专利名称：调节拟南芥蛋白降解的泛素特异性c末端水解蛋白酶基因的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种调节拟南芥蛋白降解的泛素特异性C末端水解蛋白酶基因。
泛素特异性C末端水解蛋白酶(Ubiquitin-C-terminal hydrolases)对于体内游离Ub循环是必需的。它可分为两大类(Hochstrasser，1995)第一类分子量相对较小(α-氨基-Ub-C末端水解酶)，约20kD，主要负责移去Ub-C末端的小分子物(如短肽，Lys，Glu等)，第二类分子量较大(ε-氨基-U-C末端水解酶)，50～300kD，有两个保守区，一个含有必需的Cys，另一个含有两个对催化活性必需的His，它们主要负责移去泛肽化蛋白(Ubiquitinated protein)中的泛肽链。
在植物抽提液中已查明有几种Ub-C末端水解酶。有的对肽特异，有的对异构肽键特异，对微量的高铁血红素(hemin)抑制剂很敏感(Huang等，1995；Vierstra等，1988)。另外还有一类Ub-C末端水解酶功能很特异，它只识别Ub部分，而快速清除掉Ub-C末端任何额外的氨基酸和多肽(那些以脯氨酸pro为第一个残基的除外)，利用这个特性，可以构建Ub-外源蛋白融合基因，在真核生物体内得到已加工的外源蛋白(Sullian等，1990)。
Ub-C末端水解酶的可能功能如下(Hershko等，1992)1.蛋白降解从末端产物的Lys残基处释放Ub；拆散泛肽链；“校正阅读”(proofreading)，释放被错误泛肽化的蛋白；加工不正常的泛肽链。
2.在泛肽生物合成中加工前体加工多聚泛肽链成单体泛肽；加工泛肽-核糖体蛋白融合物，释放单体Ub和核糖体蛋白；移去Ub-C末端附加的氨基酸。
3.从蛋白降解副产物中回收Ub。
4.逆转对非降解性蛋白的泛肽化修饰。
本发明的技术方案如下拟南芥中没有内源的标签因子，T-DNA整合成为主要的插入诱变方法。拟南芥已经通过T-DNA标签得到了成千上万的突变体。经过TAIL-PCR(ThermalAsymmetric Interlaced PCR，Yaoguang Liu et al，1998，Plant Molecular BiologyReporter 16175-181，热不对称交错多聚酶链式反应)技术扩增并测定标签插入位点的两端序列，用Blast2.0软件将测定序列和拟南芥的全基因组序列比较，找出突变位点，种植突变体，其中通过表型分析以及各种不同的环境条件的筛选，在大量突变体当中筛选到了该突变体为泛素特异性C末端水解蛋白酶基因。T-DNA插入了拟南芥第4染色体的第5502902碱基处，插入了基因At4g10590启动子区。
基因AT4G10590的cDNA序列见序列表1(SEQ ID No.1)。
基因At4g10590编码的蛋白质序列见序列表2(SEQ ID No.2)。
一、材料拟南芥生态型(Columbia)；质粒pSKI015(Weigel，D.，et al 2000)；各种常用抗生素；根癌土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)为GV3101。
二、方法1.植物生长和转化拟南芥在温室中22℃生长，每天光照16小时，黑暗8小时。含有pSKI015的农杆菌GV3101，先用PCR反应鉴定质粒中的四个CaMV35S增强子完整存在(Weigel，D.，et al 2000)。
我们采用的Ti质粒是pSKI015，质粒中的T-DNA区域含有BAR基因，赋予除草剂抗性。还含有在原核系统中用来筛选的Amp抗性基因，在T-DNA右边缘附近有串联的4个35S增强子，有可能在插入拟南芥基因组后增强侧翼或附近某个基因的表达，从而获得某种功能，做为插入基因失活的一个额外的补充。
转化拟南芥的方法主要采用农杆菌介导的转化方法。十多年前科学家发明了种子侵染转化法，后来采用农杆菌培养侵染植物茎尖成整株植物进行真空抽滤，这些方法都代替了以前组织培养和植物再生方法，缩短了组织培养的步骤。我们实验使用的转化方法是花浸法(flaral dip)，比真空抽滤更为简便，转化效率也不会降代低。野生的拟南芥(Columbia)长到一定阶段，有一些未成熟的花苞，将已开的花剪掉，做为待转化植物。带有pSKI015的农杆菌经鉴定后28℃摇到稳定期(0.06≈2.0)离心后重新悬浮在浸染培养基中。浸染培养基中必不可少的提高转化效率的是蔗糖和Surfactant两种物质。将含有大量未开花苞的拟南芥倒置在农杆菌的浸染培养基的浸泡液中十五分钟，然后暗培养一定时间后继续开花，结籽，将种子收集，其中就有转基因株系。
2.转基因植物的筛选和PCR检测转化植物的子代用抗生素等标记筛选出来。我们使用的是除草剂PPT，采用一定浓度的PPT(100mg/ml)加入培养基中，使不含有T-DNA插入的种子不萌发或不生长，而含有T-DNA插入的种子因为含有完整的BAR基因而正常生长起来。在这些植物中，T-DNA插入一般为单倍体，是隐性突变，所以表型一般不易发现。
