专利名称：拟南芥脱水应答原件结合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种拟南芥(Arabidopsis thaliana)脱水应答原件结合蛋白及其编码基因与应用，具体涉及一个拟南芥中脱水应答原件结合蛋白2A 基因(AtDREB2A)的克隆、重组及应用。
背景技术：
植物总是直接生活在复杂多变的自然环境中。干旱、盐碱、寒冷及高温等逆境会使植物受到生理伤害，严重时甚至导致植物死亡。为了适应这些逆境，植物在漫长的的进化过程中演化出了对这些非生物胁迫的抗性机制，例如气孔关闭、细胞膜及胞质成分的改变等。植物在非生物胁迫的作用下，能够通过信号传导途径，使一些基因的表达受逆境调控， 从而对胁迫作出应答(Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki，1996)。转录因子是一类能够特异地结合于特定DNA区，并对其下游基因的转录有激活或抑制作用的蛋白质。植物中的转录因子起着调控逆境胁迫应答，病原反应以及发育等相关基因表达的作用。其中的CBF/ DREB (C-repeat-binding-factor/dehydration-responsive-element-binding)转录因子是植物非生物胁迫应答的重要成分，诱导表达后，可以激活许多下游抗逆基因的表达，从而增强植株的抗逆性。自从1997年，Stocking等人用酵母一元杂交的方法从拟南芥中分离了一个 DRE/CRT结合蛋白CBFl以来(Stockinger et al. 1997)，已经到了许多DREB相关基因 (DREB-Iike)，这些基因产物能够结合启动子区的DRE/CRT元件，以启动一序列非生物抗性基因的表达，并赋予植物耐盐、干旱、寒冷、高温等能力。(Gilmour et al. 1998 ；Liu et al. 1998 ；Shinwari et al. 1998)。一般认为，与植物抗病机制不同，植物对干旱和高盐等逆境的抗性受多基因控制， 因此，利用基因工程技术导入单个功能基因很难大幅度地提高植物的抗逆性。而信号调控途径中的上游基因，如转录因子则能够基因启动子区域的顺式作用元件特异性结合，在诱导下游抗逆相关的功能基因表达中起到关键作用，因此利用转录因子增强植物抗逆性成为改良植物抗逆性的重要途径。在抗盐基因工程领域，DREB-直备受关注，研究者们通过转基因手段DREB导入植物基因组中，得到了许多抗性增强的转基因品种。DREB2A基因是DREB基因家族的成员，它的全cDNA序列与35S启动子相连转入拟南芥，发现在非胁迫条件下DREB2A能够表达，但下游基因表达微弱，植株抗性没有得到明显提高，推测DREB2A需要经过转录后加工比如磷酸化等。生物信息学分析表明，DREB2A蛋白的136-165位氨基酸残基富含泛素化位点，这些位点的存在，使得该蛋白进入降解途径， 因而不能长期稳定存在，发挥功能。这也许是植物体内存在的对这个蛋白的负调控机制。在国内，周淼平等人将拟南芥DREB2A与bar基因同时导入小麦，测定了共转化频率，但并未对转基因小麦的抗盐性做出评估。我们通过折叠延伸PCR的方法将DREB2A中第136-165位氨基酸删除，得到组成型激活的DREB2A-CA。通过农杆菌介导的转基因方法，在转基因烟草中验证其功能。发现该基因能够有效地提高植物的抗盐，抗旱，抗高温能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拟南芥来源的脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活 (constitutive activation/CA) (AtDREB2A-CA)。本发明的第二个目的是提供该重组基因编码的蛋白质。本发明的再一个目的还在于提供含有该重组基因的重组载体和宿主细胞。本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。本发明提供了一种拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因 (AtDREB2A-CA)，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列构成。本发明提供了一种上述拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因 (AtDREB2A-CA)编码的蛋白质，如序列表中SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的蛋白质。本发明提供了一种上述拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因 (AtDREB2A-CA)重组克隆载体 pBS-T_AtDREB2A_CA。含有上述的拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A_CA)的重组载体，这些重组载体包括质粒和植物表达载体。所述的重组植物表达载体pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A_CA。