氢氧化铝凝胶-氯化钠复合免疫佐剂及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，具体涉及一种氢氧化铝凝胶?氯化钠复合免疫佐剂及其制备方法和用途。本发明所要解决的技术问题是提供一种性能良好的、新的免疫佐剂。解决该技术问题的技术方案是提供一种复合免疫佐剂。该复合免疫佐剂主要含有氢氧化铝凝胶和化学纯的氯化钠。本发明氢氧化铝凝胶?氯化钠复合免疫佐剂具有方法简便、成本低、免疫活性强、临床安全性高等优点，是一种优秀的针对各种抗原的复合免疫佐剂。本发明的氢氧化铝凝胶?氯化钠复合物作为佐剂制备的肝炎疫苗和肿瘤疫苗具有更强的免疫效果和抗肿瘤效果，特别是促进CD8阳性T细胞的激活和增殖，特异杀伤肿瘤细胞，为疫苗的开发和应用提供了新的选择。
【专利说明】
氨氧化错凝胶-氯化纳复合免疫佐剂及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体设及一种氨氧化侣凝胶-氯化钢复合免疫佐剂及 其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 佐剂是一种非特异性免疫增强剂，作为改善机体对疫苗抗原的免疫应答已经有几 十年应用的历史了。疫苗中加入佐剂目的是为了增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应 答类型，表现为促进抗原的特异性体液免疫和/或细胞免疫，从而可W提高特异性抗体的产 生或/和特异性细胞免疫功能。将抗原与佐剂一起注入机体，可W减少有效免疫接种所需的 抗原量和免疫接种频率，提高早期免疫应答和免疫功能不全者的应答成功率等等。
[0003] W氨氧化侣和憐酸侣为代表的侣佐剂至今仍然是我国被批准合法使用的人用疫 苗佐剂。氨氧化侣还是唯一被美国FDA批准使用的人用佐剂。虽然应用悠久，但是侣盐佐剂 的作用机理目前尚不完全清楚。目前认为有"库存效应"和"免疫刺激效应"两种机制。侣佐 剂吸附抗原后在接种区域形成抗原胆存库，一方面在该处的非特异免疫刺激吸引树突状细 胞巨隧细胞等抗原提呈细胞(APC)识别与内吞;另一方面，在注射局部缓慢释放抗原，延长 了APC与T淋己细胞相互作用的时间，从而提高抗体应答，增强体液免疫。
[0004] 氯化钢对于地球上的生命非常重要，无论是在生活，工业还是医学上都广泛应用。 生活中饮食所需的食盐和医学上使用的生理盐水注射液的主要成分都是氯化钢。它具有获 取方便，价格便宜和安全性高等优点。
[0005] 随着新型佐剂的飞速发展，传统佐剂已经越来越无法满足疫苗的需求。大量的临 床免疫试验认为氨氧化侣胶体佐剂对体液免疫反应具有很强的激发作用，而对细胞免疫反 应的作用较弱。如何提高侣佐剂介导的细胞免疫，既能有效地诱导机体产生体液免疫，又能 有效地诱导细胞免疫则是目前免疫佐剂研究的重点与难点。
[0006] 目前还没有人使用氯化钢与氨氧化侣一起作为复合免疫佐剂，而本领域目前需要 提供新的、性能良好的免疫佐剂，为疫苗的制备提供新的有效选择。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种新的、性能良好的免疫佐剂，为本领域提 供一种新的有效选择。
[000引解决该技术问题的技术方案是提供一种复合免疫佐剂。该复合免疫佐剂主要含有 氨氧化侣凝胶和高于生理水平的氯化钢。
