专利名称：拟南芥基因iar1在铁营养利用及抗旱方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种拟南芥基因IAR1的应用，尤其涉及一种拟南芥基因IAR1在植物 铁营养利用及抗旱方面的应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
铁是人们最早发现的微量元素，发现至今已有两千多年的历史，铁在地球上现存 的原核生物和真核生物的生命活动中具有不可替代的功能，铁对于任何生物有机体来说都 是必不可少的矿质营养元素。植物轻度缺铁会导致叶绿素合成减少，光合速率降低，严重缺 铁时，叶绿素合成停止，新叶变黄，生物量大幅度下降。植物缺铁不仅影响植物的生长发育， 造成作物减产。植物是人和动物地铁营养的主要来源，植物缺铁可动物和人类对铁的吸收， 从而导致贫血病的发生。 尽管地壳中铁的丰度很高，但土壤中的铁由于受土壤溶液的pH值及氧分压的影 响，几乎都是以难溶于水的Fe3+形式存在，因此，如果没有主动的调节机制使植物获得充足 的铁，大多数植物便会表现出缺铁症状，造成农作物的减产，是限制农业生产。据统计，全世 界约有40%的土壤缺铁，北美大陆、地中海沿岸、前苏联南部、南美的部分地区都严重缺铁。 我国南起四川盆地，北至内蒙古高原，东至淮北平原，西到黄土高原及甘肃、青海、新疆，都 有缺铁现象的发生。虽然土壤缺铁只在一定的土类和地区存在，但由于总面积较大，所以植 物缺铁失绿成为全世界普遍关注的问题，也是植物营养学研究的热点之一。
研究表明，植物对铁离子的吸收通过以下两种方式完成对于双子叶植物和非禾 本科单子叶植物而言，缺铁会在根系产生多种生理及形态的变化，如根系Fe3+还原酶活性 的增加，净质子分泌量的增加，有机酸及酚类物质的分泌；以及产生根尖膨大、根毛增多、根 表产生转移细胞等，即所谓的机理I ;对于禾本科植物而言，根系对缺铁的反应为植物铁载 体(phytosiderophores)释放量的增加。植物铁载体对于根系铁的吸收和跨膜运输有不可 替代的作用，这一吸收过程被称为机理II 。 随着分子遗传学和功能基因组学技术的发展和进步，人们通过突变体的分析技术 分离得到了一系列与土壤铁离子吸收有关的基因，如从拟南芥中分离克隆了Fe"还原酶基 因(froh) 、Fe"螯合物还原酶的FR02基因、Fe"转运蛋白基因IRT1，从豌豆(Pisumsativum) 根中的Fe2+专一转运蛋白基因Ritl等，这些基因的表达产物，组成了一套铁离子还原和吸 收体系。 在供铁充足的条件下，机理I的植物首先通过Fe3+螯合物将溶解性的Fe3+螯合并 还原为Fe"，才能被吸收利用。在缺铁胁迫的条件下，土壤中溶解性的Fe3+很少，机理I植 物通过激活一种特异的H+-ATPas而使土壤酸化，从而增加铁的可溶性，才能够通过根部还 原酶将Fe"螯合和还原。因此，缺铁条件下，机理I植物吸收铁的一个前提条件是通过分泌 作用使土壤酸化，增加铁离子的溶解和吸收；因此，植物根际酸化能力对土壤铁营养的吸收 和利用起到十分关键的作用。虽然已有包括铁还原和运输有关的一批基因已经得到克隆和 功能验证，但是，直接参与调节缺铁引起的根际酸化的基因至今未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟南芥基因IAR1在植物铁营养利用及抗旱方面的应 用。 同时，本发明的目的还在于提供一种拟南芥基因IAR1在培育抗缺铁和抗旱植物 新品种方面的应用。 为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种拟南芥基因IARl在植物铁营 养利用及抗旱方面的应用。所述的基因IARl，其在Genebank中的编号为ATlG70690，该基因的CDS序列全长
为900bp，编码300个氨基酸的蛋白。 所述的基因参与H202相关植物缺铁反应过程。 所述基因的序列及其序列的全部或部分开放读码框ORF序列的不同应用载体。
