专利名称：与植物缺铁相关的cDNA序列及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与植物矿质营养相关的cDNA序列及其编码蛋白，尤其涉及一种 与玉米缺铁相关的cDNA序列及其编码蛋白，本发明还涉及含有该cDNA序列的重组表达载 体以及该cDNA序列在提高植物抗缺铁胁迫的用途，属于植物基因工程领域。
背景技术：
铁是人们最早发现的微量元素，发现至今已有两千多年的历史。铁在地球上现存 的原核生物和真核生物的生命活动中具有不可替代的功能。植物中铁的研究可追溯至一个 半世纪以前的1843年，Gris发现生长在石灰性土壤上的葡萄叶片失绿症与缺铁有关。后 经植物学家Sachs和Molisch研究，将其确定为植物生长的必需微量元素，同时铁也是最早 发现的植物必需营养元素。植物需要10_7-10_4mol/L的铁才能达到最佳的生长状态，但在中 性或石灰质土壤中，可溶性铁的浓度低于lCTVol/L。铁位居植物必需微量元素的首位，轻 度缺铁会导致叶绿素合成减少，光合速率降低，严重缺铁时，叶绿素合成停止，新叶变黄。植 物缺铁不仅影响植物的生长发育，造成巨大的经济损失，而且也影响动物和人类食用铁的 吸收，从而导致贫血病的发生(Guerinot ML,et al. 1994)。植物缺铁失绿症是一个世界性 植物营养失调问题。在许多国家的干旱、半干旱地区的石灰性土壤上广泛存在着植物缺铁 问题，在盐碱土上植物也往往发生缺铁现象。据统计，全世界约有40%的土壤缺铁。北美大 陆、地中海沿岸、前苏联南部、南美的部分地区都严重缺铁。我国南起四川盆地，北至内蒙古 高原，东至淮北平原，西到黄土高原及甘肃、青海、新疆等都有缺铁现象的发生。虽然土壤缺 铁只在一定类型的土壤和地区存在，但由于总面积较大，所以植物缺铁失绿成为全世界普 遍关注的问题，也是本世纪初以来植物营养学研究的热点之一。植物体内铁的含量一般为干重的0. 3%，铁是细胞色素的组分，是许多重要酶的辅 基。铁比较集中地分布在叶绿体内，Terry等报道叶片中60%的铁被固定在叶绿体的类囊 体膜上，20%在叶绿体基质中贮存，其余的20%则在叶绿体外。当植物受到缺铁胁迫时，叶 绿体基质中的铁大部分被再利用，类囊体膜上的铁和叶绿体外的结构铁分别损失51%和 62%，由此可见，叶绿体中铁的调控以及再利用与种子的铁含量息息相关。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种过量表达能够提高植物抗缺铁胁迫能力的cDNA ；本发明的目的之二是提供一种由该cDNA所编码的氨基酸；本发明的目的之三是一种含有所述cDNA的重组表达载体；本发明的目的之四是将所述cDNA应用于提高植物抗缺铁胁迫的性能；本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的本发明在缺铁胁迫的环境下从玉米根中分离、克隆到高表达的ZmFDR4基因，其核 苷酸序列为(a)SEQ ID NO :1所示；(b)在严谨条件下能与(a)所示的核苷酸序列的互补 序列杂交的核苷酸序列；
优选的，所述的ZmFDR4基因的核苷酸序列为SEQ ID NO 1所示；其中，所述的“严谨条件”是指杂交液为5 6XSSC，42 75°C杂交过夜，室温至 37°C用2 X SSC洗涤一至两次，优选的，所述的“严谨条件”为杂交液为6XSSC，68°C杂交过 夜，37°C用2XSSC洗涤两次。本发明还涉及可以在植物中高效表达所述cDNA(SEQ ID N0:1)的植物表达载体。将本发明cDNA序列插入到植物表达载体合适的限制性酶切位点之间，可操作的 与表达调控序列相连接，得到可以在植物中表达该cDNA序列的植物表达载体。例如，该植 物表达载体可以由5'非编码区，SEQ ID N0:1所示的cDNA序列和3'非编码区所组成，其 中，所述的5'非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启 动子序列可以是组成型、诱导型、组织或器官特异性诱导子。所述的3'非编码区可以包含 终止子序列、mRNA切割序列等。具体的，本发明公开了含有缺铁诱导玉米根中相关基因的植物穿梭表达载体 pBI121-ZmFDR4 和酵母穿梭表达载体 pYES2. 0_ZmFDR4。本发明还在真核细胞中表达了玉米ZmFDR4基因，获得了转运铁的转化宿主细胞， 尤其是转化的酵母菌株。