用CATB法提取植物叶片的总DNA，利用pSKI015载体上BAR基因的引物进行PCR检测5’引物5’-TCGACTCTAGCGAATTCCTC-3’，3’引物5’-ATAGGCGTCTCGCATATCTC-3’；并用拟南芥中COP1的引物同时进行PCR作为正对照5’引物5’-TGACTATGCTCTGTTTCAGCT-3’，3’引物5’-TTAGTAAACCAAGGAAACACCA-3’反应条件为94℃ 50s，60℃ 60s，72℃ 90s，35个循环，PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
3.T-DNA插入侧翼序列的扩增和测序我们采用TAIL-PCR，即热不对称性交错PCR(Thermal Asymmetry InterlacePCR)，TAIL-PCR包含三轮连续的半嵌套式插入序列特异引物和一个小的可退火在附近侧翼序列上的随机引物，很容易扩增出插入位点侧翼序列，这种方法不需要在PCR之前进行很多复杂的操作，而且产生高纯度的特异产物，可以直接用作杂交探针和测序模板，即具有高效、灵敏、简便、特异的优点。
将确定含有BAR基因的植株用TAIL-PCR扩增T-DNA插入侧翼序列(Liu，1995)，所用的三个特异引物是根据T-DNA的左边缘附近的序列设计的，分别为DL15’-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGG-3’；DL25’-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3’；DL35’-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3’。
所用的任意兼并引物有两个AD25’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’；AD2-25’-NGTGCA(G/C)(A/T)GTNT(A/T)GAA-3’。
大量扩增第三轮PCR产物，用低熔点琼脂糖将每条条带进行回收，加两倍体积的水在65℃温浴使胶块熔化，用酚、氯仿各抽提一遍。再用2-2.5倍体积乙醇和1/10体积醋酸钠(NaAC)沉淀。12,000转，离心20分钟后沉淀，用70％、100％乙醇各洗一遍，抽干。溶于水中，定量后可用来测序。
还可将第三轮PCR产物直接与pBS产生的T-vector用T4_DNA连接酶连接，筛选出有插入的阳性克隆。提质粒测序。
4.序列的比对和分析得到大量的插入位点侧翼序列，就需要进行序列分析，首先用BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool)与数据库中的序列进行比对，到EMBL或GENBANK中比对出匹配的序列，从而确定T-DNA插入位点究竟在哪条染色体的什么部位，附近的开放读码框架(Open Reading Frame，ORF)，已经翻译出蛋白质的可能功能，与已知蛋白的同源比较等等，由此得到我们寻找的泛素特异性C末端水解蛋白酶基因AT4G10590突变的突变体。
5.表型分析种植突变体，同时种植野生型拟南芥为对照。如附
图1和附图2所示，图1为拟南芥突变体植株在开花期和结荚期的形态照片；图2为野生拟南芥在开花期和结荚期的形态照片。由图中可以看出，突变体在开花期和结荚期与野生型比较，表现出明显的植株发育迟缓。
本发明采用农杆菌介导的方法，将农杆菌的T-DNA插入到拟南芥的基因组DNA当中，从而产生插入突变体。转化植物的种子在含有PPT(100mg/ml)的MS培养基上进行筛选。用CATB法提取植物叶片的总DNA，利用pSKI015载体上BAR基因的引物进行PCR。将确定含有BAR基因的植株用TAIL-PCR扩增T-DNA插入侧翼序列。大量扩增第三轮PCR产物用低熔点琼脂糖将每条条带进行回收。测序后进行BLAST的比对与分析，由此找到T-DNA的插入位点，经大量筛选拟南芥的突变株，得到T-DNA的插入点恰好是插在泛素特异性C末端水解蛋白酶DNA的序列上。该基因位于拟南芥第四染色体长臂上。该基因与已克隆的泛素特异性C末端水解蛋白酶基因AtUBP1，AtUBP2，AtUBP3有较高的同源性。它的功能与植物细胞的发育、分化与程序性细胞死亡以及信号转导，细胞周期调控等均有着密切的关系。
序列表1(SEQ ID No.1)1 ATGACGATCC CTAATTCCGA TTTCATGATC GAGAACGGAG TCTGTGATTT TCCGACTACT61 CCTGAAGAAG AGAAACGGAT TGTATCGGAG CTGATTACCG AATCGGAGGA TAATTTGAAG121 GAAGGGAACT TGTATTTTGT CATCTCTAAA AGGTGGTATA CAAGCTGGGA GAAATATGTT181 GAGCAATCGA CAAAAGAATA TATAAGTGGA GAGTCCTCTG AAGCTTCAAG GCCAGGACCG241 ATTGATAACC ATGATATTAT CGAAAGTGAA AGCGACGTTA ATGATCCACA ACTTCGTAGA301 TTGTTGATGG