含有上述拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A-CA)完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或烟草细胞。本发明提供了一种含有AtDREB2A_CA的基因工程菌。上述拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A_CA)的应用包括该基因编码的蛋白在植物中的应用；用所述的重组载体，如植物表达载体转化玉米细胞； 或者用所述含有该基因的农杆菌与玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜等细胞共培养，得到转基因的再生植株；或者用所述的AtDREB2A-CA遗传转化获得上述物种转基因植株。本发明的技术方案具体概述如下一种拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A_CA)，如序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，还包括SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%以上同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。一种含有拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A_CA)重组载体 pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A_CA 的农杆菌 C58。一种拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A_CA)编码的蛋白，如序列表中SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列。一种拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A_CA)编码的蛋白在烟草，玉米和大豆中的应用。所述的拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A_CA)还应用于制备转基因大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜等植株。本发明的克隆方法由下述步骤组成从拟南芥叶片中提取总RNA，根据GenBank中拟南芥脱水应答原件结合蛋白 2A(AtDREB2A)的天然序列，设计由SEQ ID N0. 3所示的上游引物P1，和由SEQ ID N0. 4所示的下游引物P2，克隆得到AtDREB2A基因，将此基因连接PBS-TII载体。得到中间载体 PBS-TII-AtDREB2A然后利用折叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增得到拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A-CA)。本发明构建含拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因的植物表达载体 pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A-CA，由下述步骤组成设计由SEQ ID NO. 5所示的上游引物F1，和由SEQ ID NO. 6所示的下游引物Rl， 以PBS-TII-AtDREB2A为模板，进行PCR扩增，得到第一个PCR片段。再用SEQ ID NO. 7所示的上游引物F2，和由SEQ ID NO. 8所示的下游引物R2，以PBS-TII_AtDREB2A为模板， 进行第二次PCR扩增，得到第二个PCR片段。然后将上诉两个片段做SOE-PCR得到一个融合DNA片段，即AtDREB2A-CA，将此PCR扩增产物经EcoRI和EcoRV酶切后，将植物表达载体pH7m24GW，3_Prd29A经EcoRI和EcoRV酶切，二者进行连接反应，得到植物表达载体 pH7m24Gff,3-Prd29A-DREB2A_CA。本发明提供了一种拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用。然后连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化烟草，获得的转基因植株，进行了抗盐性分析，结果表明转基因烟草抗盐能力得到提高。
图1用AtDREB2A弓丨物对拟南芥cDNA的PCR电泳图。图2AtDREB2A连接PBS-TII载体的PCR验证验证结果。图 3PBS-TII_AtDREB2A 载体示意图。图4用SOE-PCR得到AtDREB2A_CA的电泳验证结果。图 5 植物表达载体 pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A_CA 用 HindiIII 酶切验证。图 6 植物表达载体 pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A_CA 示意图。图7烟草转基因过程。图8转基因烟草基因组PCR。图9转基因烟草的抗盐性能测试。
