专利名称：2型糖尿病肾病模型的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于对糖尿病肾病进行研究的模拟对象，尤其涉及一种2型糖尿病肾病模型制备方法。
背景技术：
糖尿病已日益成为全球的公共健康问题，通常分为2种类型，其中2型糖尿病占整个糖尿病的90％以上。糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性并发症之一，其发病机制仍不十分清楚。越来越多的研究证实足细胞损伤在糖尿病肾病发病机制中起十分重要的作用。足细胞是一高度分化的终末期细胞，现有的小鼠永生系足细胞为体外研究足细胞损伤提供了重要的保证，在体内研究中，建立一种尽量模拟人类2型糖尿病肾病发病过程的动物模型无疑有助于我们深入了解足细胞损伤机制，从而阐明糖尿病肾病其发病机制，更好地防治糖尿病肾病。
大量的临床和流行病学资料显示，胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的初始环节。是否具有胰岛素抵抗特征是2型糖尿病动物模型的关键。目前有关2型糖尿病肾病早期肾脏损害的研究模型较少，糖尿病模型制备方法分别有自发性或遗传性动物模型、化学药物药物诱导法、高糖高脂饲料诱导法、手术切除胰腺法和转基因动物等方法，但这些方法所建立的模型均不能完全反映2型糖尿病的病理及病理生理变化特点。
发明内容
本发明提供一种能模仿人类2型糖尿病肾病的发病经过、具备2型糖尿病肾病经常合并的肥胖、高血压、高血脂和胰岛素抵抗特点的2型糖尿病肾病动物模型的制备方法。
本发明的技术方案如下 一种2型糖尿病肾病模型的制备方法， 步骤1挑选研究大鼠选择6周龄雄性SHR大鼠，所述雄性SHR大鼠出生时血压正常，4周时血压开始上升， 步骤2高糖高脂饲料喂养诱导胰岛素抵抗对由步骤1选择的雄性SHR大鼠经过适应性喂养一周后，予以高糖高脂饲料喂养2周，检测体重、血脂、血糖和胰岛素浓度，计算稳态模型评价的胰岛素抵抗指数，如果胰岛素抵抗指数≥3.8，则进入步骤3，所述高糖高脂饲料的组分及质量配比如下 猪油10.0％，蔗糖20.0％，胆固醇2.5％，胆酸盐1.0％，常规饲料66.5％， 步骤3腹腔注射小剂量的STZ对胰岛素抵抗雄性SHR大鼠禁食12小时后予以小剂量STZ(35mg/kg)一次性腹腔注射，所述小剂量为35mg/kg，72小时测随机血糖，以血浆葡萄糖≥16.7mmol/L为2型糖尿病造模成功。
本发明通过高糖高脂喂养联合小剂量STZ注射自发性高血压大鼠(SHR)诱导出具有胰岛素抵抗、高血压、高血脂、蛋白尿和足细胞损伤的新型2型糖尿病肾病模型。
发明的优点具有操作简单、经济实用、造模成功率高等特点，而且能模仿人类2型糖尿病肾病的发病经过，具备2型糖尿病肾病经常合并的肥胖、高血压、高血脂和胰岛素抵抗等特点，病理学检查符合2型糖尿病肾病的病理变化。产生此优点的原因与以下因素有关1.研究对象的选择。我们选择6周龄的自发性高血压雄性大鼠作为研究对象，而且其本身无明显原发性肾脏或肾上腺损伤，雄性SHR大鼠较雌性更容易患病。2.诱导胰岛素抵抗采用高糖联合高脂饲料喂养2周，结果其体重增加，无明显的高血糖，胰岛素浓度增加，计算HOMA-IR，结果显示成功诱导出胰岛素抵抗。3.小剂量STZ单次腹腔注射在成功诱导出胰岛素抵抗后，予以禁食12小时后而不是随机用小剂量STZ，这样更容易破坏胰腺部分功能，而不至于破坏全部胰腺功能，造成胰岛素相对缺乏，符合2型糖尿病的发病特点。
图1是本发明的流程图。
图2是各组大鼠血压变化情况图(*P＜0.01VS WKY)。
图3是造模8周后对照组与模型组光镜病理变化图(PAS×400)。
图4是造模8周后扫描电镜观察结果图(×8,000)。
图5是造模8周后透射电镜观察结果图(×15,000)。
