专利名称：一种抗旱相关基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一种抗旱相关基因及其编码蛋白与应用，特别涉及拟南芥的一种抗旱相关基因及其编码蛋白与应用。
背景技术：
粮食问题是当今世界所面临的几大难题之一。通过提高单产或扩大种植面积、增加农业投入改造中低产田等途径来增加粮食产量都会遇到需要克服逆境限制或减轻逆境危害的问题。因此，认识植物对逆境的反应机制，提高植物的抗逆性，已成为农业进一步增产的重要基础研究，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。
随着人类的经济发展和人口膨胀，水资源短缺现象日趋严重，直接导致了干旱地区的扩大与干旱化程度的加重，干旱化趋势已成为全球关注的问题。面对日益严重的全球干旱化趋势，寻求植物特别是农作物抗旱途径是十分必要的。
拟南芥是一种典型的模式植物，其作用与实验鼠相当，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥的大多数基因在其他植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其他植物研究，专家指出，对拟南芥的研究将帮助科学家找到提高农作物产量的方法。
拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.5万个基因。目前大部分基因的功能还不知道，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效方法。对双子叶植物(主要是拟南芥)而言，T-DNA插入突变是主要途径，并且已经得到大量T-DNA插入突变体。通过对突变体的研究，获知了一些逆境基因的功能，如AB13(增加抗冻性)Steponkus，1998)，COR15a(冷诱导基因)(Steponkus，1998)，CBF(耐冷性)(Jaglo-Ottosen，1998)，DREB(增加抗早、抗冷、抗盐性)(Kasuga，1999)，Apx1(耐热性)(Shi，2001)，AtNHX1(耐钾盐)(Yokoi，2002)等。
目前，还未找到有效的抗旱基因，面对日益严重的干旱问题，抗旱基因及抗旱相关基因的寻求势在必行。
发明创造内容本发明的目的是提供一种抗旱相关基因及其编码蛋白。
本发明所提供的抗旱相关基因，名称为ADT(Arabidopsis Drought Tolerance)，来源于哥伦比亚生态型的拟南芥(Columbia)，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1164个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1到第1164位碱基，不含内含子。
拟南芥抗旱相关基因ADT编码蛋白ADT，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQID №2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由387个氨基酸残基组成的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的ADT基因的antisense导入植物细胞，或者在其他植物中找到与ADT同源的基因然后敲除掉，或者通过RNAi的方法将ADT基因保持沉默，植物就表现为抗旱。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。本发明的基因可广泛用于培育抗旱植物品种。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
图1为ADT的荧光实时定量PCR(Real-Time PCR)直方2为野生型和突变体S29的RT-PCR电泳图谱图3为野生型和突变体S29的Southern分析结果电泳图谱图4为野生型和突变体S29的Northern分析结果电泳图谱图5a为野生型和突变体S29的离体叶片照片图5b为野生型和突变体S29在MS+2.5％甘油培养基中的照片图5c为野生型和突变体S29盆栽正常条件下的照片图5d为野生型和突变体S29盆栽干旱条件下的照片具体实施方式
实施例1、ADT的克隆把60个筛选后T-DNA插入的拟南芥突变体(有的为杂合体，有的为纯合体)和哥伦比亚野生型种子经过消毒，4℃春化三天后播种于土壤(营养土与跖石以1∶1比例混合均匀)中。在温度22℃、光照强度120umol/m2/s(光暗周期16h/8h)、相对湿度保持在60％-70％(幼苗时期保持80-90％的相对湿度)的条件下培养，期间一直用PEG+B5营养液浇，四周后观察表型。结果发现，突变体S29和野生型相比，表现为抗旱。把突变体S29相对应的基因进一步验证(Real-Time PCR、RT-PCR、Southern、Northern、表型观察)，最后命名为ADT。
实施例2、ADT的表达分析一荧光实时定量PCR(Real-Time PCR)实施例中所用的拟南芥材料是在培养基MS+0，MS+3.0％PEG，MS+3.5％PEG，MS+4.0％PEG上生长四周的幼苗各100-200mg(PEG-6000作为渗透胁迫剂，可人为造成干旱环境)(Plant Physiol，1973)，用Plant RNeasy试剂盒(QIAGEN)提取总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。使用TaqMan Reverse TranscriptionRegents试剂盒(Applied Biosystems)进行反转录，所得到cDNA样品分别稀释为1，0.5，和0.1ng/μl三个浓度梯度，各取一微升样品进行检测，在实验中每个浓度设三次重复。基因特异引物的设计使用PRIMEREXPRESS软件(Applied Biosystems)。PCR反应及其检测分别使用SYBR Green Master mix和ABI 7900序列检测系统(Applied Biosystems)。数据的处理采用Comparative CT方法(User Bulletin #2，ABI PRISM 7700序列检测系统)。以18S rRNA作为内对照对数据进行归一化。