具体实施例方式实施例1拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因AtDREB2A基因的克隆及中间载体 pBS-T-AtDREB2A 的构建以拟南芥 RNA 为模板，使用 Reverse Transcription System (Promega 公司)试齐[J 盒进行反转录，合成cDNA第一链。1.将1 μ g(2y 1)的总RNA置于1. 5ml的离心管中，70°C加热lOmin，迅速在冰上冷却，短暂离心后，置于冰上；2.反转录-的反应体系如下Total RNA1 pg (2 μ ) MgCl2 (25 mM) 4 μ Reverse Transcription IOxBuffer 2 μι dNTP Mixture (10 mM) 2 pL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 μ
AMV Reverse Transcriptase (High Cone.)15 U (0.7 μ )
Oligo(CiT)15 Primer0.5 pg (1 pL) Nuclease-Free ddWater 力口至 20 μ 3.混勻后，42°C温浴 50min ；4. 95°C加热5min，4°C放置5min，使AMV逆转录酶失活，不再与cDNA链相结合；5.取1 μ LcDNA反应液为模板，进行PCR反应，用AtDREB2A基因特异引物，SEQ ID N0. 3 及 SEQ ID N0. 4 F5' -GGGAAGGAGATGGCAGTTT-3‘ 19ntR5' -GTTGTGGGATTAAGGCAAATA-3‘ 2 IntPCR反应体系如下
上游引物IpL
下游引物IpL
2.5mMdNTPs2 μL
IOxPCR buffer2.5μl
模板0.5μ
PfU DNA 聚合酶(5U/pL) 0.25μl ddH2017.75μl
Total volume25 μlPCR扩增条件为
预变性 94 °C 4min 变性94 °C 30 s
退火58 °C 30 s
延伸72 °C Imin
循环重复步骤2-4 30次延伸72°C IOmin取5 μ L PCR产物进行凝胶电泳检测。电泳结果见图1所示。然后按照上述方法将DREB基因的PCR片段连接pBS_TII载体，将AtDREB2A基因与pBS_TII载体链接，反应体系如下
PCR片段3 μl
pBS-T 载体1 μ l
2χΤ4 DNA Rapid Ligation Buffer5 μl
T4 DNA Ligase1 μl
反应条件23°C，IOmin0连接产物转化大肠杆菌T0P10细胞(购买于天根公司)， 涂布于含氨苄的LB平板。连接产物鉴定挑取抗性菌落，在含有Amp 100mg/L的LB液体培养基中培养12h，提取质粒，进行 PCR验证，PCR电泳验证结构见图2。由此，我们到的了中间载体pBS-T-AtDREB2A，载体示意图见图3。将该载体送往华大基因公司测序，我们得到了该基因的碱基序列，用ClustalX2 软件进行序列比对，与Genbank所公布的序列完全一致。实施例2构建植物表达载体pH7m24GW，3-Prd29A-DREB2A_CA
引物设计如 F1，R1 和 F2，R2，序列见 SEQ ID NO. 5，SEQ ID NO. 6，SEQ ID NO. 7，SEQ ID NO. 8。用拟南芥pBS-T-AtDREB2A为模板，分别以Fl，Rl和F2，R2为引物，用PFU酶分别做 PCR。体系如下
上游引物2μ
下游引物2汕
2.5mMdNTPs4 μ
IOxPCRbuffer5μ
模板bL
Pfo DNA 聚合酶(5υ/μ ) 0.5μ ddH2035.5μ
Total volume50 μ 反应条件为
预变性 94°C 5 min 变性94。C 30 s
退火57°C 30 s
延伸72°C 1 min40s
循环重复步骤2-4 30次延伸72°C 8 min以上两对引物PCR产物见图4中第1及第2泳道。切胶回收以上两种片段然后做连接
上游片段2μ
下游片段2μ
2.5mMdNTPs2μΙ
IOxPCR buffer2.5吣
Taq DNA 聚合酶(5U/^L) 0.25μ ddH2016.5μ
Total volume25 \ih
反应条件为
预变性 94°C 5 min 变性94°C 30 s
退火50°C 30 s
延伸72°C 45s
循环重复步骤2-4 4次延伸72°C 8 min于是得到连接产物。将此连接产物做全长延伸，体系如下
引物Fl\μΙ
下游R2
2.5mMdNTPs4 成
IOxPCR buffer5μΙ
连接产物20
Pfu DNA 聚合酶(5υ/μ ) 0.5μ ddH2036.5μ
Total volume50 μ 反应条件为
预变性 94°C 5 min 变性94°C 30 s
退火50。C 30 s
延伸72。C 45s
循环重复步骤2-4 4次延伸72°C 8 min连接产物即AtDREB2A_CA，结构见图4中第3泳道。PCR产物直接用EcoRI和EcoRV酶切，酶切体系为
PCR片段12盹