同时，本发明的技术方案还采用了一种拟南芥基因IAR1在培育抗缺铁植物新品 种方面的应用。 所述的IAR1基因及该基因中的部分片断连接在有关表达载体，以及通过不同的 表达载体转化获得相关的转基因植物。 所述的IAR1基因的部分序列或功能区域片断构建RNAi抑制表达载体，获得相应 的转基因植物。 所述的基因由分析和寻找同源和同功能的基因及其相应载体的构建和转基因品 系的获得。 本发明通过用远红外成像技术，筛选得到了土壤取铁敏感拟南芥突变体iarl，克 隆得到了 IAR1基因(atlg70690)，采用GUS组织定位和GFP融合蛋白的细胞定位的方法，分 析IAR1基因的细胞和组织表达特性，构建由CaMV35S启动子控制的超表达IAR1转基因植 株，比较分析转基因植株的表型和IAR1基因可能的生物学功能，从分子水平上植物根际酸 化和植物抗缺铁反应的关系。 本发明从缺铁反应敏感拟南芥突变体中克隆坚定了一个可调节缺铁诱导土壤根 际酸化有关的IAR1基因(atlg70690)，为进一步分析和寻找同功能基因、构建相关基因的 转化载体和获得抗缺铁植物新品种提供了基础。本发明提供了通过转基因技术获得铁营养 高效利用植株，构建RNAi载体并获得相应的转基因植株，分析该转基因植株的高效利用土 壤铁营养的特性。IAR1基因编码一个受体激酶的受体区域，感受并调节植物的缺铁和反应。 IARl蛋白主要分布在维管系统和细胞膜上，感受土壤中铁的含量变化和调节根际酸化，影 响和调节植物的抗缺铁反应。 蛋白作用分析表明，IAR1可特异的与土壤中的铁离子结合，通过蛋白的氧化还原 状态，感知铁离子的含量变化，调节细胞质膜离子通道活性和离子跨膜运输，调节植物的抗 逆反应。 本发明揭示和分析IAR1基因及其编码的蛋白的功能，为分析和寻找与植物缺铁 胁迫相关的根际酸化调节基因和蛋白以及相应的同源基因和蛋白提供了手段和必要的基 础及前提，比如通过序列比对和结构分析等，同时可通过合成简并引物获得同功能基因等； 也可以通过化学合成的方法获得同功能基因和序列；通过突变的方法增加、减少、替换若干碱基和氨基酸等；以及依据以上手段获得相应的转化载体和获得相应的转基因植株等。
本发明通过特定的筛选条件分离得到了缺铁条件下调节拟南芥铁吸收有关的根 际酸化基因IAR1， IAR1基因的表达控制拟南芥根际酸化能力和植物对铁离子的吸收和利 用，影响植物抗缺铁反应和植物抗旱能力。IAR1基因的功能和作用的分析，为获得转基因铁 高效作物新品系，提高植物的抗旱反应提供了基础和前提。
图1为干旱条件下筛选得到的拟南芥叶片温度升高突变体iarl (箭头指示为筛选 得到的iarl突变体)； 图2为缺铁条件下，用雌二醇诱导IAR1诱导表达可抑制突变体根的生长；增加拟 南芥根的缺铁敏感特性(右图为根生长统计结果)； 图3为缺铁条件下，诱导IAR1基因的表达，增加拟南芥突变体生长，引起叶片失绿 和黄化的缺铁敏感特性； 图4为缺铁条件下诱导IAR1基因表达植株丧失根际酸化能力(A处表示酸化程 度)； 图5为IRA1基因表达可抑制区铁敏感酵母突变体菌斑Frel、 Ftrl、 Fet3、 Fet4、 Fre2的酸化能力(B处表示酸化程度)。
具体实施方式
实施例1 IAR1突变体的筛选、鉴定以及相关植株对铁营养的利用和抗旱反应 采用远红外成像技术，在干旱条件先筛选得到拟南芥叶片温度较高的拟南芥突变
体iarl，克隆得到突变基因IARl为编号为ATlG70690 ;诱导该基因的过量表达，缺铁培养基
可抑制相应的拟南芥植株根生长受抑制，同时引起植株叶片失绿和黄化的明显缺铁症状。
利用原子吸收方法测定缺铁诱导条件下，可引起IAR1超表达植株对铁离子积累量的减少，
引起植物明显的缺铁症状，H202存在条件下。(见图1) 实施例2 IAR1对缺铁诱导的根际酸化作用分析 通过构建pCAMBIA1205互补载体获得的超表达植株，结合T-DAN插入突变和诱导
IAR1超表达植株分析表明，超表达植株在缺铁培养基上表现出比野生形拟南芥更敏感的缺
铁症状，pH显色剂指示培养基显色表明，超表达植株缺乏铁诱导的拟南芥根际酸化能力，表
