增加核酸检测灵敏度的方法

专利名称：增加核酸检测灵敏度的方法
技术领域：
本发明涉及三种增加核酸检测灵敏度的方法(多重标记分支PCR引物，多检测位点PCR引物，多位点检测探针与多检测位点PCR引物联合使用)及其在寡核苷酸微阵列芯片上的应用。
基因芯片是一种高密度的核酸微阵列，将大量特定序列的DNA片段(探针)有序地固定在玻璃或硅片上，大量、快速、平行地对DNA进行序列测定和定量、定性分析。基因芯片技术的成熟和应用将给本世纪的疾病诊断、新药开发、司法鉴定、农作物的优育优选、食品卫生监督、环境检测、国家安全防卫等领域带来一场革命；为人类提供高速、并行采集和分析个体生物信息强有力的技术手段，为生物信息学的研究提供重要的信息采集和处理平台。
基因芯片按照固定探针的长短，可以分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片，前者主要用来检测基因表达；后者既可以用来检测基因表达，也可以用来研究基因结构、检测基因突变、筛查单核苷酸多态性等。
本发明的目的是增加检测靶DNA的灵敏度，通过直接或间接地增加引物上标记分子数量的方法，达到增加灵敏度的目的。
直接的方法多重标记分支PCR引物法，即在常规PCR引物的5`端合成多个(1--30个)分支寡聚核苷酸并在各分支的末端标记上标记分子。通过聚合酶链式反应参入靶序列DNA，与基因芯片杂交后检测，可获得增强信号。结构如

图1。
间接的方法1.多检测位点PCR引物 通过在常规PCR引物的5`端合成多个(1--30个)与靶DNA序列不互补的20个碱基左右序列相同检测位点(多位点引物)，与检测位点互补的标记探针用于特异性检出被寡核苷酸探针捕获的经PCR扩增的靶DNA。由于是多位点的检测，其信号(灵敏度)远远大于单位点及PCR引物5`端单标记的信号。结构如图2。
2.多位点检测探针与多检测位点PCR引物联合使用 在常规探针(与多检测位点PCR引物的的检测位点互补的序列)的5`端合成多个(1-30个)与靶DNA序列不互补的20个碱基左右序列相同检测位点，在杂交时加入与多位点检测探针检测位点互补的标记探针，形成复合多位点检测探针。结构如图3。
在Expedite 8909 DNA合成仪先合成常规PCR引物序列，然后每隔6个T连接一个分支点BM-LEV，重复合成四次。取下合成柱经HPAA(0.5M的水合肼的吡啶醋酸溶液)脱掉分支点的LEV保护，再上DNA仪在主侧链继续合成20个T，在主链及分支的5`端标记上荧光染料Cy 3-Amidite(购自AmershamPharmacia Corp)。将合成的多重标记分支PCR引物用氨水从CPG上切下，经OPC柱纯化、冻干即得多重标记分支PCR引物。以检测Nras第二外显子61密码子突变点的引物为例结构如图5。
反向引物为5`ATACACAGAGGAAGCCTTCG 3`。实施例二 多检测位点PCR引物的合成直接合成法先在Expedite8909 DNA合成仪合成常规PCR引物序列，再在其后重复合成三个5`GTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTT 3`序列。用氨水从CPG上将多检测位点PCR引物切下，经OPC柱纯化、冻干即得。以检测结核杆菌耐药rpsL基因突变点的引物为例其序列见表1合成多检测位点PCR引物。
T4 RNA连接酶法按要求在8909 DNA合成仪合成两段寡核苷酸，其中一段寡核苷酸的5`端用磷酸化试剂(英文名称DMT-2，2’-SulfonyldiethanolAmidite，购自Biosearch Technologies，Inc.)将其磷酸化，然后用T4 RNA连接酶(购自Amcrsham Pharmacia Corp)将两段两段寡核苷酸连接起来，生成更多检测位点的多检测位点PCR引物。以乙型肝炎病毒Lamivudine耐药检测引物为例其序列见表1合成多检测位点PCR引物。实施例三 多位点检测探针的合成多位点检测探针是在常规探针(与多检测位点PCR引物的检测位点互补的序列)的5`端合成多个与靶DNA序列不互补的20个碱基左右序列相同检测位点。