[0009] 其中，上述复合免疫佐剂所述氯化钢化学纯或者化学纯W上的氯化钢。
[0010] 其中，氯化钢在免疫佐剂中的用量为高于生理水平是指在最终佐剂-抗原复合物 溶剂中氯化钢的质量分数高于0.9%。该最终质量分数指免疫佐剂与抗原的复合物在注射 使用前的浓度。
[0011] 其中，上述复合免疫佐剂中所述氯化钢的最终质量分数为1.2%~7.2%。进一步 的，上述复合免疫佐剂中所述氯化钢的最终质量分数为2.7%~4.5%。优选的，上述复合免 疫佐剂中所述氯化钢的最终质量分数为3.6 %。
[0012] 其中，上述的质量分数是指在每100毫升佐剂-抗原复合物溶剂中氯化钢的质量 (克)。
[0013] 其中，上述复合免疫佐剂中所述氨氧化侣凝胶的颗粒粒径范围为Ιμπι~ΙΟμπι。优选 的，所述氨氧化侣凝胶的颗粒粒径范围为2WI1~6μπι。粒径3WI1左右为佳。本发明另外还提供 了上述复合免疫佐剂添加抗原形成的免疫佐剂/抗原复合物。免疫佐剂/抗原复合物在本领 域也可称为疫苗。
[0014] 其中，上述免疫佐剂/抗原复合物中所述抗原与复合免疫佐剂中氨氧化侣的重量 配比为1:1~100。进一步的，抗原与复合免疫佐剂中氨氧化侣的重量配比为1:5~50。
[0015] 其中，上述免疫佐剂/抗原复合物中所述抗原为乙型肝炎表面抗原或肿瘤抗原。进 一步的，上述的肝炎抗原为皿SAg。进一步的，上述的肿瘤抗原可选自NY-ES0-1;人黑色素瘤 相关抗原评100;黑色素 mage-1或癌胚抗原等常用的肿瘤抗原。
[0016] 本发明另外还提供了制备上述的免疫佐剂/抗原复合物的方法。该方法包括W下 步骤：
[0017] a、取所需抗原用水稀释或溶解；
[001引b、加入所需的氯化钢，混匀；
[0019] C、加入所需量的氨氧化侣凝胶，混匀。
[0020] 进一步的，上述的所需抗原为乙型肝炎表面抗原或肿瘤抗原。
[0021] 进一步的，上述的肝炎抗原为皿SAg。
[0022] 进一步的，上述的肿瘤抗原可选自NY-ES0-1;人黑色素瘤相关抗原评100;黑色素 mage-1或癌胚抗原等常用的肿瘤抗原。
[0023] 上述技术方案中的质量分数是指在每100毫升佐剂-抗原复合物溶剂中氯化钢的 质量(克）。
[0024] 本发明同时提供了上述免疫佐剂/抗原复合物在制备疫苗中的用途。所述疫苗为 预防和/或治疗性疫苗。比如当抗原为皿sAg等肝炎抗原时，可W制备成为肝炎疫苗，比如当 抗原为OVA或者肿瘤特异性抗原时，可W制备预防和/或治疗性肿瘤疫苗。本发明所述疫苗 可W通过皮下、腹腔或肌肉等方式注射给药，对个体进行免疫。当然也可W采用本领域的其 他可用方式进行免疫，或者是多种方式的组合。并且本发明所述疫苗可W有不同的免疫时 间间隔。可W给药一次，也可W多次。具体实施过程中可W根据实际情况改变或者调整免疫 次数和免疫时间点。
[0025] 为了构建好的可用于免疫佐剂的氨氧化侣-氯化钢复合佐剂，考察了多种氨氧化 侣-氯化钢配方。本发明对不同质量分数的氯化钢进行筛选，发现使用质量分数3.6%的氯 化钢与氨氧化侣的复合物作为佐剂制成的疫苗效果最好。在肝炎疫苗模型中，体内产生了 针对皿sAg的高滴度的抗体和IFN- 丫；在肿瘤疫苗模型中，分别通过预防性免疫和治疗性免 疫实验证明，体内产生了针对OVA的抗体和激活了特异性CD8杀伤性T细胞，增加了 IFN- 丫的 分泌，能有效抑制肿瘤生长。
[0026] 同时，本发明提供了氯化钢在制备免疫佐剂中的用途。
