一种免疫佐剂组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种疫苗用佐剂组合物，该佐剂包括丙烯酸系聚合物和草分枝杆菌培养物的水溶液，可以作为疫苗佐剂和免疫增强剂的用途。
【专利说明】
-种免疫佐剂组合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物制品技术领域，设及免疫佐剂组合物。
【背景技术】
[0002] 抗原被定义为外来物质，当给予时，如经非胃肠道给予时，会引发免疫反应，包括 引发抗体产生。抗体是包含于血液和其它体液和组织中的物质，它与抗原结合而使之变为 无害。抗体构成了身体的天然防御机制之一。它们具有很高的特异性，并可杀死、结合或使 引发抗体形成的抗原变为无害。已知能通过疫苗来给予特异性抗原而故意刺激免疫反应。 该方法使机体发生免疫记忆状态，运保证了机体与抗原接触时更为迅速和有效地产生反 应。
[0003] 可通过给予抗原与称为佐剂的物质的混合物来增加抗原的免疫原性，佐剂可通过 直接对免疫系统的作用或通过修饰抗原的药动学特征来增加对抗原的反应，运样增加抗原 与免疫系统的相互作用时间
[0004] 畜禽养殖业的迅猛发展，尤其是集约化饲养规模的日益扩大，使得疾病预防的问 题愈加重要。疫苗接种是预防疾病的最基本、最有效的方法。但是由于各种原因，目前很多 疫苗的免疫效果还不是十分理想，不能对动物提供完全的保护。为了提高疫苗的免疫效果， 人们进行了大量的工作，如通过浓缩抗原提高抗原含量、提高抗原的免疫原性、优化抗原工 艺、采用优质佐剂、优化免疫程序等等来提高疫苗的免疫质量，研究开发新型高效用佐剂是 提高免疫效果的主要方法之一。
[0005] 现有技术存在种类繁多的佐剂和起到免疫增强作用的化合物，如果寻找有相互有 增效作用且适用于多种抗原的组合是本领域技术人所要解决的技术问题。
【发明内容】
[0006] 为解决W上技术问题本发明提供一种免疫佐剂组合物，包含丙締酸系聚合物和草 分枝杆菌培养物。
[0007] 优选地，所述丙締酸系聚合物是丙締酸与聚締丙基薦糖交联的聚合物。
[000引优选地，所述丙締酸系聚合物是烷基-聚丙締酸。
[0009] 优选地，所述烷基-聚丙締酸，佐剂选自由癸基-聚丙締酸、辛基-聚丙締酸、下基- 聚丙締酸和甲基-聚丙締酸组成的群组。
[0010] 草分枝杆菌培养物是草分枝杆菌灭活的全菌体、草分枝杆菌灭活的全菌体的破碎 纯化物、草分枝杆菌的多糖提取物或草分枝杆菌的细胞壁提取物。
[0011] 优选地，所述草分枝杆菌培养物是草分枝杆菌灭活的全菌体。
[0012] 作为本发明的某种实施方式，本发明的佐剂组合物还可W包含左旋咪挫或左旋咪 挫的衍生物。
[0013] 优选地，所述的疫苗组合物中丙締酸系聚合物的浓度为lmg/ml-40mg/ml。更优选 所述的丙締酸系聚合物的浓度是4mg/m -24mg/m 1。
[0014] 优选地，所述的疫苗组合物中草分枝杆菌培养物浓度
[0015] 0. 〇32mg/ml ~0.8mg/ml。再优选 0.7mg/ml。
[0016]优选地，所述的疫苗组合物中所述的左旋咪挫的添加量为化g~2mg/ml。
[0017] 作为本发明的另外一方面，本发明是一种免疫增强剂组合物，包括一种具有丙締 酸系聚合物和草分枝杆菌培养物。
[0018] 作为本发明的另外一个方面，本发明提供一种疫苗组合物，其含有抗原和上述佐 剂组合物。
[0019] 作为本发明的一种实施方式，所述的疫苗组合物为水溶液，含有抗原、一种具有丙 締酸系聚合物和草分枝杆菌培养物。
[0020] 作为本发明的一种优选的实施方式，所述的疫苗组合物为水溶液，含有抗原、一种 具有丙締酸系聚合物、草分枝杆菌培养物和左旋咪挫。
