拟南芥质子泵基因AtNHX1提高植物根系吸钾能力的应用的制作方法

专利名称：拟南芥质子泵基因AtNHX1提高植物根系吸钾能力的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及拟南芥的质子泵基因AtNHX1提高植物根系吸钾能力的应用，属于植物分子生物学领域。
背景技术：
钾在烟株体内是多种酶的活化剂，细胞内有50多种酶或完全依赖于K+或受K+的激活，K+可调节植株的许多生理功能，如增强光合作用，增强植株体内物质合成和转运，提高植株抗性，维持细胞膨压，调节气孔的运动，提高CO2的同化率，促进光合作用和光合产物的运输，明显提高烟株体内糖的含量，糖含量的增加既能提高细胞的渗透势，增强抗旱能力，又能使冰点下降，减少霜冻危害，提高抗寒性。钾还对增强作物抗病虫能力也有明显作用，钾可使细胞壁增厚，提高细胞壁木质化程度，阻止或减少病原菌的入侵和昆虫的危害，同时增强植物根系的吸钾能力对于提高钾肥利用率具有重要意义。
钾含量是优质烟叶的指标之一，随着烟叶含钾量提高，烟气中烟草热分解产物种类和数量显著减少，致香物质增多，焦油等有害物质减少，从而降低了卷烟制品对人体健康的影响。调查资料表明不同产区烟叶含钾量差异直接反应了烟叶品质差异，美国烟叶的含钾量一般为4-5％，巴西为3-4％，而我国烟叶的平均含钾量为1-2％，很少超过2％。一般认为优质烤烟烟叶含钾量应大于2.5％，我国烟叶含钾量过低已成为制约我国烟草科技发展的技术难题。
H+-ATPase也称Na+-K+泵，其功能是把新陈代谢所产生的过剩H+泵出胞外，在维持细胞内H+浓度的同时，与通道蛋白协同作用维持细胞内高K+低Na+的内部环境，Nass等从酵母上分离到NHX1基因，证实该基因在液泡膜上编码H+-ATPase质子泵基因，Gaxiola等从拟南芥上克隆AtNHX1基因，向酵母营养缺陷性中导入AtNHX1基因可恢复其耐盐能力，Aspe等(1999)将带有强启动子的AtNHX1基因导如入拟南芥获得AtNHX1基因高度表达的转基因拟南芥，Zhang和Blumwald研究发现AtNEX1转化番茄可表现明显的抗盐性。
目前未有关于拟南芥质子泵基因AtNHX1提高植物根系吸钾能力的报道。

发明内容
本发明的首要目的是公开来自拟南芥的质子泵基因具有提高转化植物根系吸钾能力的功能。
本发明的第二个目的是提供进行拟南芥的质子泵基因转化的高效植物表达载体。
本发明的第三个目的是提供通过基因修饰手段(转拟南芥的质子泵基因AtNHX1)提高烟叶含钾量方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案拟南芥质子泵基因AtNHX1提高植物根系吸钾能力的应用。
本发明公开了拟南芥AtNHX1基因具有增强植株根系吸钾能力的功能，发现将该基因导入烟草可以显著提高转化烟草材料的烟叶含钾量，最高的烟草品系烟叶含钾量可提高到4.59％，而同品种未转化烟草烟叶含钾量仅为1.3％，增加幅度达到极显著，这一研究成果对于烟草行业提高烟叶品质、增加香气、降低焦油等有害物质具有重要意义。
一种进行拟南芥的质子泵基因转化的高效植物表达载体，它包含序列表SeQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明通过BamHI和SacI双酶切和T4连接酶将AtNHX1基因插入具有相同酶切位点的表达载体中，构建了植物表达双元载体pYF6588，该载体保留了双元载体的主要元件，包括来源于广宿主载体pVS1的复制区域(pVS1 rep)和复制稳定区域(pVS1 sta)以及T-DNA的左右边界序列。在新构建的载体上，外源基因表达单元附加了一个烟草染色质附着SAR序列，利于转基因的稳定遗传；用CaMV 35S+TMV Omega leader sequence控制带Catalase基因内含子的Km抗性基因的表达，作为转基因植物的筛选标记基因；用烟草的Ubi.U4基因启动子控制带Catalase基因内含子的GUS基因表达，作为报告基因，用带Ω翻译增强子的双CaMV 35S启动子和nos终止子控制AtNHX1基因的表达，增强了基因的表达效率。
