再用含1-3％有效氯离子的次氯酸钠溶液灭菌10-20分钟；在用无菌水冲洗2-4次，每次2-6分钟；(2)花药预处理在无菌条件下取出花药，接种在B5-13(含13％蔗糖，添加甘露醇浓度15g/L)培养基上，每培养皿中接种30个花药；将接种后的花药在4℃低温条件下低温培养2-4天；(3)分离小孢子将低温处理后的花药，在无菌条件下分别取出，在研钵中用研棒轻轻挤压花药使小孢子游离出来，经400目尼龙网过滤后收集在10ml的离心管中，用B5-13培养基洗涤2-4次，每次2-4分钟；(4)小孢子培养将小孢子在1/2NLN液体培养基中培养，用血球计数板将小孢子终浓度调整为1～2×105个/ml，25℃暗培养10-20天；培养中的小孢子经32-35℃热激24小时后，于25℃进行暗培养，直至长出胚状体。2.根据权利要求1所述的一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，其特征在于所述(1)灭菌花蕾用70%酒精灭菌30秒，再用含2%有效氯离子的次氯酸钠溶液灭菌15分钟；在用无菌水冲洗3次，每次5分钟。3.根据权利要求1所述的一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，其特征在于所述(2)花药预处理在无菌条件下取出花药，接种在B5-13(含13%蔗糖，添加甘露醇浓度15g/L)培养基上，每培养皿中接种30个花药；将接种后的花药在4℃低温条件下低温培养3天。4.根据权利要求1所述的一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，其特征在于所述(3)分离小孢子将低温处理后的花药，在无菌条件下分别取出，在研钵中用研棒轻轻挤压花药使小孢子游离出来，经400目尼龙网过滤后收集在10ml的离心管中，用B5-13培养基洗涤3次，每次3分钟。5.根据权利要求1所述的一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，其特征在于所述(4)小孢子培养将小孢子在1/2NLN液体培养基中培养，用血球计数板将小孢子终浓度调整为12X105个/ml，25℃暗培养15天，；培养中的小孢子经33℃热激24小时后，于25℃进行暗培养，直至长出胚状体。全文摘要本发明公开了一种提高萝卜游离小孢子培养成胚率的方法，属于植物育种
技术领域：
。该方法包括如下步骤(1)灭菌；(2)花药预处理；(3)分离小孢子；(4)小孢子培养。发明的优点是本方法在进行萝卜小孢子培养之前，将花药离体，并在合适的培养基上进行低温预处理，这种预处理对萝卜小孢子培养产生两方面的影响①使未成胚的萝卜品种产生了胚状体；②使成胚萝卜品种的成胚率有所提高，从16.0个/10⁵个小孢子提高到40.0个/10⁵个小孢子，提高了2.5倍。利用该方法进行中国萝卜游离小孢子培养，可获得较高的频率的胚状体，解决了中国萝卜游离小孢子培养胚状体再生的难题。文档编号C12N5/04GK101343619SQ200710118650公开日2009年1月14日申请日期2007年7月11日优先权日2007年7月11日发明者付传翠,丽张,白小娟申请人:北京市农林科学院