[0021] 作为本发明的另外一种实施方式，本发明的疫苗组合物为油包水剂型，其特征在 于，所述的组合物含有丙締酸系聚合物和草分枝杆菌培养物。
[0022] 作为本发明的一种优选实施方式，本发明的疫苗组合物为油包水剂型，其特征在 于，所述的组合物含有丙締酸系聚合物、草分枝杆菌培养物和左旋咪挫或左旋咪挫的衍生 物。
[0023] 术语"佐剂"是指当连同抗原投与时，使受试者对运一抗原的免疫反应增强的化合 物。佐剂介导的免疫反应增强可通过所属技术领域中已知的任何方法评估，包括(不限于） W下一种或多种方法：（i)与对单独抗原免疫作用起反应所产生的抗体数相比，对佐剂/抗 原组合免疫作用起反应所产生的抗体数增加；（ii)识别抗原或佐剂的T细胞数增加；（iii) 一种或多种I型细胞因子的含量增加;和（iv)活激发之后，体内（in vivo)的保护作用。与经 单独抗原激发的受试者相比，当受试者经抗原与佐剂激发时，若抗原特异性免疫反应性的 任何可测量参数(例如抗体效价或T细胞产生增加至少10%，则认为免疫反应增强。在本发 明的某些实施例中，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数增加至少15%、至少20%、 至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少 65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至少100 %、至少125 %、至少 150%、至少175%、至少200%、至少225%、至少250%、至少275%、至少300 %、至少350%、 至少400%、至少450%、至少500%或至少1000%，则免疫反应增强。
[0024] 佐剂优选是丙締酸系聚合物文中所使用的丙締酸系聚合物是含有丙締酸系部分 的任何聚合物或共聚物。示范性丙締酸系聚合物包括例如聚丙締酸、甲基丙締酸、甲基丙締 酸醋、丙締酷胺、丙締酸醋、丙締腊和聚丙締酸的烷基醋。丙締酸系共聚物的实例包括例如 聚丙締酷胺-共-甲基丙締酸下醋、丙締酸-甲基丙締酸、丙締酸-丙締酷胺和聚甲基丙締酸 醋。市售丙締酸系聚合物的实例包括卡波姆，它是在所属技术领域中通常还指并且已知是 与聚締丙基薦糖交联的丙締酸的水溶性聚合物。
[0025] 丙締酸系聚合物包括中国专利CN95197100.X述的烷基-聚丙締酸Γ烷基-PAA")聚 合物。示范性烷基-PAA聚合物包括癸基-PAA(CIO-PAA)、辛基-PAA(CS-PAA)、下基-PAA(C4- PAA)和甲基-PAA (C1-PAA)。
[00% ] 术语"左旋咪挫或其衍生物"包括左旋咪挫、左旋咪挫衍生物如盐酸左旋咪挫 (Xevamisole Hy化ochloride)或憐酸左旋咪挫(Xevamisole地OS曲ate)中的至少一种；所 述左旋咪P坐化6￥311113〇16，1^[5)又称左咪蜂化-了6吐31111301)或左旋四咪蜂，为四咪蜂的左旋 光学异构体，是一种广谱驱虫药。所述左旋咪蜂或其衍生物还可W包括W下任一产品如 TotalonTM Topical Cattle Anthelmintic(Pitman-Moore，Inc .)、|_θν330Ιθ⑩ (Intervet'Inc·)、TramiSOl⑩（S chering-Plough)、 El"gamiS0l⑩（Janssen Pharmaceuticals，Inc.)、Levamisole Hydrochloride(Bimeda，Inc.)、TYamiSOl? Plus (Fort Dodge Animal Health)、ProhibitTM Soluble Drench Power(Agri laboratories， Ltd.)、Levamisole phosphate(Agri laboratories，Ltd.)、Levamisole Hydrochloride Soluble Pig Wormer(Cross Ve1:pha;rm Group Ltd.)、左旋咪挫原料药（西安帅诺生物科技 有限公司）、盐酸左旋咪挫（陕西汉江药业集团股份有限公司）、盐酸左旋咪挫注射液(广西 南宁市桃源兽药厂）、左旋咪挫搔剂(参见中国专利CN1048399A)。