明IAR1可能通过调节拟南芥根际酸化调节植物的铁营养的利用。 实施例3 基因的表达及定位分析 通过培养基缺磷、缺锌、缺铜、缺钙、缺锰等分析表明，IAR1基因对缺铁具有转移的 反应特性；通过半定量PCR分析表明，IAR1基因的表达可被培养基缺铁所抑制，调节植物的 缺铁诱导的根际酸化反应；通过PCR扩增IAR1基因的启动子并构建相应的GUS载体获得相 应的转基因植株分析表明，IAR1基因主要在拟南芥的根部和叶片的维管表达。
实施例4
酵母表达试验IAR1基因功能分析 选用酵母表达体系，pYES2-IARl酵母表达载体。把基因转到突变体和野生型酵母 中，其中以转空载体的为对照。4天后看突变酵母的生长情况。图5所示，从上到下的酵母菌 株分别是Frel、Ftrl、Fetl、Fet2、Fre2的突变体和WT。结果是点在YPD加半乳糖诱导目的 基因表达的固体培养基中，转pYES2-IARl和转pYES2空载体对酵母的表型基本没有差异。 点在YPD加8mMBPDS和半乳糖固体培养基中，转pYES2-IARl在Frel、 Fet2和WT中酵母颜 色变红，转PYES2空载体到Frel和Fet2突变酵母中没有此表型，转pYES2-IARl和转pYES2 空载体到酵母Ftrl、 Fetl、 Fre2、中基本没有差异，也没有酵母株变红的表型，表明IAR1可 能与植物高亲和性铁利用有关。同时利用PH显色剂指示培养基显色表明，转pYES2-IARl 表达载体的酵母菌株可以抑制酵母菌斑的酸化能力。
实施例5 蛋白的原核表达及其表达蛋白的铁离子结合分析 为研究IAR1基因的表达蛋白和可能的蛋白的相互作用，先构建pGEX-2TK-At218 载体，转化到大肠杆菌中诱导融合蛋白的表达，获得GST-IAR1融合蛋白；通过微量热滴定 ITC和荧光淬灭滴定技术分析表明，原核表达IAR1蛋白可以和铁离子结合引起蛋白的熵和 蛋白微结构的变化，感受培养基的铁离子浓度的变化。
权利要求
一种拟南芥基因IAR1在铁营养利用及抗旱方面的应用。
2. 根据权利要求1所述的拟南芥基因IAR1在铁营养利用及抗旱方面的应用，其特征 在于所述的基因IARl，其在Genebank中的编号为ATlG70690，该基因的CDS序列全长为 900bp，编码300个氨基酸的蛋白。
3. 根据权利要求1拟南芥基因IAR1在铁营养利用及抗旱方面的应用，其特征在于所 述的基因参与H202相关植物缺铁反应过程。
4. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于含有所述基因的序列及其序列的全部或 部分开放读码框ORF序列的不同应用载体。
5. —种拟南芥基因IARl在培育抗干旱和缺铁植物新品种方面的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的IARl基因及该基因中的部分片断 连接在有关表达载体，以及通过不同的表达载体转化获得相关的转基因植物。
7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的IAR1基因的部分序列或功能区域 片断构建RNAi抑制表达载体，获得相应的转基因植物。
8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的基因由分析和寻找同源和同功能 的基因及其相应载体的构建和转基因品系的获得。
全文摘要
本发明涉及一种拟南芥基因IAR1在铁营养利用及抗旱方面的应用。本发明的缺铁条件下调节拟南芥铁吸收有关的根际酸化基因IAR1，IAR1基因的表达控制拟南芥根际酸化能力和植物对铁离子的吸收和利用，影响植物抗缺铁反应和植物抗旱能力。IAR1基因的功能和作用的分析，为获得转基因铁高效作物新品系，提高植物的抗旱反应提供了基础和前提。
文档编号A01H5/00GK101781660SQ200910064139
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月21日 优先权日2009年1月21日
发明者丁鹏, 刘浩, 安国勇, 宋纯鹏, 张霖, 王棚涛, 王红霞, 赵孝亮 申请人:河南大学