参考实施例二多检测位点PCR引物的合成，用两种方法分别合成两条多位点检测探针，其序列如下5`GTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTGTATTCCCATCCCATCATC 3`5`GTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTTTTTTGTATTCCCATCCCATCATC 3`用于与结核杆菌耐药rpsL基因突变点的多检测位点PCR引物联合使用。实施例四 标记探针的合成在Expedite 8909 DNA合成仪上合成序列5`Cy3ACACACACACACACACACA 3`，用氨水从CPG上将多检测位点PCR引物切下，经OPC柱纯化、冻干即得。Cy3-Amidite购自Amershan Pharmacia Corp。该标记探针与多位点检测探针和多检测位点PCR引物的检测位点互补。实施例五 多重标记分支PCR引物在N-ras基因突变检测寡核苷酸芯片中的应用
N-ras基因是存在于细胞中的一种原癌基因，属于ras基因家族。N-ras基因突变与多种人类肿瘤的形成与发展有密切关系，是一种肿瘤非特异性癌基因，但在胰腺癌组织中有不同寻常的高突变率(70-100％)。本试剂盒能够快速、敏感地检测出N-ras基因中最常见的12、13、61位密码子突变，有利于肿瘤的早期诊断和预后，具有重要的临床应用价值。
N-ras基因突变寡核苷酸芯片的制备设计与合成同N-ras基因第二外显子61位密码子野生型及各种突变型互补的16mer寡核苷酸探针，其序列见表2 N-ras基因突变检测探针的序列。5`端用C-NH连接臂，用OPC柱纯化及HPLC监控质量。将探针溶解在3XSSC中，通过点样仪按设计的阵列将探针点到25mm×75mm的醛基化玻片上，室温放置3小时，0.2％SDS洗涤两次，双蒸水洗涤两次，再用3％(w/v)NaBH4的磷酸盐(pH7.4)溶液封闭20分钟，双蒸水洗涤两次，室温干燥即制成N-ras基因突变寡核苷酸芯片。
N-ras基因突变寡核苷酸芯片的检测1.样品基因组DNA提取取(匀浆或脱蜡的)组织标本约5mg，向其中加入200μL样品处理液(0.15M PBS pH7.4)，吹打混匀。于55℃水浴中保温3小时。放于沸水浴中，保温10分钟。12000rpm离心10分钟。取2μL上清作PCR。
2.PCR扩增向PCR反应管中加入17μL含有多重标记分支PCR引物PCR反应液和1μL Taq DNA聚合酶，作好标记，向其中加入2μL基因组DNA。瞬时离心，置于PCR仪中。按下列条件进行PCR扩增94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环45次；72℃延伸5分钟。
3. 杂交反应取2μL PCR扩增产物，向其中加入8μL杂交液(6 X SSC)，混匀。瞬时离心，沸水浴中放置5分钟。立即置于冰浴中，放置10分钟。瞬时离心，吹打混匀，将其点在寡核苷酸芯片杂交区，并均匀散开。于55℃湿盒中放置90分钟。取出芯片，室温下于2 X SSC(0.2％SDS)、0.2 X SSC洗涤液中各轻轻荡洗30秒钟。室温下晾干。
4.结果检测将晾干的芯片于荧光扫描仪上扫描(激发波长为550nm，发射波长为580nm，激光强度和PMT值均为80％)。应用Imagene等专用图像分析软件对扫描结果进行定量分析。其荧光扫描结果如图6。实施例六 多检测位点PCR引物在乙型肝炎病毒Lamivudine耐药基因芯片中的应用乙型肝炎病毒感染是急慢性肝炎，肝硬化及肝细胞癌的重要致病因子，在世界范围内乙型肝炎病毒感染也是前十位的致死因子之一。现有的流行病学资料表明，我国是乙肝高发区，8-10％是乙肝表面抗原携带者，肝炎患者加起来超过4000万，其中60％为慢性。通常治疗乙型肝炎病毒感染主要采用a但是，a有某些毒副作用，因而影响了其应用。核苷及核苷类似物通过抑制乙型肝炎病毒DNA多聚酶的活性而影响病毒DNA的复制，现已成为一类较有希望的HBV感染治疗药物，Lamivudine是这一类药物的代表，且已得到美国FDA的批准，其它一些药物，如Famciclovir、Adefovir dipivoxil已进入最后临床实验阶段，现有的研究表明，这些药物毒副作用小，可很快降低血清中HBV DNA的量。