[0027]术语"疫苗组合物"是可用于在接受者中诱发保护性免疫的组合物。因此，在受试 者已接种抗原之后，疫苗可阻止、延缓或减轻暴露给相同或相关抗原的受试者的疾病发展 严重程度(相对于未接种疫苗的受试者）。通过疫苗所提供的保护性免疫可W是体液(抗体 介导)免疫或细胞免疫，或两者。
[002引术语"抗原"是指当引入受试者中时，可由宿主的免疫系统识别并且能够诱发免疫 反应和产生保护性免疫的药剂。抗原包括(不限于)在病原体的表面或受感染细胞的表面或 肿瘤细胞的表面上天然表达的"表面抗原"。抗原可诱发保护性免疫的疾病病原体和/或病 状的非限制性实例为流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、传染性支气管炎 病毒、鼻病毒属(rhinovi;rus)、副流感病毒、细小病毒属(pa;rvovi;rus)(例如鸭细小病毒）、 腺病毒属(adenovirus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobaccilus pleuropneumoniae)、禽类白 血病、传染性法氏囊病（infectious bursal disease)、呼肠孤病毒属(reovirus)、痘病毒 (pox)、喉气管炎、马立克氏病(Marek^s disease)、破伤风、B型肝炎、追疾、肺炎球菌肺炎、 轮状病毒属(rotavirus)、细小病毒属、冠状病毒属（caronavirus)、大肠杆菌、沙口氏菌属 (Salmonella)。
[0029] 在某些实施例中，抗原是流感病毒，例如经灭活的流感病毒在本
【发明内容】
中可使 用任何经灭活的流感病毒，包括任何经灭活的流感A病毒株(例如禽流感病毒株）。
[0030] 在某些实施例中，抗原是新城疫病毒，例如经灭活的新城疫病毒La So化株或基因 改造后新城疫基因 νπ型毒株。
[0031] 可在本
【发明内容】
中用作抗原的示范性灭活流感病毒包括具有Η1、Η5、Η7或朋血球 凝集素与N1、N2、N3、M、N5、N6、N7、N8或N9中任一者组合的病毒。一般来说，抗原的血球凝集 素亚型是基于通过循环传染性流感病毒株所呈现的血球凝集素亚型加 W选择。
[0032] 其它组分在本发明的某些实施例中，疫苗组合物可包括一种或多种其它组分，诸 如表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物
[0033] 油溶性表面活性剂包括阿拉塞83(脱水山梨醇倍半油酸醋）、阿拉塞A(二缩甘露醇 单油酸醋，）、阿拉塞80、司本80(脱水山梨醇单油酸醋）、L121泊洛沙姆(poloxamer)401(普 朗尼克L121;己斯夫公司）。
[0034] 水溶性表面活性剂包括吐溫80。
[0035] 水相可包括pH缓冲组分(诸如PBS(憐酸盐缓冲生理盐水））、防腐剂(例如，对径基 苯甲酸甲醋或对径基苯甲酸丙醋或山梨酸、硫柳隶）、调味剂、着色剂和甜味剂。
[0036] 乳剂可通过包含一种或多种稳定剂化合物来达成稳定。稳定剂的类别包括聚合物 稳定剂和低分子量稳定剂。聚合物稳定剂在界面处形成本体相凝胶或其它结构并且使一个 或多个界面的粘度增加。聚合物稳定剂包括(不限于)蛋白质、淀粉、树胶、纤维素制品、聚乙 締醇、聚丙締酸和聚乙締化咯烧酬。运些物质通过共价键或通过静电和疏水性相互作用结 合于界面。它们形成"界面络合物"，界面络合物定义为两个或两个W上表面活性分子W任 一本体相中不存在的关系在界面处结合。低分子量稳定剂的实例为(不限于)胆固醇和二价 阳离子的脂肪酸盐，诸如硬脂酸侣。