IOxTanger Buffer 6\iL EcoRlΙμ
EcoRVlμL
补水至总体积 30 μL37°C 12h进行完全酶切，酶切产物做切胶回收，确定浓度，连接植物表达载体，连
接体系为PCR片段7.5灿
载体片段ΙΟμ
10χΤ4 DNA 连接 Buffer2\xL
T4DNA Iigase0.5μ
Total volume20μL反应产物与大肠杆菌感受态细胞ToplO混合，做转化，并涂布于含壮观霉素Spe 的抗性平板上，提取质粒，用HindIII做酶切检测，结构见图5。于是得到了植物表达载体 pH7m24Gff, 3-Prd29A-AtDREB2A_CA，载体示意图见图6。将该载体送往华大基因公司测序，我们得到了拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活(constitutive activation/CA)基因AtDREB2A-CA的碱基序列，即SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。实施例3用于植物转基因的农杆菌工程菌种C58 :pH7m24GW, 3-Prd29A-DREB2A_CA的构建。农杆菌感受态细胞制备1.将农杆菌C58单菌落接种于5mL YEP液体培养基中，28°C，180r/min振荡培养过夜；2.将上述菌液转入IOOmL YEP液体培养基中，28°C，180r/min,振荡培养(OD6tltl值约为0. 5)；3.冰浴30min后，4°C，4000r/min离心lOmin，收集菌体，重悬于20mL预冷的H2O 中；4. 41，400017/1^11离心101^11，收集菌体，重悬于预冷的10%甘油中，每管20(^1^ 分装，液氮速冻，存于-80°C备用。、植物表达载体的电击转化1.将-80°C取出的C58感受态细胞置于冰上，使其缓慢融化；2.加入2 μ L质粒，混勻；3.转移至电击杯中，以上操作均在冰上进行；4.设置电击转化仪参数25μ F，400olm，1500V, 5ms,电击转化；5.室温静置2min后加入ImL YEB液体培养基，28°C，180r/min振荡培养4h ；6.取501^菌液涂布于含10011^/1 Ka抗性的YEB平板上，倒置平板，28°C培养 48h，直至看到清晰的单菌落。菌落PCR1.挑取若干C58单菌落，分别溶于30 μ L ddH20中，98°C煮沸IOmin ；2.取上述菌液IyL作为模板，依照上述该基因的反应程序进行PCR反应。实施例5农杆菌介导的烟草遗传转化烟草苗的无菌培养将烟草种子播种在培养基上，选饱满、健康的烟草种子，用 75%乙醇浸泡Imin 25%的安替福明(有效氯2. 5% )水溶液灭菌8min，无菌水漂洗三次， 将种子放在MS培养基中，25°C光培养，16h/8h光周期。本实验用到的培养基
培养基烟草试管苗培养基侵染培养基
共培养培养基
脱菌筛选培养基抗性苗生根培养基
成分PH
MS5.8
MS+0.5 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L NAA+100 μιηοΙ/L5.8
AS (液体)
MS+0.5 mg/L 6-BA+ 0.05 mg/L NAA+100 μιηοΙ/L5.8
AS (固体)
MS + 1 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA+100 mg/L Kar5.8 + 400mg/L Cef
l/2MS+100mg/L Kar +400mg/L Cef.5.8
烟草的农杆菌转化浸染菌液的制备(1)挑取阳性农杆菌单菌落，接种到含100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，于 28°C、200r/min的摇床上过夜培养。(2)当菌液处于旺盛生长期(0D· = 0.6-0.9)时，将菌液倒入50ml离心管，在 4000r/min下离心15min，弃上清液，收集菌体。(3)用无菌水清洗菌体2次。(4)用侵染培养基重悬菌体，使OD6tltl = 0. 9-1. 2。外植体浸染将烟草叶片去除主脉和叶边缘，然后将叶片切成IcmX Icm大小，浸入制备好的农杆菌菌液，浸泡8-15min，其间摇动2_3次，使叶片充分接触菌液，取出叶片，用无菌的滤纸吸净多余的菌液，叶面朝下、叶背朝上接种于共培养基中，25°C左右培养3-4天。(2)将叶片转移至筛选培养基中，20天左右更换一次培养基，诱导抗性芽产生(图 7a)，当抗性芽从愈伤组织上长到Icm左右(图7b)，从愈伤上切取抗性芽，接种于抗性苗生根培养基(图7c)。转基因苗移栽将根系生长良好、生命力旺盛的烟草组培苗从组培瓶中取出图，用自来水冲洗培养基(尽量减少根系损伤)，种植在蛭石和腐殖土的培养土中，覆盖薄膜保温保湿15天，然后揭开薄膜，定期浇水、施肥，使之在温室中正常生长(图7d)。实施例6转基因烟草的分子检测和抗盐性检测转基因烟草基因组DNA的PCR检测1. CTAB法提取烟草总DNA ；2.以基因组DNA 为模板，进行PCR检测，引物为P5、P6，反应条件DI B2A检测引物F TGACGGTACTACTGTGGCTR TTCTACAATCCCTTGCTCCPCR反应体系
上游引物Ιμ