本发明进一步包括玉米ZmFDR4基因的编码产物，该编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO 2 所示。本发明整体技术方案的详细描述本发明从一种缺铁诱导的玉米根中克隆了 ZmFDR基因的全长cDNA，并对其结构特 性和在酵母中的功能进行了分析。结构特性分析表明ZmFDR基因cDNA全长为3.3kb。经 ORF Finder分析发现其包含有两个大小分别为1068bp和648bp的开放阅读框，后者命名为 ZmFDR4(SEQ ID N0:1)。ZmFDR4编码的蛋白(SEQ ID NO :2)有4个跨膜结构域，并有信号 肽，属分泌性蛋白，它与III型分泌系统中FliP蛋白有相似的结构域。但经过广泛的同源 性比对，在高等植物中没有发现任何同源性序列。以酵母功能互补实验证明该cDNA在酵母 中的表达可以有效地转运铁。可以将本发明cDNA序列应用于提高植物抗缺铁胁迫的性能，例如，可将含有本发 明cDNA序列的植物表达载体导入到植物细胞中，培育筛选得到抗缺铁胁迫性能提高了的 转基因植株。
图1为ZmFDR4蛋白的疏水性分析。图2为ZmFDR4蛋白的PSI-Blast比对结果，具有III型分泌系统中FliP蛋白的 结构域。图3为表达ZmFDR4的酵母转化株的异源功能互补结果。图的上方标注了所用Fe2+ 和螯合剂BPDS的处理浓度，分别是5、10、15 μ M。图中每行的菌斑为同一种转基因型酵母 菌株，所转载体标注于图的左侧。各小图从左至右四个菌斑分别是按0. 10D_、0.010D_、 0. OOlOD600^O. OOOlOD600浓度的菌点板。30°C暗培养两天。蛋白有相似的结构域(见图2)。
具体实施例方式
可能是一种分泌途径中的膜蛋白。TMHMM预测ZmFDR4蛋白有4个跨膜域(见图1)，4 个跨膜螺旋所含的氨基酸数目为84个。它与III型分泌系统中FliP蛋白有相似的结构域 (见图2)。试验例1 玉米ZmFDR4基因的功能分析一、酵母表达载体的构建设计以下一对引物，在ZmFDR4 5，端和3，端分别引入Hind III和EcoR I酶切位点。c-myc 上游5，CGTAAGCTTATGGGGGGTTCTC 3，c-myc fdr4 下游5，TCAGAATTCTCACTTGTAGGTGGAG 3，以植物表达载体pBI121-ZmFDR4(pBI121购自Invitrogen)为模板进行PCR;分别 将PCR产物和酵母穿梭表达载体pYES2. O (购自Invitrogen)用Hin III和EcoR I双酶切， 并将酶切产物回收、连接，并转化大肠杆菌T0P10。经鉴定，得到含有ZmFDR4基因的酵母表 达载体。二、酵母的转化构建好的酵母穿梭表达载体pYES2. 0-ZmFDR4转化DEY1453(由David Eide教 授惠赠Department of Nutritional Sciences, University offfisconsin-Madison, USA) (ΜΑΤα/MAT2 ade2/+canl/canl his3/his3 Ieu2/leu2trpl/trpl ura3/ura3 fet3-2: : HIS3/fet3-2: : HIS3 fet4_l: : LUE2/fet4_l: : LUE2) (DEY1453 的构建方法见一)。 DEY1453为高亲和和低亲和铁转运体的双突变体。对照用水代替质粒。三、转化子的筛选在含有铁离子螯合剂，15μ M BPDS (Bathophenanthroline disulfonicacid 购自 Sigma公司)的完全极限培养基(即为YNB培养基(complete minimaldropout medium), 配制时，每IOOmL取酵母基本氮源(yeast nitrogen base,下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例一玉米ZmFDR全序列的克隆一、RNA 提取对铁敏感的玉米品种(Zea mays L cv掖单12)用0. 5% _1 % NaOCl表面消毒，然 后在27°C萌发36h。当根长Icm左右时，25°C下用没有铁素的液体(Hoagland培养液)培 养(-Fe培养)玉米ll-24d。当缺铁症状出现时，每日剪取根尖约2cm储存在-80°C备用， 建库时混合随机取样。同时对照玉米在正常含铁(浓度为lX10_4mol/L)的培养液(+Fe培 养)中生长。二、DNA文库的构建按ZAP Express cDNA Synthesis Kit 和 ZAP Express Cdna Gigapack GoldII Clong Kit说明书进行cDNA文库的构建。第一条链的合成用含Xho I位点的衔接物-引物 锚定5， GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3，在 RNase H 和polymerase I的催化下合成第二条链，双链cDNA的突出末端用pfu DNA聚合酶补平或填 充，随后EcoR I衔接物链接到平末端上。