[0037] 在某些实施例中，本发明提供一种药包或试剂盒，其包含一个或多个装有免疫原 制剂的一种或多种成分的容器。在优选实施例中，用于制备医药组合物或疫苗组合物的试 剂盒包含至少一种抗原、佐剂、油相和水相，所述试剂盒包含存于不同容器中的各组分和任 选地包含指示混合各组分和/或投与组合物的说明书。试剂盒的每个容器任选地还可包括 一种或多种生理学上可接受的载剂和/或赋形剂和/或辅助物质。运些容器中可配合使用由 管制医药或生物产品的制造、使用或销售的政府部口所规定的形式的通知书，所述通知书 反映所述管制制造、使用或销售的部口批准用于投药。
[0038] 本发明的有益效果
[0039] 1)本发明的免疫佐剂组合物各成分之间具有协同作用；
[0040] 2)本发明制备的灭活疫苗可W采用水溶液的形式，本领域技术人员公知，水溶液 可W减少残留降低副反应；
[0041] 3)本发明的免疫佐剂组合物可W作为现有W/0疫苗的免疫增强剂使用，显著提高 疫苗免疫效果。
【具体实施方式】
[0042] 为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，运些实施例仅 起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常 按照常规实验方法进行。
[0043] 本发明中的草分枝杆菌来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，菌 种编号为CGMCC4.il 80。
[0044] 本发明中所用的PH7.2PBS溶液配方为：1000ml蒸馈水中加入化C1 9g、Na2册化· 12出0 6g、rfe出Κ)4· 2出0 0.4g，经121°C高压灭菌30分钟后使用，但该实施方式无论在任何 情况下均不构成对本发明的限定。
[0045] 实施例
[0046] 实施例1、丙締酸的线型烷基醋的制备
[0047] 将1克卡波姆907溶于50毫升相应的正辛醇中，将溶液加热到135°C。加入50微升硫 酸，将反应混合物保持在135°C。通过将反应混合物迅速冷却和加入1体积蒸馈水来停止反 应。然后，将溶液的抑调节到抑=6,在80°C下减压（l〇-6ba)蒸发溶剂。运样得到的产物溶于 蒸馈水，对蒸馈水渗析，然后冻干，得到产物命名为烷基卡波姆907(8)。
[0048] 实施例2、草分枝杆菌培养物的制备
[0049] 草分枝杆菌(Mycobacterium地lei)株置于发酵罐中进行培养，37°C通气培养，pH 值为7.0,培养时间为4天，培养基配方:酵母提取粉Ig，浓缩麦芽汁3ml，葡萄糖25g，憐酸氨 二锭3g，憐酸氨二钟0.8g，注射用水加至1000ml。将发酵液用甲醒溶液(0.1%)灭活后，离屯、 浓缩，弃去上清液，取下层菌体用适量生理盐水重悬浮3次，离屯、除去杂质，测定水分，计算 干菌体重量，与生理盐水均匀后进行高压均质，然后冻干，得到草分枝杆菌培养物。
[0050]实例3:疫苗组合物制备
[0051 ] 3.1制备抗原：按照中国专利CN101607084制备禽流感抗原和新城疫抗原，灭活前 的病毒含量均为l〇8'w化I化〇/〇. 1ml)，本方法制备的抗原不构成对本发明的限定，本领域技 术人员应当理解，采用其他毒株制备的禽流感和新城疫抗原或者采用从商品化的产品依然 能够实现本发明目的。
[0052] 3.2疫苗组合物的制备:按照表1的添加量加入实施例1制备烷基卡波姆907(8)、实 施例2制备的草分枝杆菌培养物W及左旋咪挫，加入3.1制备灭活后的禽流感和/或新城疫 抗原，用PH=7.2的PB幻夜调整体积至100ml。室溫下揽拌30分钟，混匀
