一种具有主动靶向肿瘤的纳米药物载体-贝伐单抗介导的SiO₂@LDH、制备方法及应用

一种具有主动靶向肿瘤的纳米药物载体-贝伐单抗介导的SiO₂@LDH、制备方法及应用
【专利摘要】本发明涉及一种具有主动靶向肿瘤的纳米药物载体?贝伐单抗介导的SiO2@LDH、制备方法及应用，该载体是以介孔二氧化硅为核心，外层包裹镁?铝双氢氧化物（LDH），并在表面连接贝伐单抗而形成的纳米复合物。该纳米载体可以用于搭载治疗药物，通过贝伐单抗专一性识别和结合由肿瘤过量分泌的血管内皮生长因子VEGF的特性，从而达到对肿瘤的靶向治疗的目的。本发明的药物载体具有较高的安全性、主动靶向性、药物传输效应，且合成方法简单，成本经济，在肿瘤靶向治疗方面具有广阔的应用前景。
【专利说明】
一种具有主动靶向肿瘤的纳米药物载体-贝伐单抗介导的 Si02@LDH、制备方法及应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种具有主动靶向肿瘤的纳米药物载体-贝伐单抗介导的Si02@LDH、 制备方法及应用。【背景技术】
[0002]目前，随着肿瘤发病率的提升，癌症对人类的威胁日益突出。针对癌症的传统治疗方法主要有手术、化疗和放疗，而这些方法对于恶性肿瘤的治疗效果并不能达到预期的效果，而常常伴随着严重的负效应，问题仍需要新的方法来解决。
[0003]由于目前所存在的传统治疗方法以及新提出的以基因治疗、免疫治疗为代表的生物治疗并非只针对肿瘤的特异性治疗，因此无可避免的会给正常细胞、组织和器官造成伤害，而降低治疗的效果。为了解决这一问题，肿瘤靶向治疗这一概念被提出并被广泛研究。 由于近年来纳米技术的蓬勃发展，纳米材料自身的优越性自然被结合利用到肿瘤的靶向治疗，即作为药物、基因、放射性元素等的载体。
[0004]近些年，被广泛研究的靶向纳米传输载体所具有的靶向性多为由实体瘤异于正常组织结构而产生的高通透性和滞留性(EPR效应)引起的被动靶向，缺乏一种主动靶向肿瘤的能力。而使材料获得这种主动靶向能力的主要途径便是修饰抗体或者其他一些肿瘤标志物的配体。研究表明，肿瘤的生长和转移离不开血管的营养和氧气的供给，而血管内皮生长因子对血管生成至关重要，发现在多种恶性肿瘤中过量表达，相对的在正常组织中则较少的被表达。因此，VEGF成为肿瘤靶向治疗的新的靶点，也为纳米药物传输系统设计提供了新的思路。
[0005]介孔Si02和LDH均为常研究的纳米药物载体，被证明具有好的分散性、生物相容性、可修饰性以及pH响应性等特性。单一材料并非完美而好的复合材料的设计多半可以扬长避短。贝伐单抗作为美国H)A批准使用的血管抑制药物，可以保证其生物安全性，而该抗体可以特异性识别VEGF，可作为材料获得主动靶向能力的关键性因素。因此，将这些要素整合在一起，便可制备一种肿瘤靶向药物传输体系。
【发明内容】

[0006]本发明的目的在于提供一种具有主动靶向肿瘤的纳米药物载体-贝伐单抗介导的 Si〇2@LDH、制备方法及应用。
[0007]本发明提出的具有主动靶向肿瘤的纳米药物载体-贝伐单抗介导的Si02@LDH，以介孔二氧化硅为核心，镁铝双氢氧化物(LDH)为包裹层，并在其表面修饰靶向肽重组人源化单克隆抗体贝伐单抗〇^￥3(^2111]^13,4￥381:；[11)，其中:介孔3；[〇2平均粒径为19711111，3；[〇2@0)11 平均粒径为226nm，Si〇2@LDH-Bev平均粒径为270nm。所述材料具有肿瘤特异性靶向，抑制血管生成，尚效低毒等优越性，意图提尚肿瘤治疗效果。
[0008]本发明提出的具有主动靶向肿瘤的纳米药物载体-贝伐单抗介导的Si02@LDH的制备方法，具体步骤如下:(1)Si〇2@LDH 的制备:通过模板剂法，以110_130mL甲醇和90-110mL水的混合液体为体系，以0.8-lg CTAB为模板，0.25-0.5mL TE0S为硅源，在碱性条件下合成介孔硅前体，再通过1，3，5-三甲苯水热法扩孔，除去模板剂后得到介孔Si02;9_13g异丙醇铝在酸性条件(lMHN03，pH3-4)，加热回流，蒸发结晶得到晶体，用90-11 OmL双蒸水溶解，酸性条件下加热回流，得到中间体A100H;将介孔Si02用A100H重悬，搅拌，离心收集，沉淀，用水-无水乙醇交替洗涤6-8次，得到 Si02-A100H；将Si02-A100H与40mL2.4g尿素、1.25g氢氧化镁混合，水热24h后收集沉淀，水-无水乙醇-水洗后，冷冻干燥，得到S1#LDH;(2)5102@〇)11-86￥的制备:100mgSi02@LDH通过100yL氨基硅烷修饰氨基(APTES)，经10mL250mgN-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，200mgl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺化0〇腿3(0.0謂，？册.5)混合溶液活化后，与贝伐单抗进行反应可制得。
