专利名称：拟南芥基因At4g31870在植物抗光氧化胁迫方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种拟南芥基因At4g31870的应用，尤其涉及该基因在植物 抗光氧化胁迫方面的应用，同时，还涉及该基因At4g31870在培育抗高温胁 迫转基因植物品种方面的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
光合作用是光合器官利用光能驱动合成有机化合物的复杂的物理和化学 过程，植物、藻类和一些光合细菌都能进行光合作用。虽然植物的光合作用 离不开光能，但是过量的光照，反而会对植物造成潜在的危害，因为强光能 抑制光合作用，降低光合作用的效率和最大光合速率，严重时还会造成光合 机构的光氧化破坏，从而造成农业的大量减产。随着分子生物学和基因工程 研究的深入，国际上很多实验室也试图寻找与光氧化胁迫的相关基因，拟通 过基因工程技术改良作物对强光的抗性，但这方面的研究进展也仍然很缓慢。 因此，认识植物对光氧化胁迫的反应机制，提高植物的抗性，是农业增产的 重要基础。
现有研究表明，当光照强度过高时，植物体内会伴随着大量的活性氧 (Reactive Oxygen Species， ROS)产生。谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathine
Peroxidase, GPX)是抵御氧化胁迫的一种重要防御酶，其在动物和酵母中 清除活性氧的功能已被证明。但它在植物中如何应答外界胁迫，如何感受和 是否能够清除非生物胁迫产生的ROS还未见报道。因此，克隆和鉴定植物中 GPX功能，并研究其与光氧化胁迫的关系，具有重要的理论意义和实际应用 价值。 发明内容本发明的目的在于提供了一种拟南芥基因At4g31870在植物抗光氧化胁 迫方面的应用，以拓展基因At4g31870的应用范围。
同时，本发明的目的还在于提供一种拟南芥基因At4g31870在培育抗光 氧化胁迫转基因植物方面的应用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种拟南芥基因 At4g31870在植物抗光氧化胁迫方面的应用。
所述的基因At4g31870为拟南芥谷胱甘肽过氧化物酶家族基因，该基因 的CDS长度为702 bp，编码233个氨基酸的蛋白，该蛋白为一个谷胱甘肽 过氧化物酶，该基因编码的蛋白定位在叶绿体。
所述的At4g31870的基因编码一个谷胱甘肽过氧化物酶，定位在叶绿体内。
所述的At4g31870基因从拟南芥资源中心(ABRC， Ohio State University)获得。
同时，本发明的技术方案采用了一种拟南芥基因At4g31870在培育抗光 氧化胁迫转基因植物方面的应用。
将At4g3化70基因的超表达载体转化获得抗光氧化胁迫相关的转基因植物。
本发明利用从拟南芥资源中心获得的At4g31870基因T-DNA插入突变 体，研究发现突变体对强光引起的氧化胁迫敏感，克隆得到了 At4g31870基 因，采用GUS组织定位和GFP融合蛋白的细胞定位方法，分析At4g31870
基因的细胞和组织表达特性。
本发明利用DAB染色检测到强光下突变体的内源活性氧含量较野生型 (WT)高；与WT相比，突变体相对叶绿素含量和相对电导率都有不同程度 的降低，因此推测At4g31870功能缺失可能损伤了叶绿体的代谢。
本发明编号为At4g31870的基因编码一个谷胱甘肽过氧化物酶，主要定 位在叶绿体内，该基因的缺失突变体对强光敏感，表现出显著的光漂白现象。本发明通过对At4g3化70基因的分离和基因功能的分析鉴定，确立了 At4g31870在植物抗光氧化胁迫中的作用及其调节机制，为培育抗光氧化胁 迫的转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。本发明从拟南芥中克隆 得到能够调节植物抗氧化胁迫反应的基因At4g31870，为获得抗光氧化胁迫 作物新品系提供了遗传学材料和基础。
图1为强光胁迫对突变体A77W叶片漂白的影响及内源活性氧检测； 图2为强光下A77i7体内活性氧检测；
图3为强光胁迫下A77i7相对电导率和叶绿素含量检测；
图4为At4g31870基因的组织和亚细胞定位。
具体实施例方式
实施例1