具体实施例方式 实施例 一种2型糖尿病肾病模型的制备方法， 步骤1挑选研究大鼠选择6周龄雄性SHR大鼠，所述雄性SHR大鼠出生时血压正常，4周时血压开始上升， 之所以选择6周龄SHR大鼠其作为本实验的研究对象，是因为SHR大鼠属于自发性高血压模型，源于东京远交系Wistar大鼠，高血压发生率高，且无明显原发性肾脏或肾上腺损伤，同时由于雄性SHR大鼠较雌性更容易患病，其出生时血压正常，4周时血压开始上升； 步骤2高糖高脂饲料喂养诱导胰岛素抵抗对由步骤1选择的雄性SHR大鼠经过适应性喂养一周后，予以高糖高脂饲料喂养2周，检测体重、血脂、血糖和胰岛素浓度，计算稳态模型评价的胰岛素抵抗指数(homeostasis modelassessment estimate of insulin resistance，HOMA-IR)，如果胰岛素抵抗指数≥3.8，则进入步骤3，所述高糖高脂饲料的组分及质量配比如下 猪油10.0％，蔗糖20.0％，胆固醇2.5％，胆酸盐1.0％，常规饲料66.5％，所谓猪油，又称大油、荤油，在西方被称为猪脂肪。猪油色泽白或黄白，具有猪油的特殊香味，所谓普通饲料可以从市场上直接购买得到，例如可从江苏协同医药生物工程有限公司购买获得， 步骤3腹腔注射小剂量的STZ对胰岛素抵抗雄性SHR大鼠禁食12小时后予以小剂量STZ(35mg/kg)一次性腹腔注射，所述小剂量为35mg/kg，72小时测随机血糖，以血浆葡萄糖≥16.7mmol/L为2型糖尿病造模成功。
验证例 6周龄SHR雄性大鼠11只，适应性喂养一周，予以高糖高脂饲料喂养二周后，检测体重，血糖和血脂，计算稳态模型评价的胰岛素抵抗指数(homeostasismodel assessment estimate of insulin resistance，HOMA-IR)。结果体重为(205.65±15.52)g，甘油三酯为(1.01±0.33)mmol/L，胆固醇为(2.41±0.31)mmol/L，血糖为(6.94±1.00)mmol/L，HOMA-IR为5.03±0.38，显示其存在胰岛素抵抗。接下来，对胰岛素抵抗大鼠禁食12小时，予以小剂量STZ(35mg/kg)一次性腹腔注射，72小时后，断尾取血，检测随机血糖，平均3次，以血浆葡萄糖≥16.7mmol/L为糖尿病造模成功。8周后，检测血糖为(24.29±4.47)mmol/L，糖化血红蛋白为(12.82±0.52)％，尿蛋白定量为(57.58±16.54)/24小时，血压为(183±17)mmHg，以上符合糖尿病肾病的临床特点，病理检查示肾脏肥大指数为(5.67±0.81)mg/g，光镜和电镜检查显示肾小球肥大，肾小球系膜基质增加，足细胞融合，肾小球基底膜增厚，符合糖尿病肾病的病理学改变。最终9只成功，造模成功率为81.8％。
有关指标测定方法如下采取套尾法测量收缩压；自动血糖检测仪检测血糖，自动生化仪分析肾功能，血脂；放免法(RIA)检测血清胰岛素浓度；酶联免疫法测尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)；采用全自动糖化血红蛋白检测仪检测糖化血红蛋白。HOMA-IR＝FI(空腹血清胰岛素浓度μU/mL)×FG(空腹血浆葡萄糖浓度mmol/L)/22.5。采用光镜和电镜检查肾组织病理变化情况。
对比试验 1.挑选合适研究对象模型组6周龄SHR雄性大鼠，体重180-200g。对照组WKY大鼠，体重、周龄相当。饲养环境温度(20±2)℃，分笼饲养，标准颗粒饲料喂养，自由摄水，12小时交替照明，适应性喂养一周。
2.高糖高脂饲料喂养诱导胰岛素抵抗 所有大鼠经过适应性喂养一周后，SHR大鼠予以高糖高脂饲料喂养(饲料组成10.0％猪油，20.0％蔗糖，2.5％胆固醇，1.0％胆酸盐，66.5％常规饲料)2周，检测体重、血脂、血糖水平，与对照组大鼠相比，体重、血脂增加，有统计学差异。虽然血糖增加，但未达到糖尿病诊断标准。计算稳态模型评价的胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment estimate of insulin resistance，HOMA-IR)，结果为5.03±0.38，显示其存在胰岛素抵抗。WKY大鼠仍用标准颗粒饲料喂养2周，检查结果为2.61±0.34，未有胰岛素抵抗。