一种提高植物根系吸钾能力、增加叶片含钾量的方法，包括1)构建AtNHX1植物表达载体，它包含序列表中SeQ ID No.1所示的核苷酸序列；2)将含AtNHX1基因的植物表达载体导入植物细胞；获得吸钾能力增强的转基因后代，包括植物各部分组织。
根据拟南芥AtNHX1基因结构区域，应用生物软件设计该基因阅读框序列引物，将拟南芥幼根总RNA反转录，并以反转录产物为模板，用PCR方法扩增得到约1700bp的特异片段，将片段切胶回收后插入测序载体，并进行序列分析，在GenBank网中查询与曾报道的拟南芥AtNHX1基因序列完全一致，通过BamHI和SacI双酶切、T4连接酶构建AtNHX1基因的植物表达载体，并通过农杆菌介导法对烟草进行遗传转化，获得了Km抗性转基因烟草26株(T0代)，经目的基因引物PCR和GUS染色检测阳性材料23株，对各转化材料的T1代烟叶含钾量检测结果表明，转化材料的烟叶含钾量显著提高。
本发明采用的提高植物吸钾能力的方法是把基因转化到植物细胞中，转化的植物细胞再生成小植株。
其中的植物可以是双子叶也可以是单子叶植物，但由于钾含量对烟叶香气和烟气中焦油含量关系密切，所以对烟草作为受体植物意义更大。其转化过程是通过根癌农杆菌介导，采用叶盘法进行。
本发明的优点是首次发现并公开了拟南芥的质子泵基因具有提高转化植物根系吸钾能力的功能，并提供了含有该基因的植物表达载体的构建方法和提高植物含钾量的方法。本发明能够有效解决我国烟叶含钾量过低这个制约我国烟草科技发展的技术难题。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作的本领域任何等同替换，均属于本发明的保护范围。


图1为植物表达载体pYF6588的构建方法图。
图2为AtNHX1基因表达载体pYF6588的结构图。
图3为AtNHX1基因表达载体的菌落PCR图。
图4为AtNHX1表达载体的酶切验证图。
图5为转基因烟草的GUS染色鉴定6为转AtNHX1基因烟草植株的PCR扩增图。
图7为转化材料幼根RNA反转录产物荧光定量PCR分析图。
图8为AtNHX1基因荧光定量PCR标准曲线图。
具体实施例方式
实施例涉及的材料及来源1.拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚种，由上海农科院提供；2.烟草(Nicotiana tabacum)品种龙烟911，K326由黑龙江烟草研究所提供；3.T/A克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司，pCAMBIA-1201质粒、DH5α大肠杆菌菌株由上海农科院保存，遗传转化用的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404购自美国Clontech公司。
4.总RNA提取试剂盒、T4 DNA连接酶、质粒纯化柱、逆转录试剂盒为Promega公司产品；限制性内切酶、Ex-taq耐高温DNA聚合酶、脱氧核糖核酸酶DNase I、荧光定量PCR试剂SYBRRT-PCR Kit购自TaKaRa公司，其它主要化学试剂为美国Sigma公司或国产AR级试剂。
实施例1设计AtNHX1基因相关引物1.用于扩增拟南芥的质子泵基因(AtNHX1)的引物序列上游5’-AAAGGATCCAACATGTTGGATTCTCTAGTGTCGAAAC-3’ SEQ ID No.3下游5’-AAAGAGCTCTCAAGCCTTACTAAGATCAGGAGGG-3’SEQ ID No.4引物5’端分别设计BamHI和SacI的酶切位点；2.用于转化材料PCR检测引物序列AtNHX1-Z5′-CGGTCTGATAAGTGCGTATG-3′SEQ ID No.5AtNHX1-F5′-GTTCTGGTGCGGTAATAGGT-3′SEQ ID No.6扩增片段长度为650bp；3.用于mRNA转化烟草的荧光定量PCR扩增引物AtNHX1-SA5′-CCTATTACCGCACCAGAACG-3′SEQ ID No.7AtNHX1-SB5′-GGTCGCATGAAGGAGTCATC-3′SEQ ID No.8实施例2拟南芥总RNA提取与纯化取拟南芥幼根1g加液氮在研钵中研碎成粉末状，放入1.5ml微量离心管中；用Promega总RNA提取试剂盒提取总RNA，按说明书操作，凝胶电泳判断所提取RNA质量。