[0053] 表1、疫苗组合物的制备 [0化4]
[0055] 实施例4、疫苗的效力试验
[0056] 采用血清学方法进行鸡新城疫部分效力检验。用30~60日龄SPF鸡85只，未免疫对 照组5只，疫苗试验组每组10只。试验组每只鸡肌肉注射实施例3制备的疫苗1、疫苗2、疫苗 3、疫苗4、疫苗组5、疫苗6、疫苗8各20μ1。疫苗对照组采用中国专利CN101607084实施例方法 制备的w/0佐剂疫苗，每只鸡肌肉注射各20μ1。接种后21日，每只鸡各采血，分离血清，进行 HI抗体效价测定，免疫组HI抗体效价的几何平均值均>41og2未免疫对照组HI抗体效价均 《21og2。结果详见表2。
[0057]表2疫苗组合物的鸡新城疫部分效力检验
[0化引
[0059] 注:表中HI抗体效价为几何平均值
[0060] 新城疫的抗体效价试验结果分析，疫苗2、疫苗3为不合格，证明单用草分枝杆菌培 养物和左旋咪挫，对免疫效果影响不大，而单用烷基卡波姆907(8)为免疫佐剂合格，但抗体 效价低于对照疫苗组，无实际产业化的意义，但使用烷基卡波姆907(8)与草分枝杆菌培养 物组具有明显的增效作用，效果最优的为使用烷基卡波姆907(8)草分枝杆菌培养物左旋咪 挫组，其效果优于传统的w/0佐剂疫苗。
[0061 ]采用血清学方法进行禽流感化9亚型）部分效力检验。用30日龄左右SPF鸡85只，未 免疫对照组5只，疫苗试验组每组10只。试验组每只鸡各肌肉注射实施例3制备的疫苗1、疫 苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗组6、疫苗7各0.3ml。疫苗对照组采用中国专利CN101607084 实施例的方法制备的w/0佐剂疫苗，每只鸡肌肉注射各0.3ml。接种后21日，每只鸡各采血， 分离血清，用禽流感病毒H9亚型抗原测定HI抗体。免疫组HI抗体效价的几何平均值应> 6.51og2，对照组HI抗体效价的几何平均值应《21og2。结果详见表3。
[0062]表3疫苗组合物的禽流感化9亚型)部分效力检验
[0063]
[0064] 注:表中HI抗体效价为几何平均值
[0065] 禽流感的效价试验结果分析，疫苗2、疫苗3为不合格，说明单用草分枝杆菌培养物 和左旋咪挫，对免疫效果影响不大，而单用烷基卡波姆907(8)为免疫佐剂即可合格，但抗体 效价低于对照疫苗组，无实际产业化的意义，但使用烷基卡波姆907(8)与草分枝杆菌培养 物组具有明显的增效作用，效果最优的为使用烷基卡波姆907(8)、草分枝杆菌培养物和左 旋咪挫组，其效果优于传统的w/0佐剂疫苗实施例5、免疫佐剂组合物的各免疫增强剂的添 加浓度选择。
[0066] 实施例5、免疫佐剂组合物的组成和含量试验
[0067] 根据本领域技术人员的理解，免疫佐剂组合物中各组分的用量对免疫效果的影响 较大为了验证本发明免疫佐剂组合物各组分的用量，设计了本试验。
[0068] 按照表4的组合物的各组分的加入量，按照实施例3的配制方法制备疫苗组合物并 按照实施例4的试验方法进行新城疫抗体效价和禽流感抗体效价测定结果见表5和表6。结 果表明在表4所列的浓度范围内佐剂组合物中的各免疫增强剂之间均有增效作用，最优的 组合为烷基卡波姆907(8)、草分枝杆菌培养物和左旋咪挫。
[0069] 表4、疫苗组合物的制备
[0070]
[0073] 注:表中HI抗体效价为几何平均值
[0074] 表6疫苗组合物的禽流感化9亚型)部分效力检验
[0075]
[0076]
[0077] 实施例6、佐剂组合物作为免疫增强剂组合物试验
[0078] 为了验证本发明的佐剂组合物作为免疫增强在W/0疫苗中的应用，设计了本试验。
