专利名称：利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育临保系的方法
技术领域：
本发明涉及甘蓝型油菜育种领域，具体涉及一种利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育临保系的方法。
背景技术：
甘蓝型油菜游离小孢子的分离技术简单，通过游离小孢子培养技术获得胚状体和再生苗的效率显著高于花药培养，而且小孢子培养是研究花粉细胞分化条件、胚胎发生和形态建成机理的一种较为理想的方法，因此该技术一直受到各国油菜育种家的普遍青睐。多年来，许多学者对小孢子培养的培养基成份、蕾的大小、小孢子培养过程中温度的变化、提高再生苗频率等诸方面进行了广泛的研究，使得小孢子培养技术逐步成熟并得到了广泛的应用。
在常规杂交育种中，获得稳定遗传的后代或株系一般要经过5～8代性状选择。如果对F1代植株进行小孢子培养，再生植株为单培体，经染色体加倍后产生纯合二倍体单株(double haploid，简称DH)，这种二倍体单株各种遗传性状已纯合，不会发生分离，因此可以快速使性状纯合；在小孢子培养形成的DH系后代中，没有显性基因掩盖隐性基因表现的干扰，有利于对隐性基因的筛选；DH系后代的性状理论上是按照配子体基因型(花粉基因型)分离的，即以2n分离，而F2代的性状理论上是按照胞质体基因型分离的，即以4n分离，为了得到目标性状单株，前者群体远远小于后者，因此甘蓝型油菜小孢子培养技术在许多油菜育种计划中得到应用。
20118A是上海市农业科学院孙超才研究员于1997年选育的一种新的隐性细胞核雄性不育，其不育株花药空瘪，无花粉，套袋自交不结实，且不育性稳定，不受环境条件的影响。通过普通遗传学研究证明20118AB为隐性上位互作遗传模式，即其不育性受两对重叠隐性不育基因(a和b)与一对隐性上位抑制基因(rf)互作控制，隐性上位基因纯合时对隐性不育基因起作用。不育系可通过兄妹交保持，不育株的基因型有纯合型aabbRfRf和杂合型aabbRfrf两种，三对基因为隐性(aabbrfrf)时可作临保系，与纯合型不育系杂交能够生产全不育群体，然后利用全不育系与恢复系杂交生产杂交种(参见图1)。目前由该系统选育的三个国审双低杂交油菜品种“沪油杂1号”、“向农03”和“沪油杂4号”正在生产上大面积的推广，说明该不育系统具有广阔的应用前景与生产利用价值。
但是由于临保系是受到三对隐性基因控制(aabbrfrf)，且表现可育，没有可以用于选择的表现性状，因此需要广泛的测交，因其受三对隐性基因控制，分离群体大，基因型多且复杂，导致测交与测交种鉴定的工作量大，选育周期长，选育难度很大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育临保系的方法，通过甘蓝型油菜小孢子培养技术，寻找一种简单、可行、高效技术，能够快速获得受三对隐性基因控制(aabbrfrf)且遗传背景纯合的临保系，并在甘蓝型油菜隐性核不育杂交育种中得到有效应用。
为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案来实现 一种利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育临保系的方法，首先以优良的品种/系为母本，以隐性核不育临保系为父本杂交，获得F1代；然后以甘蓝型油菜小孢子培养技术对F1代植株的游离小孢子进行诱导培养而获得DH株系；再以该DH株系自交并与不育系测交，测交种为100％不育，对应的DH单株即为本发明所述的隐性核不育临保系(参见图2)。
所述方法具体包括以下步骤 a、以F1代植株为供体，在花蕾期，每次从油菜花序上取3～4mm大小的蕾，表面消毒后用无菌水清洗3次；加入B5培养液研磨，用40μm尼龙网过滤，滤液经过100g离心5-8min，吸去上清液后，再向离心管中加含秋水仙碱的NLN-16培养液密封，置于32℃的恒温箱中暗培养48h，然后重复上述步骤离心，吸去上清液，加入NLN-13培养液分装到培养皿中，密封，置于25℃的恒温箱中暗培养，当肉眼可见到胚状体后转到摇床上继续培养1-2周。
b、将上述a步中的胚状体转移到固体B5培养基上，在10℃的光照培养室中培养、诱导形成小植株，并将每个不同基因型的小植株扩繁多个拷贝，以保证每个基因型都能存活(参见图3)。