AACGGGTTGA CTACGTTTTA GTTCCTCAAG AAGTTTGGAA AAGACTTGTT361 GAATGGTATA GCGGAGGTCC TCCGATAGAA AGGAAGTTGA TCTGTCAAGG ATTTTATACT421 AGGAGTTATA GTGTAGAGGT TTACCCACTC TGCCTTATGT TGACGGACGG ACGAGATGAA481 AGTAGAACTG TAATACGGTT GGGAAAACAG GCCTCTATAA GGGAACTTTA TGAGAAGGTT541 TGTGCTTTGA CAGGGGTACC ACAAGAAAAG TTTTTGCTGA TGAAGGACGC ATTGTTTCGT601 TATGAAGACT TTGCAGCTTT GCCTCACATT GATATTTTTT TTTATAAGCA GGCTCATATC661 TGGGATTACT TCGATAAGAG GAAAAACGGA CTCTTGGATT CTTTATCTTA CAAGAGCCTG721 GAAGAGTCAA GCCTTCATAT GGACCAAGAT ATTCTACTTG AAGTTGATGG GTCGTCTTCC781 TCTCAGTCTG CTATGAGCTC GACAGGAAAT GAGTTAGCTC TGGTACCTCT GGAACCTTCC841 AGGTCGAGTG TTACAATTGC TGGGGGGCCT ACCCTATCAA ATGGTCATTC CACTACGTCC901 AACTTTAGTC TCTTTCCGAG AATAACTTCT GAAGACGACG GCAGCAATTC TTTGAGTATT961 CTTGGAAAAG GAGAAAAGGG AGGATTAGCA GGATTGAGTA ATTTGGGAAA TACCTGCTTT1021 ATGAATAGCG CTCTTCAGTG TTTGGCCCAC ACACCTCCAA TTGTTGAATA CTTCTTGCAA1081 GATTACAGTG ACGACATAAA TAGAGATAAT CCTTTGGGAA TGTGTGGTGA GCTTGCTATC1141 GCGTTTGGTG ATTTGTTGAA GAAATTATGG TCATCAGGAA GGAACTCAGT TGCACCACGC1201 GCATTTAAGA CAAAATTGGC TAGATTTGCT CCACAGTTTA GTGGTTACAA TCAGCATGAT1261 TCTCAAGAAC TGCTTGCTTT CTTATTGGAT GGGCTGCATG AAGATCTGAA TAAGGTCAAA1321 CGAAAACCTT ACATCGAACT TAAAGATTCT GACAGTCGTC CGGATGATGA AGTTGCTGAA1381 GAGCTTTGGA ATTATCATAA GGCCCGAAAT GATTCTGTAA TAGTTGATGT TTGTCAAGGC1441 CAATACAAGT CCACTCTGGT TTGTCCAGCT TGCGGAAAAA TATCAATCAC TTTTGATCCC1501 TTCATGTACT TGTCTGTACC TTTGCCATCA ACACTTACGC GATCCATGAC AGTTACGGTG1561 TTTTATTGCG ATGGAAGTCA TCTTCCGATG CCATACACAG TAATAGTGCC TAAAAATGGA1621 TCTATTAGAG ATCTCATTAC CGCATTAGGT ACTGCTTGTT TATTAGCCGA AGATGAGAGT1681 CTTTTACTTG CAGAGGTATA TGACCACAAG ATTTTTAAAT ATTTTGAGAA TCCCCTGGAT1741 TCACTGAGTT CGATAAAAGA TGATGAGCAT ATTGTAGCCT ATCGGTTAAA TCAGATGCCG1801 AAAGGATCAG GGAAAGCAAA ACTCGAAATT CTTCATGGAG GGCAGAAAAG GCCTATTCTG1861 GAGAGTGTTA GAGGCAGAGA TGTGAAGCTC TTTGGAACTC CTTTTGTGAC TTATGTCAAC1921 ACAGAACCAC TAAGTGGAGC TGACATTGAT GCAGTTCTCT CTCGATTTCT GTCGCCTCTG1981 CACAAGGTCC ATGCCCCATC TAAGATTCAT AACGGAAGTG AAAATGGCCA CCTTCCTGAT2041 GCTACTGTTG ACGAAGCATC CGAAATTTTA TCATCCCCAG ATACCGAGAT AGACGATGCA2101 TCTGATAGAG AGTTATCCTT CAGGATATTC TTGACAGATG AACGTGGTTT GAACTTTAAA2161 CCACTGCAGT CTGAATCTTC CATAAGCCTG GGTATCGCTA CAAGAGTTTT