结果如图1所示，从图中可以看出，随着PEG浓度增高，ADT的表达逐渐降低，和对照相比分别降低2.52倍、9.81倍、22.07倍和43.44倍，说明ADT是一种抑制基因。
实施例3、ADT和突变体的RT-PCR1)突变体S29的制备按照常规方法，通过T-DNA插入野生型拟南芥ADT基因后，得到的纯合突变体拟南芥的名称为S29。
2)野生型和突变体S29的RT-PCR以野生型拟南芥和突变体S29拟南芥两个品种在MS培养基生长四周的幼苗各100-200mg为材料，如实施例1分别提取拟南芥的总RNA。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。ss cDNA(single strand cDNA，单链cDNA)的合成按照SMARTTMPCR cDNA Library Construction Kit(CLONTECH)的方法，合成单链(single strand)cDNA。
将合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板20μl体系，内含10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTP mix 1.6μl，5μM的引物1和引物2各1.0μl，TAQ酶(15U/μl)0.1μl。在PE9600或9700或MJ PCR仪上扩增94℃预变性3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，共计34个循环；72℃延伸10min，将获得的PCR产物，作1％琼脂糖凝胶电泳。引物15’acc-cta-ttc-ttc-ata-tcg-ttc-c3’，引物25’agg-gtt-aca-tat-cgc-cga-gac 3’。结果如图2所示，表明ADT基因在野生型中表达，大小为496bp，而突变体S29中不表达，图2中，“+”表示加反转录酶，“-”表示不加反转录酶。
实施例4、野生型和突变体S29的Southern分析结果野生型拟南芥和突变体S29拟南芥基因组DNA的提取按Paterson et al(1993)的方法进行。取1μg基因组DNA，分别用BamHI和HindIII(Takara产品)酶切。酶切产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳(30-50V，O/N)分离，然后用常规方法在摇床上处理电泳胶经0.125N HCl浸洗15min，变性液(1.5M NaCl，0.5N NaOH)浸洗30min，中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH 7.2)浸洗30min。最后用20×SSC将DNA印迹到HybondN+尼龙膜上。
预杂交、杂交均按常规方法进行(金冬燕等，1996；Hybond N+mannual，Amersham)。
探针及其标记杂交探针为NPTII，其中引物15’ggg-cgc-ccg-gtt-ctt-ttt-g 3’，引物25’aca-ccc-agc-cgg-cca-cag-tcg，3’。用Promega公司的Primer-a-Gene试剂盒进行标记过夜。杂交前用Qiagen公司的PCR纯化试剂盒进行探针纯化。
洗膜用高严紧方法进行(Hybond N+mannual，Amersham)2×SSC，0.1％SDS，15min；1×SSC，0.1％SDS，65℃，15min；2×SSC，0.1％SDS，65℃，15min。
保鲜膜包裹杂交膜，-70℃下对X光片曝光。
结果如图3所示，从图中可以看出，该基因在BamHI的酶切泳道中杂交到一条约20kb带；在HindIII的酶切泳道中杂交到一条约3.3kb带；可以确定，T-DNA是以单拷贝的形式插入基因组的ADT基因后形成的突变体S29。
实施例5、野生型拟南芥和突变体S29拟南芥的Northern分析结果实施例中所用的拟南芥材料是在培养基MS+0，MS+3％PEG，MS+3.5％PEG(PEG-6000作为渗透胁迫剂，可人为造成干旱环境)中，生长四周的幼苗各100-200mg，用PlantRNeasy试剂盒(QIAGEN)提取总RNA，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性后，用紫外分光光度计和电泳方法相结合作精确定量。调整各样品上样量均为20μg，然后进行1.2％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。
甲醛变性胶的制作1.2％FA凝胶150ml是由1.5g琼脂糖加15ml10×FA凝胶缓冲液配置，在微波炉中熔化后，65℃水浴中冷却，再加2.7ml 37％的甲醛原液制成的。电泳前须在1×FA缓冲液中平衡至少30min。1×FA缓冲液600ml的配方为50ml 10×FA缓冲液、10ml 37％甲醛原液和440ml DEPC处理的SDW。上样时，每4份RNA样品加1份5×RNA上样缓冲液，混匀后65℃水浴中加热3-5min，冰浴冷却。5×RNA上样缓冲液10ml，内含16μl饱和溴酚蓝溶液、80μl 500mM EDTA pH8.0、720μl 37％甲醛原液、2ml甘油、3084μl甲酰胺和4ml10×FA缓冲液。