与治疗HIV相似，核苷及核苷类似物用于治疗乙型肝炎病毒感染亦需要长时间用药以清除血液中的病毒，不幸的是，长时间用药会引起病毒对药物的抗性，因而影响了最终治疗效果。研究表明，用Lamivudine治疗12个月后，14％-39％的被治疗者会出现Lamivudine抗性，这些突变主要与HBV DNA聚合酶表位C(YMDD)552位甲硫氨酸(M)突变为异亮氨酸(I)(M552I)或Valine(V)(M552V)有关，M552I、M552V突变常常伴随表位B L528M及V/L/M555I突变。当突变产生后，被治疗者血液中的HBV DNA水平会再次升高，并伴有临床上其它指标的恶化。
HBV抗药性突变是一个渐进的过程。开始时，血液中只有少数病毒突变，此时继续用药还有一定的作用，在以后的用药过程中，抗性毒株的比例会逐渐增高，直至全部都转变为抗性毒株，病情出现逆转，继续用药不再有效。当停用或改用其他药物后，血液中的病毒会逐渐转为正常。已有的研究结果表明，通过检测血液中病毒的突变情况，轮换使用aLamivudine、Famciclovir、丙种球蛋白等药物，可取得非常好的治疗效果。因此，用药过程中需要对HBV耐药进行监测，以达到最佳治疗效果。目前，尚无有效的检测手段，通常需要对样本进行测序，这不仅麻烦，而且价格昂贵，在检测混合感染时也会存在一定的困难，我们采用基因芯片技术，用于检测HBV DNA多聚酶区L528M、M552I、M552V、及V555I、L555I、M555I突变。
乙型肝炎病毒Lamivudine耐药基因芯片的制备设计与合成同N-ras基因突变寡核苷酸芯片。寡核苷酸探针序列见表3乙型肝炎病毒Lamivudine耐药基因突变检测探针的序列。
乙型肝炎病毒Lamivudine耐药基因芯片的检测1.样品处理及PCR扩增反应取HBV DNA阳性血清20μl，加入至已加有20μl样品裂解液(0.1M NaOH)的离心管中，混匀，97℃或沸水浴处理10分钟，15000rpm离心10分钟；取出PCR反应管，标号，分别加入17μl含有多检测位点PCR引物PCR反应液及1μL Taq DNA聚合酶；小心吸取处理标本上清液2μl至PCR扩增管中(阳性对照取2ul直接进行扩增)，混匀，10000rpm离心数秒，然后按下列参数进行PCR反应94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环45次；72℃延伸5分钟。
2.杂交检测取2μL PCR扩增产物，向其中加入8μL杂交液(6 X SSC)，混匀。瞬时离心，沸水浴中放置5分钟。立即置于冰浴中，放置10分钟。瞬时离心，吹打混匀，将其点在寡核苷酸芯片杂交区，并均匀散开。将芯片平置于湿盒中，于45℃水浴中杂交1.5小时；杂交反应结束后，吸去芯片反应格中的杂交液。将芯片依次置于2XSSC(0.2％SDS)、0.2 X SSC洗涤液中，各轻轻荡洗30秒钟，取出芯片，甩去反应区域的液体，去掉覆膜，室温晾干。
3.结果检测将晾干的芯片于荧光扫描仪上扫描(激发波长为550nm，发射波长为580nm，激光强度和PMT值均为80％)。应用Imagene等专用图像分析软件对扫描结果进行定量分析。其荧光扫描结果如图7。实施例七 多位点检测探针与多检测位点PCR引物联合使用在结核杆菌耐药芯片中的应用近年来，结核病发病率呈上升趋势，其中一个主要的原因是多重耐药结核菌株的出现。目前用于结核病治疗的一线药物有利福平、异烟肼、链霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇。96％的耐利福平的菌株出现rpoB基因突变。60％异烟肼耐药是由于KatG基因的突变，约50％的KatG的突变位于315位。此外，在没有KatG的突变的耐药菌株中约有10％的有inhA位点的突变。耐链霉素与rpsL和rrs基因的突变有关。pncA基因的突变与耐吡嗪酰胺有关。大约有72-100％的来自不同地域的耐药标本出现pncA基因的突变，而这些突变在敏感菌株中没有发现。耐乙胺丁醇是由于embCAB操纵子的突变导致。大约有69％的耐药株有embB的改变。以含所有野生型和突变型位点rpsL基因的重组质粒(经测序证实)为研究对象，用基因芯片进行验证。结核杆菌耐药基因芯片的制备设计与合成同N-ras基因突变寡核苷酸芯片。寡核苷酸探针序列见表4结核杆菌耐药rpsL基因突变检测探针的序列。