实施例3AtNHX1基因的PCR合成以实施例2获得的拟南芥总RNA提取物为模板，用Oligo DT为引物反转录合成cDNA第一链。以反转录产物为模板，用拟南芥质子泵基因(AtNHX1)的阅读框的上游和下游引物， Ex-taq DNA聚合酶按常规反应条件进行PCR扩增。
实施例4扩增产物测序将PCR扩增产物与T-载体(pMD18-T)连接，转染大肠杆菌感受态，经蓝白斑筛选的转化子提取质粒进行酶切鉴定，并对酶切鉴定正确的片段进行核苷酸全序列测定，拟南芥的质子泵基因为SEQ ID No.1所示的碱基序列，其阅读框核苷酸序列长度为1617bp，其蛋白质一级结构如序列表中SeQ ID No.2所示的氨基酸序列，为538个氨基酸。
实施例5构建植物表达载体参阅图1和图2所示，通过BamHI和SacI双酶切，将AtNHX1基因从克隆载体pMD18-T上切下，利用T4连接酶插入具有相同酶切位点的pCAMBIA-1201载体中，构建AtNHX11基因的植物双元载体pYF6588。
实施例6农杆菌细胞的转化与鉴定取200μl感受态细胞于eppendorf管；加入10μg质粒DNA，混匀；冰浴30分钟，立即放入液氮中冰冻5分钟；立即放入37℃水浴5分钟；加入YEB培养基1mL，28℃，150rpm摇床培养2-3小时；在YEB固体培养基(kan 50mg/L，rif 50mg/L)涂板；28℃下暗培养2-3天；对单菌落进行菌落PCR扩增、将菌落PCR表现阳性的菌落转接到YEB液体培养基28℃振荡培养，提取质粒进行BamHI和SacI限制性内切酶酶切验证，结果见图3和图4。取酶切验证阳性的菌液700μl，加入等体积甘油，在-70℃长期保存。
实施例7农杆菌的活化挑取含外源基因插入的农杆菌单菌落于3ml YEP培养基中27℃培养到OD600≈0.9，500rpm离心5min，收集沉淀重悬在新鲜YEP中，继续培养到OD600≈0.5，然后进行植物转化和转基因植株筛选。
实施例8转化烟草采用叶盘法，取无菌苗叶片剪成约5mm×5mm的小块，置于50ml OD值0.3-0.5的农杆菌液中感染5-8min后取出，置于灭菌过的滤纸上吸干，放置在9cm培养皿的两层滤纸中间，滴入MSO液体培养基，保持湿润，22℃黑暗共培养3d后，转接到第一次筛选培养基(含6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Km 50mg/L+Cb 250mg/L)上光照培养20d，再转到第二次筛选培养基(含6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Km 100mg/L+Cb 250mg/L)上光照培养30d，取第二次筛选培养后抗性芽叶片少许，按Jefferson方法进行GUS染色鉴定，切下GUS染色阳性芽插入生根培养基(1/2MS+Km 25mg/L+Cb 25mg/L)上光照培养30d，即可生根形成阳性苗。自然光温下练苗3-5天移栽到育苗钵中，成活后移栽到温室中。
实施例9转基因烟草的GUS染色鉴定通过根癌农杆菌介导烟草品种K326 AtNHX1基因遗传转化，共获得Km抗性转基因烟草26株(T0代)，其中经目的基因引物PCR、Southern杂交、荧光定量PCR分析和GUS染色阳性材料23株(见图5)。