电泳结束后，切下分子标记泳道用EB染色，旁边放一荧光尺精确指示位置。样品部分的胶用DEPC处理的SDW摇床上浸洗30min，再用DEPC处理的10×SSC浸洗30min。然后将RNA用DEPC处理的20×SSC转至Hybond N+膜上，膜经预杂交，放射性探针杂交，高严紧性洗膜后，于-70℃下对X光片曝光。
探针为RD29A基因，该基因为胁迫基因，比如在干旱、高盐、寒冷等环境的胁迫下产生(Plant Journal，2003)。结果如图4所示，表明没有PEG胁迫的对照中，植株野生型拟南芥和突变体S29拟南芥中RD29A基因表达很少；3.0％PEG胁迫后，二者都表达但差异不明显；3.5％PEG胁迫后，突变体S29拟南芥中RD29A基因的表达量明显高于野生型。
实施例6、野生型拟南芥和突变体S29拟南芥的表型观察结果a、野生型拟南芥和突变体S29拟南芥离体叶片的观察结果离体叶片失水率与抗旱性是有关的。叶片失水率可作为植物抗旱鉴定快速、易行、简便的生理指标(赵微平1993，刘学义1995)。在失水率与抗旱性的研究中，发现第6h是失水率转折的关键时间，6h以前抗旱类型的失水率低于敏感类型，以后抗旱类型高于敏感类型，而且在不同抗旱类型或同一类型的不同生育时期所测结果均符合这个规律。结果如图5a所示，表明突变体S29拟南芥的抗旱性高于野生型。
b、野生型拟南芥和突变体S29拟南芥在MS+2.5％甘油培养基上的观察结果野生型拟南芥和突变体S29拟南芥种子在MS培养基上萌发并长成四叶期幼苗后，转移到MS+2.5％甘油培养基上(甘油可造成干旱环境)(Plant Physiol，2003)。结果如图5b所示，表明野生型拟南芥植株已经死亡，突变体S29拟南芥植株由于抗旱而正常生长。
c、野生型拟南芥和突变体S29拟南芥盆栽正常条件下的观察结果在正常条件下，抗旱品种和不抗旱品种比较，抗旱品种表现为晚花，生活周期长。结果如图5c所示，表明野生型拟南芥植株早已开花结子趋于死亡，突变体S29拟南芥植株由于抗旱而正常生长，和培养基上处理结果吻合。
d、野生型拟南芥和突变体S29拟南芥盆栽干旱条件下的观察结果结果如图5d所示，表明盆栽干旱试验的结果与植株离体叶片失水率、盆栽正常条件下的测定结果趋势完全相符。突变体S29拟南芥因失水率低、保水力强而叶片萎蔫出现得晚，受害轻。
序列表<160>2<210>1<211>1164<212>DNA<213>拟南芥(Columbia)<400>1atgaaatcac ggcgacagaa tgtgtccgtg gctcgacaaa ccatccttgg acgcgacgaa 60aactttgaac caatcccaat tgatctcgtt atcgagatat tctcaaggtc gcctgtgaag 120tctatagcaa gatgtcgttg cgtatcaaag ctttgggcct ccatactccg cctaccctat 180ttcacggagt tgtacttgac caaatcttgt gctcgcccga ggctcttgtt cgcctgccaa 240aaacacagag agttgttctt cttctcgaca cctcagcctc ataatcctaa tgagagctcg 300tctcctttag ctgccagttt tcatatgaaa attccctttg atggtcgctt taatattatc 360agtcctatcg gtggccttgt ctttgttaga tatgaacaga tcttaaaggg aaggaaaact 420ccagaatttg tctcggcgat atgtaaccct agcacgggac aatccttaac cttaccaaaa 480cctaagacaa ggaagaggat ttggggtaca agccattttg ggtatgatcc tattgagaaa 540caattcaagg tattgtcaat gaatataggt gatggggtct ataaagagca ttatgttctg 600acattaggaa ctgagaacct ctcttggaga aggatcgaat gttctatacc ccatgttcat 660ggttctaaag ggatatgcat caatggtgtt ttgtattatc gagcaaaggc tgacatgttt 720tcaggtactt taatgatagt ttgctttgat gttaggtttg agaagttcag ctatattaaa 780atcttgaaac ctacaacaac tctgattagc tacaacggta aattggcttc actagtgtgg 840gaagggccta gttatatttg tggaaaacgt tttgaaatgt gggttttagg agaccccgaa 900aaacatgaat ggttgaagca tacttacgaa ttgcgtcctc ggtggcagaa tgtacttgga 960gaggacttgt taatttttgc tggaatgact ggtacaaatg aaattgtgtt gtcgccaaag1020tatccatctc accctttcta tgttttctac tacaatttgg agaggaatac tatcagaaga1080gttgaaatcc aaggaatggg agcgtttaag gttaatgaag attacatctt tctagaccat1140gtagaggatg tgaagcttat ataa 1164<210>1<211>387<212>PRT<213>拟南芥(Columbia)