3.腹腔注射小剂量的STZ 对胰岛素抵抗SHR大鼠禁食12小时后予以小剂量STZ(35mg/kg)一次性腹腔注射，72小时后，断尾取血，以自动血糖仪检测随机血糖，平均3次，以血浆葡萄糖≥16.7mmol/L为糖尿病造模成功。
4.临床参数、生化指标和组织病理学分析 采取套尾法测量收缩压；自动血糖检测仪检测血糖，日立自动生化仪分析肾功能，血脂；放免法检测血清胰岛素浓度；酶联免疫法测尿白蛋白排泄率(urinaryalbumin excretion rate，UAER)；采用全自动糖化血红蛋白检测仪检测糖化血红蛋白。采用光镜和电镜(扫描电镜和透射电镜)检查肾组织病理变化情况。
结果 表1高糖高脂饲料喂养2周对SHR大鼠体重及生化参数的影响(x±s)
注*p＜0.05VS正常饲料喂养组 表2造模后8周模型组与正常对照组有关参数比较(x±s)
*P＜0.05 VS正常对照组，**P＜0.01 VS正常对照组 两组大鼠血压变化情况 造模时对照组(WKY)大鼠血压平均为(106±10)mmHg，模型组(SHR)大鼠血压为(147±13)mmHg，造模4周及8周后，对照组大鼠血压变化不大，模型组大鼠血压进行性升高，实验结束时达到(183±17)mmHg，符合糖尿病肾病合并高血压的特点(图2)。
肾组织病理变化 光学显微镜检查，与正常对照组大鼠相比，造模后8周模型组大鼠肾小球体积增大，基底膜增厚和系膜基质增多，毛细血管袢开放不良，大量胶原沉积(PAS染色×400，图3上，Masson染色×400，图3下)。
电子显微镜检查显示，对照组大鼠足突结构完整，基底膜光整，未有融合及空泡样变性，而模型组足细胞足突增宽，融合变平，排列紊乱，部分空泡变性，线粒体肿胀，细胞外基质增多，肾小球基底膜增厚(扫描电镜×8000，透射电镜×15000，图4，5)。
权利要求
1.一种2型糖尿病肾病模型的制备方法，其特征在于，
步骤1挑选研究大鼠选择6周龄雄性SHR大鼠，所述雄性SHR大鼠出生时血压正常，4周时血压开始上升，
步骤2高糖高脂饲料喂养诱导胰岛素抵抗对由步骤1选择的雄性SHR大鼠经过适应性喂养一周后，予以高糖高脂饲料喂养2周，检测体重、血脂、血糖和胰岛素浓度，计算稳态模型评价的胰岛素抵抗指数，如果胰岛素抵抗指数≥3.8，则进入步骤3，所述高糖高脂饲料的组分及质量配比如下
猪油10.0％，蔗糖20.0％，胆固醇2.5％，胆酸盐1.0％，常规饲料66.5％，
步骤3腹腔注射小剂量的STZ对胰岛素抵抗雄性SHR大鼠禁食12小时后予以小剂量STZ(35mg/kg)一次性腹腔注射，所述小剂量为35mg/kg，72小时测随机血糖，以血浆葡萄糖≥16.7mmol/L为2型糖尿病造模成功。
全文摘要
一种2型糖尿病肾病模型的制备方法，选择6周龄雄性SHR大鼠，所述雄性SHR大鼠出生时血压正常，4周时血压开始上升；对由步骤1选择的雄性SHR大鼠经过适应性喂养一周后，予以高糖高脂饲料喂养2周，检测体重、血脂、血糖和胰岛素浓度，计算稳态模型评价的胰岛素抵抗指数，胰岛素抵抗指数≥3.8，高糖高脂饲料的组分及质量配比如下猪油10.0％，蔗糖20.0％，胆固醇2.5％，胆酸盐1.0％，常规饲料66.5％；对胰岛素抵抗雄性SHR大鼠禁食12小时后予以小剂量STZ(35mg/kg)一次性腹腔注射，小剂量为35mg/kg，72小时测随机血糖，以血浆葡萄糖≥16.7mmol/L为2型糖尿病造模成功。
文档编号A01K67/027GK101766149SQ20101010360
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者刘必成, 戴厚永 申请人:东南大学