下游引物Ιμ
2.5mMdNTPs2 IOxPCRbuffer
模板0.5pL
Taq DNA 聚合酶(5U/pL) 0.25成
CidH2O\^. SμL
Total volume25 pLPCR扩增条件
预变性94 0C4 min变性94 0C30 s退火55 0C30 s延伸72 0C45 s循环重复步骤2-430次延伸72 0C10 min取上述PCR产物5微升，进行电泳检测，如图8所示，说明AtDREBA2A_CA基因已成功转入烟草。转基因烟草的抗盐性检测将在温室正常生长的，5-7cm转基因烟草苗和野生型对照苗，分别浇上含 300mmol/L及500mmol/L浓度的NaCl的水，在温室中保持85 %的湿度。监测发现，在 300mmOl/LNaCl的生长条件下，野生型的烟草生长缓慢，生物量较少。如此相反，转基因烟草能够开花结实，相对生物量较高。见图9a。在500mmOl/LNaCl的生长条件下，生长一周以后，野生型烟草叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。尽管转基因烟草的生长也受到一定程度的抑制，但远不像野生型烟草那样明显。见图％。
权利要求
1.一种拟南芥来源的脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A-CA)，其特征在于选自以下核苷酸序列之一1)具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的70%的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因编码的蛋白质， 其特征在于所述的蛋白质具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.—种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A 组成型激活基因(AtDREB2A-CA)全序列或部分片段。
4.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组植物表达载体pH7m24GW， 3-Prd29A-DREB2A-CA0
5.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求1所述的拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A 组成型激活基因(AtDREB2A-CA)全序列或部分片段。
6.一种权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于它是农杆菌细胞，烟草细胞，玉米细胞或者大豆细胞。
7.权利要求1所述的拟南芥来源的脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因 (AtDREB2A-CA)的克隆方法，其特征在于由下述步骤组成(1)从拟南芥叶片中提取总RNA，做逆转录PCR，得到AtDREB2A基因，将此基因连接 PBS-TII 载体；得到中间载体 PBS-TII-AtDREB2A ；(2)以PBS-TII-AtDREB2A为模板，用折叠延伸PCR(SOE-PCR)方法扩增得到拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A-CA)；(3)将上述PCR扩增产物经EcoRI和EcoRV酶切后，将植物表达载体pH7m24GW， 3-Prd29A经EcoRI和EcoRV酶切，二者进行连接反应，得到植物表达载体pH7m24GW， 3-Prd29A-DREB2A-CA0
8.—种权利要求1所述的拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因 (AtDREB2A-CA)的应用，其特征在于它用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植株。
全文摘要
本发明涉及一个拟南芥中脱水应答原件结合蛋白2A基因(AtDREB2A)的克隆、重组及应用。它具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。从拟南芥叶片中提取总RNA，做逆转录PCR，得到AtDREB2A基因并将其连接到PBS-TII载体，得到中间载体PBS-TII-AtDREB2A。以PBS-TII-AtDREB2A为模板，用折叠延伸PCR(SOE-PCR)方法PCR扩增得到拟南芥脱水应答原件结合蛋白2A组成型激活基因(AtDREB2A-CA)，并将扩增产物连接到植物表达载体，得到植物表达载体pH7m24GW，3-Prd29A-AtDREB2A-CA。用电击法将此载体导入农杆菌C58细胞，用这种细胞浸染烟草，得到了转入AtDREB2A-CA的烟草，通过测试，发现了转基因烟草抗盐性得到很大提高。
文档编号C12N15/29GK102329804SQ201110289908
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者关春峰, 季静, 王罡, 赵清 申请人:天津大学