三、差异筛选 铁正常⑴和铁缺乏㈠cDNA探针通过随机弓I物RT-PCR从⑴和㈠mRNA模板合 成。经原位噬菌斑杂交，反复筛选，最终获得ZmFDR克隆，经宝生物工程公司进行5’测序。四、mFDR4的序列分析测序结果表明ZmFDR为3. 3kb的cDNA，经ORF Finder分析发现其包含有两个大小 分别为1068bp和648bp的开放阅读框，后者命名为ZmFDR4 (SEQ IDNO 1)。ZmFDR4编码215 个氨基酸(SEQ ID NO :2)。其表达产物在高等植物中没有找到同源性序列。根据TargetP预 测结果ZmFDR4蛋白最可能定位在膜上，YNB，无氨基酸或硫酸铵)0. 67g，葡萄糖(Glucose， 配成40% detrose贮液单独灭菌，4°C保存)2g，省却营养物的氨基酸等混合物(缺尿嘧啶) (以母液形式配好)，琼脂(Bact0-agar)2g。)平板上进行转化子的筛选。四、异源互补功能验证DEY1453 (fet3fet4)是酵母铁吸收的低亲和系统FET4，以及高亲和系统FET3-FTR 的基因发生了突变，使得突变酵母在极限(缺铁)培养基中不能生长，但当外源相应基因 pYES-ZmFDR4转入并表达后可以弥补它们的功能，使得酵母能够生长。由图3可以看出在加铁条件下，转入pYES和转入pYES_ZmFDR4的酵母长势相似， 而且在不同铁浓度下，酵母的长势区别也不是很明显。在加有铁的螯合剂BPDS的培养基 上可以很明显地看到转入pYES-ZmFDR4的酵母要比转入空载体的酵母长得好，尤其是在 15 μ M浓度的条件下，即使铁含量很少，但酵母也恢复了生长。说明ZmFDR4能够有效转运 铁，恢复了酵母的生长。序列表<110>首都师范大学<120>与植物缺铁相关的cDNA序列及其编码蛋白和应用<130>KLPI08078<160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>648<212>DNA<213>Zea mays<400>1atgaacgccgcgcctgacgtcggttcgctgctggtcgccgcgctcgcgctggcggtcctg60
ccgttcgtggcgatggtggtcacgtcctacaccaagatcgtggtggtgctggtcctcctg120
cgcaacgcgctcgggctgcagggcgtcccgcccaactcggtcctgaacggcgtcgccctg180
atcgtgacgtgcttcgtgatggcgccggtcggcatggacgccatgcaccgcgcgcacctg240
ccgggcgaaaCggCggCCggggcccaggtcatgccgctgctcgacgccgggcgcgagccc300
ttccgggccttcctgaaggcccatgcgacggagcgcgagaaggccttcttcctgcgctcg360
gcgcgccagatctggccgccCgggCgCgCggccgaactcaaggaagacgacctgatcgtg420[0065ctggcgccgg cgttcatcct gagcgaactcacggccgccttcaagatcgg tttcctgctg480[0066tacctgtcgt tcatcgtgat cgacctcgtcgtcgcgaacgtgctgatcgc gctcggcctg540[0067tcgcaggtca gtccgacgaa cgtggcgattccgttcaagctgctgctgtc cgtctcgctc600[0068gacggctggt cgatgctggt ccacggcctg atctccacctacaagtga648[0069<210>2[0070<211>215[0071<212>PRT[0072<213>Zea