结核杆菌耐药基因芯片的检测1.样品处理及PCR扩增反应取rpsL基因的重组质粒2μl，加入17μl含有多检测位点PCR引物PCR反应液。然后按下列参数进行PCR反应94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，循环45次；72℃延伸5分钟。
2.杂交检测取2μL PCR扩增产物，向其中加入8μL杂交液(含有多位点检测探针及标记探针)，混匀。瞬时离心，沸水浴中放置5分钟。立即置于冰浴中，放置10分钟。瞬时离心，吹打混匀，将其点在寡核苷酸芯片杂交区，并均匀散开。于55℃湿盒中放置90分钟。取出芯片，室温下于2 X SSC(0.2％SDS)、0.2 X SSC洗涤液中各轻轻荡洗30秒钟。室温下晾干。
3.结果检测将晾干的芯片于荧光扫描仪上扫描(激发波长为550nm，发射波长为580nm，激光强度和PMT值均为80％)。应用Imagene等专用图像分析软件对扫描结果进行定量分析。其荧光扫描结果如图8。
与单标记的引物比较的结果如图9。信号放大后的检测灵敏度是放大前的100倍，可以检测出10fg靶DNA的PCR扩增产物。靶DNA为1ng时，放大后的信号是放大前的5-10倍。
权利要求
1.三种增加核酸检测灵敏度的方法，通过增加待测靶DNA标记分子的数目来实现增强基因芯片信号、提高检测灵敏度。
2.根据权利要求1所述的增强基因芯片信号方法之一为多重标记分支PCR引物(结构如图1)法，即在常规PCR引物的5`端合成多个(1-30个，最佳为3-6个)分支并在各分支的末端标记上标记分子。通过聚合酶链式反应参入靶序列DNA，与基因芯片杂交后检测，可获得增强信号。
3.根据权利要求1所述的增强基因芯片信号方法之一为多检测位点PCR引物(结构如图2)法，即在常规PCR引物的5`端合成多个(1-30个，最佳3-7个)与靶DNA序列不互补的10-50个(最佳18-24个)碱基序列相同检测位点(多位点引物)，与检测位点互补的标记探针用于特异性检出被寡核苷酸探针捕获的经PCR扩增的靶DNA。
4.根据权利要求1所述的增强基因芯片信号方法之一为多位点检测探针法，即在常规探针的5`端合成多个(1-30个，最佳3-7个)与靶DNA序列不互补的10-50个(最佳18-24个)碱基序列相同检测位点，在杂交时加入与检测位点互补的标记探针，形成复合多位点检测探针。
5.根据权利要求1所述的增强基因芯片信号方法之一为多位点检测探针与多检测位点PCR引物联合使用。如图3。
6.根据权利要求2、3、4、5所述的多重标记分支PCR引物、多检测位点PCR引物、多位点检测探针通过DNA合成仪合成或将已合成的片段经T4 RNA连接酶连接而成。
7.根据权利要求1所述的标记分子为荧光标记物、生物素标记、酶标记、化学发光标记物及电化学发光标记物等。
8.根据权利要求1、2、3、4、5所述的信号增强方法不仅限于基因芯片方面的应用，也适合其他检测靶DNA方面的应用。
9.根据权利要求1、2、3、4、5所述的信号增强方法在临床疾病诊断、药物疗效评价、药物筛选及疾病相关基因分析等生物医学领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述的临床疾病诊断为传染病诊断、性病诊断、癌症诊断等。
全文摘要
本发明涉及三种增加核酸检测灵敏度的方法及其在核酸分析及检测、医学诊断中的应用，属于生物医学工程领域。通过增加待测靶DNA标记分子的数目来实现增强基因芯片信号、提高检测灵敏度。该发明涉及的方法有多重标记分支PCR引物，多检测位点PCR引物，多位点检测探针与多检测位点PCR引物联合使用。本发明的实施在临床诊断、药物疗效评价、药物筛选及疾病相关基因分析等生物医学领域具有重要作用。
文档编号C12Q1/68GK1432654SQ0210007
公开日2003年7月30日 申请日期2002年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者王升启, 曹恒杰, 刘军波, 陈立炎, 丁雨 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所, 深圳益生堂生物企业有限公司