c、将上述b步中的小植株分不同基因型种植到田间，到花期，将加倍成功的可育二倍体DH株系套袋自交，并与隐性核不育纯合两型系中的不育株测交。
d、将上述c步中测交种进行鉴定，若测交种为全部不育，则对应的单株即为本发明的隐性核不育临保系，命名为临保系M-6477。
所述F1代是以优良的品种/系为母本，以隐性核不育临保系为父本杂交而成。
所述优良的品种/系母本为沪油15，系上海市农业科学院孙超才研究员选育而成，是上海市第一个通过国家品种审定和获得国家植物新品种保护的甘蓝型双低油菜品种，被国家科技部和农业部列为国家级成果重点推广品种之一，含油率为42.43％，芥酸含量为0.38％，硫苷含量为19.01μmol/g，农艺性状优良。
所述隐性核不育临保系为临保系M-6029，基因型为aabbrfrf，可育，与隐性核不育20118A(aabbRfRf)杂交，其后代基因型为aabbRfrf，仍为不育，但是该不育性只能保持一代，其后代会发生育性分离，故称基因型aabbrfrf的M-6029为甘蓝型油菜隐性核不育20118A的临保系，系上海市农业科学院孙超才于1999年在隐性核不育20118A的测交组合中通过连续的自交，测交选育而成。
所述隐性核不育纯合两型系为20118AB，系上海市农业科学院孙超才研究员于1993年在油菜花粉培养后代中发现的甘蓝型油菜隐性核不育20118A，然后20118A与花粉培养后代中的可育株杂交，并连续兄妹交，于1998年而获得的双低甘蓝型油菜隐性不育纯合两型系20118AB，其芥酸含量为0.56％，硫甙含量为23.45μmol/g。
利用上述隐性核不育纯合两型系20118AB中的不育株对DH株系进行基因型鉴定。
其中，上述方法中所用到的B5培养液为B5基本组份+130g蔗糖/L；固体B5培养基为B5基本组份+25g蔗糖+7g琼脂粉/L；NLN-13培养液为NLN基本组份+130g蔗糖/L；NLN-16培养液为NLN基本组份+160g蔗糖+100mg秋水仙素/L。B5基本组份和NLN基本组份的配方如下表1所示。
表1 B5基本组份和NLN基本组份的配方(mg/L)
本发明与原有隐性核不育临保系的选育相比具有以下优势 1.与原有隐性核不育临保系的选育相比效率更高从原有的以优良的品种(系)为母本，以隐性核不育临保系为父本杂交，获得F1代，基因型为AaBbRfrf，利用常规的育种方法自交，从F2代植株中获得可育的三隐性纯合临保系的概率为1/61(参见表2)，而利用甘蓝型油菜小孢子技术选育临保系，其DH后代实际上为雄配子基因型，8种雄配子基因型的双二倍体中，有一个表现为不育，故临保系的出现频率为1/7，因此临保系的出现频率大大提高。
表2 F1自交后代的表现型
2.与原有隐性核不育临保系的选育相比工作量大大降低，因利用甘蓝型油菜小孢子培养技术获得的DH系后代中，出现三隐性纯合临保系的频率为1/7，而常规的选育方法为1/61，所以导致测交与自交的数量大为降低，后代的鉴定工作也大大减少。
3.与原有隐性核不育临保系的选育相比缩短了育种周期，利用甘蓝型油菜小孢子培养获得的DH临保系，因其为单倍体直接加倍而成的，遗传背景完全纯合，故可以直接利用该DH临保系进行油菜杂交育种。利用原有的常规方法选育隐性核不育临保系，需要5-8代自交和测交，才能使临保系的基因型完全纯合，因此，相对传统的选育方法，其育种周期大为缩短。
图1为隐性核不育杂交种的生产模式。
图2为本发明的甘蓝型油菜小孢子培养选育临保系的示意图。
图3为本发明从小孢子到发育成植株的全过程，其中a为小孢子，b为胚状体，c诱导成苗，d小植株。
具体实施例方式 以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
实施例1 F1的配置 临保系M-6029，其基因型为aabbrfrf，是隐性核不育20118A的临保系，系上海市农业科学院孙超才研究员于1999年在隐性核不育20118A的测交组合中通过连续的自交，测交选育而成，芥酸含量为0.89％，硫苷含量为25.36μmol/g，农艺性状优良，一般配合力与特殊配合力高。
沪油15，系上海市农业科学院孙超才研究员选育而成，是上海市第一个通过国家品种审定和获得国家植物新品种保护的甘蓝型双低油菜品种，被国家科技部和农业部列为国家级成果重点推广品种之一，含油率为42.43％，芥酸含量为0.38％，硫苷含量为19.01μmol/g，农艺性状优良。
以上述沪油15为母本，临保系M-6029为父本杂交获得F1代种子。