[0027] 其中，上述用途中所述的免疫佐剂里还有氨氧化侣凝胶。
[00%]其中，上述用途中所述氯化钢在免疫佐剂中的用量为高于生理水平。
[0029] 其中，上述用途中所述氯化钢在免疫佐剂中的用量为使其制备得到的免疫佐剂与 抗原的复合物中的氯化钢质量分数为1.2%~7.2%。该浓度为免疫佐剂与抗原的复合物在 注射使用前的浓度。
[0030] 同时，本发明也提供了氯化钢在制备免疫佐剂-抗原复合物中的用途。
[0031] 其中，上述用途中免疫佐剂-抗原复合物中还含有氨氧化侣凝胶作为佐剂。
[0032] 其中，上述用途中氯化钢的含量为质量分数1.2%~7.2%。该浓度为免疫佐剂与 抗原的复合物在注射使用前的浓度。
[0033] 其中，上述用途中抗原与氨氧化侣的重量配比为1:1~100。
[0034] 其中，上述用途中抗原与复合免疫佐剂中氨氧化侣的重量配比为1:5~50。
[0035] 其中，上述用途中所述抗原为肿瘤抗原或肝炎抗原。
[0036] 本发明还提供了疫苗的配制方法。该方法的步骤为在疫苗使用前，加入氯化钢和 适量注射用水，并使氯化钢在待注射的疫苗体系中的质量分数达到1.2%~7.2%。优选的 氯化钢在待注射的疫苗体系中的质量分数达到2.7%~4.5%。最优的为3.6%。
[0037] 其中，上述方法中所述疫苗含有抗原和氨氧化侣凝胶。
[0038] 其中，上述方法中23、根据权利要求21所述的疫苗配制方法，其特征在于:所述疫 苗中抗原与氨氧化侣的重量配比为1:1~100。
[0039] 需要说明的是，本发明中所述的抗原与氨氧化侣的重量配比是指抗原与氨氧化侣 凝胶中的氨氧化侣纯物质的比例。
[0040] 本发明得到了新型的疫苗佐剂，氨氧化侣凝胶-氯化钢复合免疫佐剂，可适用于肝 炎等传染病疫苗和肿瘤疫苗的研发。其作用机制初步分析可能为氨氧化侣凝胶中侣盐与 抗原结合形成抗原胆存库，使抗原得W缓慢稳定地释放，侣盐佐剂能诱导、激发体液免疫； 高渗氯化钢则能激活M〇、NK、DC等免疫细胞活性，激活MPK信号通路，促进DC的成熟与抗原 摄取或者交叉递呈。运样既可W激发体液免疫，又能够激发细胞免疫。
[0041] 本发明的有益效果为:本发明创造性地开发出了氨氧化侣-氯化钢复合免疫佐剂， 具有免疫活性强、临床安全性高等优点，和单独的氨氧化侣相比引起了特异性的细胞免疫 反应，是一种优秀的针对各种抗原的氨氧化侣-氯化钢复合免疫佐剂。试验表明，使用本发 明的氨氧化侣-氯化钢作为佐剂制备疫苗，可具有更高的免疫效果和抗肿瘤效果，为疫苗的 开发和应用提供了新的选择。
【附图说明】
[0042] 图1是皿sAg蛋白与氨氧化侣凝胶-氯化钢复合物免疫后，各组小鼠的抗体滴度产 生情况。
[0043] 图2是皿sAg蛋白与氨氧化侣凝胶-氯化钢复合物免疫后，ELISA检测淋己细胞产生 IFN- 丫的情况。
[0044] 图3是疫苗预防性实验中，OVA-氨氧化侣凝胶-氯化钢复合物免疫后，各组小鼠的 肿瘤生长曲线比较。
[0045] 图4是疫苗治疗性实验中，OVA-氨氧化侣凝胶-氯化钢复合物免疫后，各组小鼠的 肿瘤生长曲线比较。
[0046] 图5是疫苗预防性实验中，OVA-氨氧化侣凝胶-氯化钢复合物免疫后，各组小鼠的 生存期。
[0047] 图6是疫苗预防性实验中，OVA-氨氧化侣凝胶-氯化钢复合物免疫后，各组小鼠的 成瘤率。
[0048] 图7是OVA与氨氧化侣凝胶-氯化钢复合物免疫后，各组小鼠的抗体滴度产生情况。