实施例10AtNHX1转基因烟草的PCR鉴定以抽提的GUS染色阳性的转基因烟草植株总DNA为模板，以AtNHX1Z和AtNHX1F为引物，通过PCR扩增检测转基因植株中的AtNHX1基因。PCR扩增条件94℃ 6min预变性后，94℃30s变性，62℃退火40s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃后终延伸10min，扩增产物的凝胶电泳结果如图6所示，其PCR片段与引物扩增DNA片段相吻合，证明外源基因被整合到烟草基因组中。PCR扩增的结果显示，45株GUS染色阳性烟草植株中DNA38株可扩增出650bp左右的特异性扩增片段，证明AtNHX1基因已成功导入烟草基因组中。
实施例11转化材料中AtNHX1基因的转录水平随机从PCR扩增和GUS染色阳性不同转化材料中取6个转化单株，将其烟苗幼根总RNA的反转录产物与拷贝数为105、104、103、102、101标准参比DNA和未转化DNA提取物同时进行荧光定量PCR扩增，扩增结果如图7所示。
根据标准参比DNAS1、S2、S3、S4、S5和S0所建立的Ct值与DNA拷贝数的标准曲线如图8所示，直线回归方程为Y＝-23X+8.56； 相关系数r2＝0.991，由此计算出各PCR反应液中所含目标序列的拷贝数，见表1。
表1各转化材料幼根mRNA水平

由表1数据可以看出，未转化对照没有出现荧光信号，导入的AtNHX1基因在6个转化烟草材料的T1代幼根中均有mRNA转录，且转化株2、4、3、6、1、5号之间mRNA转录水平差异不大，说明AtNHX1基因已在烟草基因组中成功转录。
实施例12烟叶含钾量的测定各T0代转化材料温室培养分别采种，将各材料的T1代种子育苗，移栽前分株取样提取DNA进行AtNHX1基因PCR检测，阳性烟苗移栽至隔离圃，并以同品种未转化烟草做对照，取样测定土壤肥力指标，确定施肥水平为氮(45kg/ha)、磷(90kg/ha)、钾(135kg/ha)，每小区30株，按小区采收，取第7-12片叶烘烤后，随机取中柠3等级样品应用Aliance流动分析仪进行烟叶内在成分化验分析，结果见表2。
表2烟叶含钾量的测定结果

由上表可以看出，与未转对照相比，AtNHX1基因的烟草转化材料的烟叶含钾量显著增加，增加幅度为67％。最高的NH02材料含钾量提高更为显著，比对照材料的平均值高100％。
序列表<110>黑龙江省烟草科学研究所<120>拟南芥质子泵基因AtNHX1提高植物根系吸钾能力的应用<130>
<160>8<170>Patentln version 3.3<210>1<211>1617<212>DNA<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atgttggatt ctctagtgtc gaaactgcct tcgttatcga catctgatca cgcttctgtg 60gttgcgttga atctctttgt tgcacttctt tgtgcttgta ttgttcttgg tcatcttttg120aaagagaata gatggatgaa cgaatccatc accgccttgt tgattgggct aggcactggt180gttaccattt tgttgattag taaaggaaaa agctcgcatc ttctcgtctt tagtgaagat240cttttct tcatatatctttt gccacccatt atattcaatg cagggtttca agtaaaaaag300aagcagtttt tccgcaattt cgtgactatt atgctttttg gtgctgttgg gactattatt360tcttgcacaa tcatatctct aggtgtaaca cagttcttta agaagttgga cattggaacc420tttgacttgg gtgattatct tgctattggt gccatatttg ctgcaacaga ttcagtatgt480acactgcagg ttctgaatca agacgagaca cctttgcttt acagtcttgt attcggagag540ggtgttgtga atgatgcaac gtcagttgtg gtcttcaacg cgattcagag