<400>1Met Lys Ser Arg Arg Gln Asn Val Ser Val Ala Arg Gln Thr Ile1 5 10 15Leu Gly Arg Asp Glu Asn Phe Glu Pro Ile Pro Ile Asp Leu Val20 25 30Ile Glu Ile Phe Ser Arg Ser Pro Val Lys Ser Ile Ala Arg Cys35 40 45Arg Cys Val Ser Lys Leu Trp Ala Ser Ile Leu Arg Leu Pro Tyr50 55 60Phe Thr Glu Leu Tyr Leu Thr Lys Ser Cys Ala Arg Pro Arg Leu65 70 75Leu Phe Ala Cys Gln Lys His Arg Glu Leu Phe Phe Phe Ser Thr80 85 90Pro Gln Pro His Asn Pro Asn Glu Ser Ser Ser Pro Leu Ala Ala95 100 105Ser Phe His Met Lys Ile Pro Phe Asp Gly Arg Phe Asn Ile Ile110 115 120Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Phe Val Arg Tyr Glu Gln Ile Leu125 130 135Lys Gly Arg Lys Thr Pro Glu Phe Val Ser Ala Ile Cys Asn Pro140 145 150Ser Thr Gly Gln Ser Leu Thr Leu Pro Lys Pro Lys Thr Arg Lys155 160 165Arg Ile Trp Gly Thr Ser His Phe Gly Tyr Asp Pro Ile Glu Lys170 175 180Gln Phe Lys Val Leu Ser Met Asn Ile Gly Asp Gly Val Tyr Lys185 190 195Glu His Tyr Val Leu Thr Leu Gly Thr Glu Asn Leu Ser Trp Arg200 205 210Arg Ile Glu Cys Ser Ile Pro His Val His Gly Ser Lys Gly Ile215 220 225Cys Ile Asn Gly Val Leu Tyr Tyr Arg Ala Lys Ala Asp Met Phe
230 235 240Ser Gly Thr Leu Met Ile Val Cys Phe Asp Val Arg Phe Glu Lys245 250 255Phe Ser Tyr Ile Lys Ile Leu Lys Pro Thr Thr Thr Leu Ile Ser260 265 270Tyr Asn Gly Lys Leu Ala Ser Leu Val Trp Glu Gly Pro Ser Tyr275 280 285Ile Cys Gly Lys Arg Phe Glu Met Trp Val Leu Gly Asp Pro Glu290 295 300Lys His Glu Trp Leu Lys His Thr Tyr Glu Leu Arg Pro Arg Trp305 310 315Gln Asn Val Leu Gly Glu Asp Leu Leu Ile Phe Ala Gly Met Thr320 325 330Gly Thr Asn Glu Ile Val Leu Ser Pro Lys Tyr Pro Ser His Pro335 340 345Phe Tyr Val Phe Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg Asn Thr Ile Arg Arg350 355 360Val Glu Ile Gln Gly Met Gly Ala Phe Lys Val Asn Glu Asp Tyr365 370 375Ile Phe Leu Asp His Val Glu Asp Val Lys Leu Ile380 385 38权利要求
1.一种拟南芥抗旱相关基因ADT，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于所述拟南芥抗旱相关基因ADT是序列表中SEQ ID №1。
3.拟南芥抗旱相关基因ADT编码蛋白ADT，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于所述拟南芥抗旱相关基因ADT编码蛋白ADT是序列表中SEQ ID №2。
5.含有权利要求1所述基因的表达载体。
6.含有权利要求1所述基因的细胞系。
7.权利要求1所述基因在培育抗旱植物品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种拟南芥抗旱相关基因及其编码蛋白与应用。本发明所提供的拟南芥抗旱相关基因ADT，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID№1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明所提供的拟南芥抗旱相关基因ADT编码蛋白ADT，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。本发明的基因可广泛用于培育抗旱植物品种。
文档编号C07K14/415GK1597949SQ03157198
公开日2005年3月23日 申请日期2003年9月18日 优先权日2003年9月18日
发明者张玉娥, 薛勇彪, 董丽, 王蕾, 武维华 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所