[0049] 图8是OVA与氨氧化侣凝胶-氯化钢复合物免疫后，ELISA检测淋己细胞产生IFN-丫 的情况。
[0050] 图9是OVA与氨氧化侣凝胶-氯化钢复合物免疫后，疫苗可W诱导针对肿瘤细胞的 特异性CTL反应。
[0051] 图10是OVA与氨氧化侣凝胶-氯化钢复合物免疫后，分离小鼠脾脏中的T淋己细胞 用于细胞过继治疗的肿瘤生长曲线。
【具体实施方式】
[0052] 下面结合附图对本发明作进一步的描述说明。W下实施中将进一步说明该疫苗的 制备和使用方法。本发明包括但不限于W下实施中所列举的具体方法步骤。
[0053] 本发明创造性地发现氨氧化侣凝胶-氯化钢组合作为复合佐剂，既能有效地诱导 机体产生体液免疫，又能有效地诱导细胞免疫。
[0054] 本发明复合佐剂采用了两种成分:其中氨氧化侣凝胶佐剂，是一种无机盐佐剂，具 有良好的蛋白吸附作用，能将可溶性抗原吸附于侣胶分子表面;也可W浓缩抗原，减少注射 剂量。氨氧化侣凝胶成本低廉、使用方便、无毒，是应用最广的一种佐剂，也是至今唯一被美 国抑A批准可用于人类疫苗的佐剂。而氯化钢在生活，工业及医学上广泛应用。
[0055] 经过进一步的筛选试验，本发明复合佐剂中所述氯化钢用量为使氯化钢的最后质 量分数大于生理浓度就能取得免疫效果的提高。在1.2%~7.2%免疫效果的提高较为明 显。优选3%~4%能有更好的免疫佐剂的效果。本发明实验中最好的效果是3.6%。本发明 中氯化钢的质量分数是指在每100毫升抗原佐剂复合物溶剂中氯化钢的质量(克）。
[0056] 本发明在氨氧化侣型乙型肝炎疫苗的基础上添加氯化钢佐剂，获得了更高的抗体 滴度和IFN-丫的分泌增加;还采用氨氧化侣凝胶-氯化钢新型佐剂制备了一种新型OVA疫 苗，并证实了运一新型佐剂疫苗抗EG.7淋己癌的有效性。
[0057] 氨氧化侣凝胶一般使用为粒径范围为Ιμηι~lOwii的氨氧化侣胶体颗粒。优选为粒 径2皿~6皿的氨氧化侣颗粒。当然，可能在于不同的抗原配合时，氨氧化侣凝胶中颗粒的粒 径的优选值会有一定合理的变化。优选为粒径3WI1左右的氨氧化侣颗粒。
[005引而经过筛选，上述抗原与复合免疫佐剂中氨氧化侣的重量配比为1:1~100,优选 1:5~50。
[0059] 显然，本领域技术人员在使用不同抗原制备疫苗时，可W在上述范围内合理调整 氯化钢的质量分数。也可W根据需要合理调整复合免疫佐剂中抗原用量及氨氧化侣凝胶和 抗原的重量配比。
[0060] 比如，本发明的实施例中，当使用HBsAg作为抗原时，免疫佐剂/抗原复合物中 皿sAg用量为化g，抗原和氨氧化侣凝胶的重量配比可为1:5~1:100,最优选为1:25。
[0061] 使用OVA时，免疫佐剂/抗原复合物中OVA用量为化g，抗原和氨氧化侣凝胶的重量 配比可为1:5~1:50,最优选为1:25。
[0062] 在上述技术的基础上，还发展出一种新的疫苗配制方法。该方法的步骤为在疫苗 使用前，加入氯化钢和适量注射用水配制成待注射的疫苗体系，并使氯化钢在待注射的疫 苗体系中的质量分数达到1.2%~7.2%。优选的，氯化钢在待注射的疫苗体系中的质量分 数达到2.7%~4.5%。最优的为3.6%。其中，所述疫苗含有抗原和氨氧化侣凝胶。进一步 的，抗原与氨氧化侣的重量配比为1:1~100。本发明中的氨氧化侣凝胶可W是目前市售的 氨氧化侣免疫佐剂，也可W是目前临床根据《中国药典》配制的氨氧化侣胶体佐剂。