ctttgatctc600acccacctaa accacgaagc tgcttttcat cttcttggaa acttcttgta tttgtttctc660ctaagtacct tgcttggtgc tgcaaccggt ctgataagtg cgtatgttat caagaagcta720tactttggaa ggcactcaac tgaccgagag gttgccct tatgatgcttat ggcgtatctt780tcttatatgc ttgctgagct tttcgacttg agcggtatcc tcactgtgtt tttctgtggt840attgtgatgt cccattacac atggcacaat gtaacggaga gctcaagaat aacaacaaag900catacctttg caactttgtc atttcttgcg gagacattta ttttcttgta tgttggaatg960
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<210>3<211>37<212>DNA<213>人工合成<400>3aaaggatcca acatgttgga ttctctagtg tcgaaac 37<210>4<211>34<212>DNA<213>人工合成<400>4aaagagct ctcaagccttac taagatcagg aggg 34<210>5<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>5cggtctgata agtgcgtatg 20<210>6<211>20<212>DNA
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权利要求
1.拟南芥质子泵基因AtNHX1提高植物根系吸钾能力的应用。
2.根据权利要求1所述的拟南芥质子泵基因AtNHX1提高植物根系吸钾能力的应用，其特征在于所述拟南芥质子泵基因AtNHX1具有序列表SeQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的拟南芥质子泵基因AtNHX1提高植物根系吸钾能力的应用，其特征在于所述拟南芥质子泵基因AtNHX1编码序列表SeQ ID No.2所示的氨基酸序列。
4.一种进行拟南芥的质子泵基因转化的高效植物表达载体，它包含序列表SeQ ID No.1所示的核苷酸序列。
5.一种提高植物根系吸钾能力、增加叶片含钾量的方法，包括1)构建AtNHX1植物表达载体，它包含序列表中SeQ ID No.1所示的核苷酸序列；2)将含AtNHX1基因的植物表达载体导入植物细胞；获得吸钾能力增强的转基因后代，包括植物各部分组织。
6.根据权利要求5所述的一种提高植物根系吸钾能力、增加叶片含钾量的方法，其特征在于所述植物为双子叶或单子叶植物。
7.根据权利要求5所述的一种提高植物根系吸钾能力、增加叶片含钾量的方法，其特征在于所述植物为烟草。
8.根据权利要求5所述的一种提高植物根系吸钾能力、增加叶片含钾量的方法，其特征在于所述将含AtNHX1基因的植物表达载体导入植物细胞是通过根癌农杆菌介导，采用叶盘法进行。
全文摘要
本发明首次发现并公开了拟南芥的质子泵基因具有提高转化植物根系吸钾能力的功能，并提供了含有该基因的植物表达载体的构建方法和提高植物含钾量的方法。本发明的优点是首次发现并公开了拟南芥的质子泵基因具有提高转化植物根系吸钾能力的功能，并提供了含有该基因的植物表达载体的构建方法和提高植物含钾量的方法。本发明能够有效解决我国烟叶含钾量过低这个制约我国烟草科技发展的技术难题。
文档编号C07K14/415GK1884539SQ200610012208
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月12日 优先权日2006年6月12日
发明者郭兆奎, 姚泉洪, 万秀清, 颜培强, 李丽杰 申请人:黑龙江省烟草科学研究所