mays[0073<400>2[0074MetAsnAlaAlaProAspValGlySerLeuLeuValAlaAlaLeuAla[0075151015[0076LeuAlaValLeuProPheValAlaMetValValThrSerTyrThrLys[0077202530[0078lieValValValLeuValLeuLeuArgAsnAlaLeuGlyLeuGlnGly[0079354045[0080ValProProAsnSerValLeuAsnGlyValAlaLeulieValThrCys[0081505560[0082PheValMetAlaProValGlyMetAspAlaMetHisArgAlaHisLeu[008365707580[0084ProGlyGluThrAlaAlaGlyAlaGlnValMetProLeuLeuAspAla[0085859095[0086GlyArgGluProPheArgAlaPheLeuLysAlaHisAlaThrGluArg[0087100105110[0088GluLysAlaPhePheLeuArgSerAlaArgGlnlieTrpProProGly[0089115120125[0090ArgAlaAlaGluLeuLysGluAspAspLeulieValLeuAlaProAla[0091130135140[0092PhelieLeuSerGluLeuThrAlaAlaPheLyslieGlyPheLeuLeu[0093145150155160[0094TyrLeuSerPhelieVallieAspLeuValValAlaAsnValLeulie[0095165170175[0096AlaLeuGlyLeuSerGlnValSerProThrAsnValAlalieProPhe[0097180185190[0098LysLeuLeuLeuSerValSerLeuAspGlyTrpSerMetLeuValHis[0099195200205[0100GlyLeulieSerThrTyrLys[010121021权利要求
一种从玉米(Zea mays)根中所分离、克隆的与植物缺铁相关的cDNA，其特征在于该cDNA序列为以下(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；或(b)在严谨杂交条件下能与(a)所示的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列。
2.按照权利要求1所述的cDNA，其特征在于该cDNA序列的核苷酸序列为SEQID NO 1所示。
3.由权利要求1或2所述cDNA编码的蛋白，其特征在于该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO 2 所示。
4.含有权利要求1或2所述cDNA的表达载体。
5.按照权利要求4所述的表达载体，其特征在于该表达载体是植物穿梭表达载体 pBI121-ZmFDR4或酵母穿梭表达载体pYES2. 0_ZmFDR4 ；其中，所述的ZmFDR4核苷酸序列为 SEQ ID NO 1 所示。
6.包含权利要求4或5所述表达载体的宿主细胞。
7.权利要求1或2所述cDNA在提高植物抗缺铁胁迫性能中的应用。
8.按照权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用包括构建含有权利要求1或 2所述cDNA的植物表达载体；将该植物表达载体转化到植物细胞中，使所述cDNA在植物中 表达。
全文摘要
本发明公开了与植物缺铁相关的cDNA序列及其编码蛋白和应用。本发明从缺铁诱导的玉米根中克隆了ZmFDR基因的全长cDNA，并对其结构特性和在酵母中的功能互补进行了分析。结构特性分析表明ZmFDR基因全长为3.3kb，其中包含有两个大小分别为1068bp和648bp的开放阅读框，后者命名为ZmFDR4(SEQ ID NO1)。其编码的蛋白(SEQ ID NO2)有4个跨膜结构域，并有信号肽，属分泌性蛋白，它与III型分泌系统中FliP蛋白有相似的结构域。但经过广泛的同源性比对，在高等植物中没有发现任何同源性序列。酵母功能互补实验证明该cDNA序列在酵母中的表达可有效地转运铁离子。
文档编号A01H5/00GK101892243SQ201010103650
公开日2010年11月24日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者关丽英, 刘祥林, 印莉萍, 宋秀芳, 张艳萍, 白彦霞, 闫佳洁, 霍春雁, 韩建辉, 马小娟 申请人:首都师范大学