[0063] 实施例一:复合佐剂的筛选及制备
[0064] 实验材料及试剂:氨氧化侣佐剂(A化ydroge 1，氨氧化侣凝胶)购自美国Invi voGen (白色悬浊液，lOmg/mL，粒径3皿）
[00化]乙型肝炎表面抗原（皿sAg)购自美国ARP公司（American Rearch Products)，氯化 钢(NaCl)与卵白蛋白（OVA)购自美国Sigma公司。
[0066] 制备上述的免疫佐剂~抗原复合物的方法包括W下步骤：
[0067] a取所需抗原化BsAg或OVA)用水稀释或溶解；
[0068] b加入所需的氯化钢，混匀；
[0069] C加入所需量的氨氧化侣凝胶，混匀。
[0070] 经过进一步的筛选试验，所述氯化钢的最后质量分数为1.2%~7.2%，优选3.6% 能有最好的免疫佐剂的效果。本发明中氯化钢的质量分数是指在每100毫升抗原佐剂复合 物溶剂中氯化钢的质量(克）。
[0071] 而经过筛选，上述抗原与复合免疫佐剂中氨氧化侣的重量配比为1:1~100,优选 1:5~50。
[0072] 当使用皿sAg作为抗原时，免疫佐剂/抗原复合物中皿sAg用量为化g，抗原和氨氧 化侣凝胶的重量配比可为1:5~1:100,最优选为1:25。
[0073] 使用OVA作为抗原时，免疫佐剂/抗原复合物中OVA用量优选为扣g，抗原和氨氧化 侣凝胶的重量配比可为1:5~1:50,最优选为1:25。
[0074] 实施例二:本发明使用氯化钢作为乙肝疫苗佐剂的动物免疫试验
[0075] 实验材料及试剂:氨氧化侣佐剂，氯化钢，HBsAg同实施例一;C57化/6小鼠购自北 京维通利华公司；乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒(万泰生物药业）；IFN- 丫的化ISA试剂 盒（美国eBioscience公司）；淋己细胞分离液（中国达科为试剂公司）；70μπι尼龙网过滤器 (美国BD公司）；圆底24孔板(NUNK)。
[0076] 实验动物按如下分组：1、Control; 2、冊sAg; 3、HbsAg/Al (0Η)3 ;4、HbsAg/Al (0Η)3/ 1.8%化Cl; 5、冊sAg/Al (0H)3/3.6%NaCl; 6、冊sAg/Al (0H)3/7.2%NaCl;所有分组中HbsAg 为化g，Al(0H)3为2扣g，HbsAg和A1(0H)3的重量配比1:25。每组5只。于第0,2,3周肌肉免疫， 第4周收集血清及脾脏淋己细胞用于如下实验。
[0077] (一)抗体滴度的检测
[007引通过化ISA试剂盒(万泰生物药业)检测各组小鼠血清中的抗体滴度。血清样品用5 %脱脂奶粉做等二倍稀释。各组抗体滴度的检测结果见图1。单独皿sAg组几乎不能产生抗 体。单独使用A1(0H)3组和A1(0H)3+氯化钢复合佐剂组均能有效刺激抗体的产生。而A1(0H)3 +氯化钢复合佐剂相比于单独使用A1(0H)3组能产生更高的抗体滴度，并且在氯化钢质量分 数为3.6 %时达到最高值。
[0079] (二)细胞因子IFN-丫的测定
[0080] IFN- 丫的测定采用化ISA试剂盒(eBioscience公司）进行。具体如下：小鼠末次免 疫后一周处死，取出脾脏。将脾脏放在200目尼龙网上研磨，培养基（1640+10%FBS+双抗生 素）混悬，用小鼠淋己细胞分离液分离淋己细胞，测定细胞密度，将细胞数稀释至5X106细 胞/ml。24孔板中每孔加入50化1细胞液，再加入扣g HBsAg刺激，置于C〇2解箱培养48小时， 用ELISA检测试剂盒测定培养上清IFN- 丫的浓度。