At4g31870基因的体内表达和定位分析
由软件分析At4g31870的启动子区序列大概1200bp， At4g31870的 CDS序列为702bp，在pCAMBIA1381的GUS报告载体和pEGAD的GFP 载体中选择合适的酶切位点，PCR扩增目标片段，分别构建载体。转化野生 型拟南芥，由Basta和潮霉素筛选阳性转基因植株。GUS组织化学染色和荧 光定位分析表明，At4g31870表达主要分布在叶片的叶绿体中(图4)，与该 基因控制光氧化胁迫相关。表明At4g31870的作用可能与光合作用和光和效 率调控的抗氧化胁迫有关。
实施例2
At4g31870基因的功能分析
如图1所示，强光胁迫下突变体的叶片出现显著的光漂白现象。其中图1 中，(A)强光胁迫下表型分析；(B)强光胁迫下叶片漂白率统计。
从拟南芥资源中心(yArajb/c/OjDS/'s Biological Resource Center)索要 At4g31870的T-DNA插入突变体SALK—120995和SALK—072007。表型分析表明，连续强光(800±50 ms-1m—2)照射8小时后，突变体植 株出现明显的光漂白和光损伤，而WT植株生长正常。强光胁迫下，与WT 相比，突变体相对叶绿素含量和相对电导率都有不同程度的降低，At4g31870 功能缺失可能损伤了叶绿体的代谢，说明At4g31870基因缺失的突变体对光 氧化胁迫的抵抗性弱。
实施例3
At4g31870基因在强光下对活性氧清除的作用分析。
如图2所示，染色检测强光胁迫下野生型与突变体活性氧。DAB原位组 织染色发现，强光胁迫下，At4g31870突变体的H2O2产生量和速率都高于野 生型。这些结果表明，在强光引起的光氧化胁迫中，At4g31870具有保持叶
绿体活性氧平衡的重要功能，且可能调节光抑制和光氧化损害。 实施例4
如图3所示，检测了强光下At4g31870突变体的叶绿素含量和电导率， 可以明显的看到，At4g31870突变体植株中叶绿素含量下降的快并且植株细 胞外渗的快。强光处理导致膜透性增加，细胞内物质渗出，电导率增大(图3)。 结果表明，At4g31870功能丧失，降低了强光胁迫的防御并且破坏了膜的透 性和叶绿素的合成。
权利要求
1、一种拟南芥基因At4g31870在植物抗光氧化胁迫方面的应用。
2、 根据权利要求1所述的拟南芥基因At4g31870在植物抗光氧化胁迫 方面的应用，其特征在于所述的基因At4g31870为编码谷胱甘肽过氧化物 酶基因，该基因的CDS长度为702 bp，编码233个氨基酸的蛋白。
3、 根据权利要求1或2所述的拟南芥基因At4g31870在植物抗光氧化 胁迫方面的应用，其特征在于所述的At4g31870的基因编码一个谷胱甘肽 过氧化物酶，定位在叶绿体内。
4、 根据权利要求3所述的拟南芥基因At4g31870在植物抗光氧化胁迫 方面的应用，其特征在于所述的At4g31870基因从拟南芥资源中心(ABRC， Ohio State University)获得。
5、 一种拟南芥基因At4g31870在培育抗光氧化胁迫转基因植物方面的应用。
6、 根据权利要求5所述的拟南芥基因At4g31870在培育抗光氧化胁迫 转基因植物方面的应用，其特征在于将At4g31870基因的超表达载体转化获得抗光氧化胁迫相关的转基因植物。
全文摘要
本发明涉及一种拟南芥基因At4g31870在植物抗光氧化胁迫方面的应用，同时，还涉及该基因At4g31870在培育抗高温胁迫转基因植物品种方面的应用。本发明编号为At4g31870的基因编码一个谷胱甘肽过氧化物酶，主要定位在叶绿体内，该基因的缺失突变体对强光敏感，表现出显著的光漂白现象。本发明通过对At4g31870基因的分离和基因功能的分析鉴定，确立了At4g31870在植物抗光氧化胁迫中的作用及其调节机制，为培育抗光氧化胁迫的转基因作物新品种奠定了理论和生产实践基础。本发明从拟南芥中克隆得到能够调节植物抗氧化胁迫反应的基因At4g31870，为获得抗光氧化胁迫作物新品系提供了遗传学材料和基础。
文档编号A01H5/00GK101519661SQ200910064428
公开日2009年9月2日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者杰 代, 宋纯鹏, 坤 李, 苗雨晨, 郭敬功 申请人:河南大学