实施例2 临保系M-6477的选育 1.供体F1材料的小孢子培养 在2005年3月油菜花期，对供体材料F1(沪油15×临保系M-6029)进行小孢子培养，共获得了379个胚状体，经过诱导培养获得了282个单株，其中加倍植株为76个DH株系，通过测交鉴定，发现有8个DH株系的基因型为aabbrfrf。
2.临保系M-6477的鉴定 将以上8个基因型为aabbrfrf的DH株系，进行农艺性状和品质性状检测，得到了一个农艺性状好，品质性状好，且含油量≥45％的DH株系，将其命名为临保系M-6477。
3.利用临保系M-6477配置杂交种的区试表现 上海市农业科学院2008年利用上述临保系M-6477配置了杂交组合“沪油杂8号”，杂交后代在2008～2009年度在上海市油菜区试中平均亩产193.50公斤，比对照增产20.5％；芥酸含量为0.01％，硫苷含量18.69μmol/g左右，含油量50.12％。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
权利要求
1.一种利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育临保系的方法，其特征在于，包括以下步骤a、以F1代植株为供体，在花蕾期，每次从油菜花序上取3～4mm大小的蕾，表面消毒后用无菌水清洗3次；加入B5培养液研磨，用40μm尼龙网过滤，滤液经过100g离心5-8min，吸去上清液后，再向离心管中加含秋水仙碱的NLN-16培养液密封，置于32℃的恒温箱中暗培养48h，然后重复上述步骤离心，吸去上清液，加入NLN-13培养液分装到培养皿中，密封，置于25℃的恒温箱中暗培养，当肉眼可见到胚状体后转到摇床上继续培养1-2周；
b、将上述a步中的胚状体转移到固体B5培养基上，在10℃的光照培养室中培养、诱导形成小植株，并将每个不同基因型的小植株扩繁多个拷贝；
c、将上述b步中的小植株分不同基因型种植到田间，到花期，将加倍成功的可育二倍体DH株系套袋自交，并与隐性核不育纯合两型系中的不育株测交；
d、将上述c步中测交种进行鉴定，若测交种为全部不育，则对应的单株即为本发明所述的隐性核不育临保系。
2.根据权利要求1所述的利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育临保系的方法，其特征在于，所述F1代是以优良的品种/系为母本，以隐性核不育临保系为父本杂交而成。
3.根据权利要求2所述的利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育临保系的方法，其特征在于，所述优良的品种/系母本为沪油15。
4.根据权利要求2所述的利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育临保系的方法，其特征在于，所述隐性核不育临保系为临保系M-6029，基因型为aabbrfrf，可育。
5.根据权利要求1所述的利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育近临保系的方法，其特征在于，所述隐性核不育纯合两型系为20118AB。
6.根据权利要求5所述的利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育临保系的方法，其特征在于，利用隐性核不育纯合两型系20118AB中的不育株对DH株系进行基因型鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种利用甘蓝型油菜小孢子培养技术选育隐性核不育临保系的方法，以优良的品种/系为母本，以隐性核不育临保系为父本杂交，获得F1代；然后以甘蓝型油菜小孢子培养技术对F1代植株的游离小孢子进行诱导培养，从而获得DH株系；再以DH株系自交并与不育系测交，测交种为100％不育，对应的DH单株即为本发明所述的隐性核不育临保系。通过本发明可以快速获得遗传背景稳定的优良临保系并在甘蓝型油菜隐性核不育杂交育种上得到应用。
文档编号A01H4/00GK101766118SQ20101010448
公开日2010年7月7日 申请日期2010年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者杨立勇, 孙超才, 王伟荣, 周熙荣, 张智奇, 周音, 李延莉, 蒋美艳, 庄静, 顾龙弟 申请人:上海市农业科学院