[0081 ]实验结果见图2,单独皿sAg基本没有IFN-丫的分泌;加入A1(0H)3佐剂后有极少量 IFN- 丫分泌;采用A1 (0H)3+氯化钢复合佐剂组有较高IFN- 丫分泌，P<0.01，复合佐剂组的 效果最佳。结果显示，氯化钢能有效刺激机体的体液免疫和细胞免疫。
[0082] 实施例本发明使用氯化钢作为OVA佐剂的动物免疫试验
[0083] 实验材料及试剂:氨氧化侣佐剂，氯化钢，OVA同实施例一;小鼠，IFN- 丫的化ISA试 剂盒，淋己细胞分离液，7化m尼龙网过滤器，圆底24,96孔板同实施例二；小鼠淋己癌细胞 EG. 7(美国ATCC);船251化〇4(美国化rki址Imer公司）。
[0084] ( - )本发明新型佐剂对小鼠移植瘤生长的预防及治疗性实验
[0085] 预防性实验：C57小鼠随机分为4组：l、Con化〇1 2、0VA 3、0VA/A1(0H)3 4、0VA/A1 (0H)3/3.6%化Cl;其中所有分组中OVA为化g，Al(0H)3为125yg，0VA和A1(0H)3的重量配比1: 25。每组10只，分别在第0,2,3周在各组小鼠的左背侧皮下注射疫苗。在最后一次免疫后第7 天，在小鼠的右侧皮下接种小鼠淋己瘤细胞3乂10^只，建立小鼠移植瘤模型，每3天测量一 次小鼠的肿瘤体积。
[0086] 治疗性实验：小鼠按如上随机分为4组，在小鼠的右侧皮下接种小鼠淋己瘤细胞3 X l(yV只，待肿瘤长至可触及时（约3mm，接种后3~5天），小鼠开始按上述预防性实验的4组 分组剂量设计进行皮下免疫治疗，每周1次，连续治疗3次，每3天测量一次小鼠的肿瘤体积。
[0087] 预防性和治疗性实验结果分别见图3和图4,与对照组（Control, OVA)和单独A1 (0H)3佐剂疫苗组相比，A1(0H)3+氯化钢复合佐剂组的肿瘤生长明显得到抑制。其中预防性 实验中，其生存期得到明显延长(图5)，成瘤率明显降低（图6)。
[0088] (二)抗体滴度的测定
[0089] 实验方法及分组同实施例二，如下 1、Control; 2、0VA; 3、0VA/A1 (0H)3 ; 4、0VA/A1 (0H)3/1.8%化 Cl;5、0VA/Al(0H)3/3.6%NaCl;6、0VA/Al(0H)3/7.2%NaCl。其中所有分组中 OVA为扣g，Al(0H)3为125yg，0VA和A1(0H)3的重量配比1:25。每组5只，小鼠最后一次免疫后 第7天收集血清，通过化ISA检测各组小鼠血清中的抗体滴度。血清样品用5%脱脂奶粉做等 二倍稀释。各组抗体滴度的检测结果见图7。单独OVA组几乎不能产生抗体。单独使用A1 (0H)細和A1(0H)3+氯化钢复合佐剂组均能有效刺激抗体的产生。而A1(0H)3+氯化钢复合佐 剂相比于单独使用A1(0H)3组能产生更高的抗体滴度，并且在氯化钢质量分数为3.6%时达 到最高值。
[0090] (Ξ)细胞因子IFN- 丫的测定