AGTCGAGTGG2221 AATGAGGGTG AGCATGAAAG ATATGATTCC AGCTACTTGA GTGATCTTCC GGAGGTTCAT2281 AAAACAAGTT TCTCTGCAAA GAAGACAAGG CAAGAATCGA TATCCCTGTT TTCGTGTTTG2341 GAGGCGTTTT TAGCAGAAGA ACCTCTGGGA CCAGATGACA TGTGGTTTTG TCCGAGCTGC2401 AAAGAACACA GACAAGCGAA CAAAAAGCTA GACCTGTGGA AGTTACCAGA TATTCTTGTG2461 TTTCATTTAA AAAGGTTCAC TTACAGCAGA TATCTCAAGA ATAAGATTGA TACGTTTGTG2521 AATTTCCCAG TTCATGATCT AGACTTGAGC AAGTATGTGA AAAACAAGAA TGACCAGTCA2581 TATCTATATG AACTGTATGC CGTTAGTAAT CATTATGGTG GACTTGGTGG TGGCCACTAC2641 ACTGCCTACG CTAAGTTGAT TGATGACAAT GAATGGTACC ATTTCGACGA CAGTCATGTG2701 TCATCTGTAA ATGAATCTGA AATAAAAAAC TCAGCTGGAT ATGTTCTTTT CTACCGAAGA2761 GTGAGAAGTG AAACAGAGAC ACAAACAGTG GAGATGTCGA CTGATATGGA TTAG序列表2(SEQ ID No.2)MTIPNSDFMI ENGVCDFPTT PEEEKRIVSE LITESEDNLK EGNLYFVISK RWYTSWEKYVEQSTKEYISG ESSEASRPGP IDNHDIIESE SDVNDPQLRR LLMERVDYVL VPQEVWKRLVEWYSGGPPIE RKLICQGFYT RSYSVEVYPL CLMLTDGRDE SRTVIRLGKQ ASIRELYEKVCALTGVPQEK FLLMKDALFR YEDFAALPHI DIFFYKQAHI WDYFDKRKNG LLDSLSYKSLEESSLHMDQD ILLEVDGSSS SQSAMSSTGN ELALVPLEPS RSSVTIAGGP TLSNGHSTTSNFSLFPRITS EDDGSNSLSI LGKGEKGGLA GLSNLGNTCF MNSALQCLAH TPPIVEYFLQDYSDDINRDN PLGMCGELAI AFGDLLKKLW SSGRNSVAPR AFKTKLARFA PQFSGYNQHDSQELLAFLLD GLHEDLNKVK RKPYIELKDS DSRPDDEVAE ELWNYHKARN DSVIVDVCQGQYKSTLVCPA CGKISITFDP FMYLSVPLPS TLTRSMTVTV FYCDGSHLPM PYTVIVPKNGSIRDLITALG TACLLAEDES LLLAEVYDHK IFKYFENPLD SLSSIKDDEH IVAYRLNQMPKGSGKAKLEI LHGGQKRPIL ESVRGRDVKL FGTPFVTYVN TEPLSGADID AVLSRFLSPLHKVHAPSKIH NGSENGHLPD ATVDEASEIL SSPDTEIDDA SDRELSFRIF LTDERGLNFKPLQSESSISL GIATRVLVEW NEGEHERYDS SYLSDLPEVH KTSFSAKKTR QESISLFSCLEAFLAEEPLG PDDMWFCPSC KEHRQANKKL DLWKLPDILV FHLKRFTYSR YLKNKIDTFVNFPVHDLDLS KYVKNKNDQS YLYELYAVSN HYGGLGGGHY TAYAKLIDDN EWYHFDDSHVSSVNESEIKN SAAYVLFYRR VRSETETQTV EMSTDMD*
权利要求
1.一种多核苷酸，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种蛋白质，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所示的多核苷酸，其为调节拟南芥蛋白降解的基因泛素特异性C末端水解蛋白酶基因。
全文摘要
本发明公开了一种一种调节拟南芥蛋白降解的泛素特异性C末端水解蛋白酶基因的DNA序列及其编码的蛋白质序列。该基因的功能与植物细胞的发育、分化与程序性细胞死亡以及信号转导,细胞周期调控等均有着密切的关系,在农业、林业和园艺等的生产实践中有巨大的应用。
文档编号C12N15/57GK1366057SQ0210015
公开日2002年8月28日 申请日期2002年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者瞿礼嘉, 康定明, 刘铁, 董一宇, 秦跟基, 申云平, 邓兴旺, 顾红雅, 陈章良 申请人:北京大学