[0079] 6.1疫苗的制备
[0080] 6.1.1油相制备
[0081] 取注射用白油(杭州石化责任有限公司产品）94份和司本-806份混合后，加硬脂酸 侣2份，加热至透明，经12rC60分钟高压灭菌冷却后备用，即为油相。
[0082] 6.1.2水相制备
[0083] 经灭活检验合格的新城疫和禽流感病毒液(按照中国专利CN101607084制备），按1 :1的比例等量混合，按照表按4% (V/V)加入灭菌后的吐溫-80(广东肇庆超能实业有限公司 产品，批号为20141012)，按照表7的量加入免疫增强剂组合物，充分混合均匀，即成水相。
[0084] 6.1.3乳化取油相3份置油相罐内，开动电机慢速揽拌，然后徐徐加入1份水相，加 完后转入乳化罐中，再W2800r/min乳化40min即可。在乳化终止前加入1%硫柳隶，使其终 浓度为0.01 %。乳化后，取3-5mlW300化/min离屯、15分钟，应不出现分层现象。
[0085] 表7、疫苗中免疫增强剂的添加量
[0086]
[0088]按照实施例4的试验方法对制备的疫苗组合物进行禽流感和新城疫的效价测定结 果见表8和表9。结果表明在本发明的组合物作为免疫增强剂组合物，能显著提高W/0佐剂的 疫苗的抗体效价。
[0089] 表8疫苗组合物的鸡新城疫部分效力检验
[0090]
[0091] 注:表中HI抗体效价为几何平均值
[0092] 表9疫苗组合物的禽流感化9亚型)部分效力检验
[0093]
[0094] W上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用W限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种免疫佐剂组合物，含有丙稀酸系聚合物和草分枝杆菌培养物。2. 根据权利要求1所述的佐剂组合物，其特征在于，所述丙烯酸系聚合物是丙烯酸与聚 烯丙基蔗糖交联的聚合物。3. 根据权利要求2所述的佐剂组合物，其特征在于，其中所述丙烯酸系聚合物是烷基-聚丙烯酸。4. 根据权利要求3所述的佐剂组合物，其特征在于，其中所述烷基-聚丙烯酸佐剂选自 由癸基-聚丙烯酸、辛基-聚丙烯酸、丁基-聚丙烯酸和甲基-聚丙烯酸组成的群组。5. 根据权利要求1-4所述的佐剂组合物，其特征在于，其中所述的丙烯酸系聚合物的浓 度为 lmg/ml-40mg/ml〇6. 根据权利要求5所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的丙烯酸系聚合物的浓度为 4mg/ml-24mg/ml〇7. 根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于，所述的草分枝杆菌培养物是草分枝杆菌灭 活的全菌体、草分枝杆菌灭活的全菌体的破碎纯化物、草分枝杆菌的多糖提取物或草分枝 杆菌的细胞壁提取物。8. 根据权利要求1所述的佐剂组合物，其特征在于，所述的草分枝杆菌培养物的浓度为 O·032mg/ml~O·8mg/ml。9. 根据权利要求1-8任一项所述的佐剂组合物，其特征在于，其还包括左旋咪唑，优选 地，所述的左旋咪唑的添加量为5yg/m 1~2mg/m 1。10. -种疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物含有禽流感抗原和/或新城疫抗 原和/或鸡传染性支气管炎抗原和/或法氏囊抗原以及权利要求1-9所述的佐剂组合物。
【文档编号】A61P31/16GK105879025SQ201510823284
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年11月19日
【发明人】不公告发明人
【申请人】李锁霞