[0091 ] IFN- 丫的测定采用自包被ELISA试剂盒(eBioscience公司）进行。具体如下：小鼠 末次免疫后一周处死，取出脾脏。将脾脏放在200目尼龙网上研磨，培养基（1640+10%FBS+ 双抗生素)混悬，用小鼠淋己细胞分离液分离淋己细胞，测定细胞密度，将细胞数稀释至5X ΙΟ6细胞/πιΚ24孔板中每孔加入50化1细胞液，再加入扣g 0VA257~264肤段刺激，置于0)2解 箱培养48小时，用化ISA检测试剂盒测定培养上清IFN- 丫的浓度。
[0092] 实验结果见图8,单独OVA基本没有IFN-丫的分泌；加入A1(0H)3佐剂后有极少量 IFN- 丫分泌;采用A1 (0H)3+氯化钢复合佐剂组有较高IFN- 丫分泌，P<0.01，复合佐剂组的 效果最佳。结果显示，氯化钢能有效刺激机体的细胞免疫。
[0093] (四）新型佐剂疫苗刺激肿瘤特异性的细胞毒性T淋己细胞杀伤功能
[0094] 细胞毒性T淋己细胞杀伤功能检测采用S1化释放试验检测。
[00M]小鼠免疫同预防性模型中所述，最后一次免疫后7天每组随机取3只小鼠。无菌条 件下解剖小鼠，分离脾脏，使用70WI1尼龙网过滤器娠磨分散脾脏细胞，加入淋己细胞分离液 分离制备单个脾脏淋己细胞。将分离的脾脏淋己细胞用培养基清洗3遍，离屯、后重悬，细胞 计数，调整细胞浓度至1 X lOVml，获得的淋己细胞即为效应细胞。
[0096] 收集体外培养的肿瘤细胞E.G7,细胞计数，用培养基将肿瘤细胞的浓度调整至1 X 10Vml，取20化1细胞，加入10化ci化251化化，37°C解育化进行标记，清洗3次后，细胞计数， 将细胞浓度调整至O.SXloVml，获得的siCr标记的肿瘤细胞即为祀细胞。将祀细胞悬液加 入圆底96孔板中，每孔10化1，设3个副孔，按照表1的不同比例加入效应细胞：
[0097] 表 1
[009引
[0099]
[0100] 每孔加入10化1的S1化标记的肿瘤细胞，自然释放组加入1〇化1培养基，最大释放组 加入100μΙ l%Triton X-10(L96孔板水平砖头 1500巧m/min离屯、30s，37°C，5%C〇2解箱中 培养，4~6小时后，96孔板水平砖头1500rpm/min离屯、5min，每孔吸取100μΙ上清， Backmen550B型丫计数仪检测cpm值。
[0101] CTL杀伤率计算公式为：杀伤率％ =〔（实验组cpm-自然释放组cpm)/(对照组cpm- 自然释放组cpm)) X 100%。
[0102] 实验结果显示（参见图9)，A1(0H)3+氯化钢复合佐剂组(0VA/A1/3.6%化Cl)能有 效地诱导的针对肿瘤细胞的特异性CTL反应，并且作用明显优于对照组(Con化ol，0VA)和单 独 A1(0H)3 佐剂组(0VA/A1)。
[0103] (五)新型佐剂疫苗免疫诱导的小鼠 T淋己细胞过继治疗移植瘤
[0104]小鼠右后方注射EG. 7细胞3 ΧΙΟ6/只，建立小鼠移植瘤模型，随机分为4组，每组5 只。在建立小鼠移植瘤模型前一天，后一天和后3天，经尾静脉注射预防性实验中所述获取 的脾脏淋己细胞，1〇7细胞/只，共注射3次，每3天观察小鼠肿瘤体积的变化。
[01化]实验结果显示见图10，同对照组（Con化01，OVA)相比，单独Α1 (0Η)3佐剂组（OVA/ A1)几乎没有抗肿瘤作用，而A1(0H)3+氯化钢复合佐剂组(0VA/A1/3.6%化Cl)具有显著的 抗肿瘤作用。
[0106]由上试验可见，本发明开发的氨氧化侣-氯化钢-抗原体系，使用了超出生理浓度 的适量氯化钢，和单独的氨氧化侣佐剂相比引起了特异性的细胞免疫反应，免疫活性更强。 同时，也具有高的临床安全性，且成本低廉，容易配制，具有很好的应用前景。
【主权项】
1. 复合免疫佐剂，其特征在于:含有氢氧化铝凝胶和氯化钠。2. 根据权利要求1~2任一项所述的复合免疫佐剂，其特征在于:所述氯化钠的最终质 量分数为1.2%~7.2%。3. 根据权利要求1~2任一项所述的复合免疫佐剂，其特征在于:所述氯化钠的最终质 量分数为2.7%~4.5%。4. 根据权利要求1~2任一项所述的复合免疫佐剂，其特征在于:所述氢氧化铝凝胶的 粒径范围为lym~ΙΟμπι。5. 免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于:含有抗原和权利要求1~4任一项所述的复合免 疫佐剂。6. 根据权利要求5所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于:所述抗原与复合免疫佐 剂中氢氧化铝的重量配比为1:1~100。7. 根据权利要求7所述免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于:所述抗原与氢氧化铝的重 量配比为1:5~50。8. 根据权利要求5~6任一项所述的免疫佐剂-抗原复合物，其特征在于:所述抗原为肿 瘤抗原或肝炎抗原。9. 制备权利要求5~9任一项所述的免疫佐剂-抗原复合物的方法，其特征在于包括以 下步骤： a、 取所需抗原用水稀释或溶解； b、 加入所需的氯化钠，混匀； c、 加入所需量的氢氧化铝凝胶，混匀，即得。10. 权利要求1~4任一项所述的复合免疫佐剂在制备疫苗中的用途。11. 氯化钠在制备免疫佐剂中的用途。12. 根据权利要求11所述的用途，其特征在于:所述免疫佐剂中还有氢氧化铝凝胶。13. 根据权利要求11所述的用途，其特征在于:所述氯化钠在免疫佐剂中的用量为高于 生理水平。14. 根据权利要求11所述的用途，其特征在于:所述氯化钠在免疫佐剂中的用量为使其 制备得到的免疫佐剂与抗原的复合物中的氯化钠质量分数为1.2%~7.2%。15. 氯化钠在制备免疫佐剂-抗原复合物中的用途。16. 根据权利要求15所述的用途，其特征在于:所述免疫佐剂-抗原复合物中还含有氢 氧化铝凝胶作为佐剂。17. 根据权利要求15所述的用途，其特征在于:所述氯化钠的含量为质量分数为1.2% ~7.2%〇18. 根据权利要求15所述的用途，其特征在于:所述抗原与氢氧化铝的重量配比为1:1 ~100〇19. 根据权利要求15所述的用途，其特征在于:所述抗原与复合免疫佐剂中氢氧化铝的 重量配比为1:5~50。20. 根据权利要求15~19任一项所述的用途，其特征在于:所述抗原为肿瘤抗原或肝炎 抗原。21. 疫苗的配制方法，其特征在于:在疫苗使用前，加入氯化钠和适量注射用水，并使氯 化钠的质量分数达到1.2%~7.2%。22. 根据权利要求21所述的疫苗配制方法，其特征在于:所述疫苗中含有抗原和氢氧化 铝凝胶，或者在配置时疫苗中加入氢氧化铝凝胶作为佐剂。23. 根据权利要求21所述的疫苗配制方法，其特征在于:所述疫苗中抗原与氢氧化铝的 重量配比为1:1~100。
【文档编号】A61P31/20GK105999260SQ201610318724
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】罗敏, 魏霞蔚, 魏于全
【申请人】四川大学