[0009] 本发明中，步骤(1)中所述碱性条件为加入0.3-0.711^说他011。[〇〇1〇] 本发明中，步骤(1)中所述1，3，5-三甲苯水热法中采用的乙醇:水:1，3，5-三甲苯的体积比3:2:2。[0011 ]本发明中，步骤(1)中酸性条件为加入1MHN03，控制pH值为3-4。
[0012]本发明所述的纳米药物载体-贝伐单抗介导的Si〇2@LDH作为治疗制剂的应用，所述治疗制剂选择广谱抗癌药物盐酸阿霉素，也可尝试其他药物或基因、疫苗等。[〇〇13]本发明中，以盐酸阿霉素Dox为药物模型，通过物理混合搭载至材料内，通过MTT和细胞周期实验对其进行细胞毒性评估。实验结果表明，Si02@LDH-Bev可以提高药物对肿瘤细胞SH-SY5Y的杀伤作用，并通过进一步提高细胞周期阻滞在G2/M期达到杀死肿瘤的目的， 此外，不涉及正常肝细胞本身对Dox较强的敏感性，Si02@LDH-Bev可以在一定程度保护正常细胞不被药物所伤害。[〇〇14]本发明中，涉及的材料靶向性评价通过以人脑母细胞瘤SH-SY5Y细胞(VEGF阳性细胞)和人正常肝脏L02细胞(VEGF阴性细胞)为细胞模型以及以SH-SY5Y荷瘤小鼠为动物模型进行体外体内肿瘤靶向性评估。实验结果表明Si〇2@LDH-Bev在体内外均具有较好的肿瘤靶向性。【附图说明】[0〇15]图 1 为Si〇2、Si〇2@LDH、Si〇2@LDH-Bev的透射电镜图；其中:(a)为Si02，(b)为Si02@ LDH，(c)为Si〇2@LDH-Bev。[〇〇16]图2为不同药物及浓度对L02细胞和SH-SY5Y细胞的细胞毒性结果(MTT);其中:(a 为材料对L02的细胞毒性分析，(b)为材料对SH-SY5Y的细胞毒性分析。[〇〇17]图3为不同药物对SH-SY5Y细胞的细胞周期影响结果，处理浓度为lyg/mL，其中(a) 为细胞周期分析图，(b)为细胞处于周期各时期定量分析结果。
[0018]图4为激光共聚焦验证Si〇2@LDH-BeV在体外的靶向性结果，处理浓度为lyg/mL，其中(a)为共聚焦图片结果，(b)为定量分析结果。[〇〇19]图5为用于验证Si02@LDH-Bev在体内的靶向性的荧光显微镜分析定量结果，尾静脉注射24h后取组织，浓度为5mg/kg。【具体实施方式】
[0020]下面通过实施例进一步说明本发明。
[0021]实施例l:(l)Si〇2的制备CTAB0.985g溶于100mL甲醇，加入120mL双蒸水，混勾后在液面下加入0.57mLlmol/L NaOH溶液;滴加0.325mLTE0S，搅拌8h后，离心收集沉淀;沉淀用双蒸水-无水乙醇洗后用无水乙醇(15mL)重悬，转移至水热爸中，再加入双蒸水(10mL)、l，3,5_三甲苯(10mL)，混合均匀后，水热箱中140°C水热4天;4天后取出，高速离心收集的沉淀用无水乙醇-双蒸水洗后， 再用无水乙醇重悬后转至三口烧瓶中，加入浓盐酸(v乙醇/V盐酸=5:1 )，加热回流6h;回流结束后高速离心收集沉淀，沉淀用双蒸水-无水乙醇-双蒸水洗，材料最终可用水保存。
[0022](2)中间体A100H的合成异丙醇铝11.3g，放入三口烧瓶中，加入双蒸水100mL，搅拌溶解后用lmol/LHN03调节溶液pH至3-4; 85°C回流2h后，溶液蒸发结晶；用双蒸水溶解晶体(5.8g对应107mL水)，85°C回流30min后加入9.5mLlmol/LHN03，继续回流6h;回流结束，分三管保存。
[0023](3)Si02@LDH 的合成将Si02用约40mLA100H重悬后室温搅拌l-2h;搅拌停止后，高速离心收集沉淀;沉淀用无水乙醇-双蒸水交替洗涤共7次，干燥保存所得到的Si02-A100H。双蒸水溶解Si02-A100H; 加入40mL 1.25g六水合硝酸镁和2.4g尿素混合溶液;转移至水热爸中，80 °C水热反应24h; 水热反应结束后，高速离心收集沉淀，沉淀用双蒸水-无水乙醇-双蒸水洗涤，冷冻干燥保存。[〇〇24](4)Si02@LDH-Bev的合成及药物搭载取100mg干燥的材料于三口烧瓶中，加入150mL异丙醇，超声分散至透明溶液，加入转子;加入l〇〇yLAPTES，充分搅拌，加热回流3h;离心收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤2遍得到 Si〇2@LDH-NH2 保存于 1 OmLMES (0 ? 01M，pH6 ? 5 )溶液中。[〇〇25]lOmLMES溶液中分散溶解250mgNHS、200mgEDC，加入上述所得10mL材料溶液，搅拌2h得到氨基活化的材料溶液，该材料与3mL含0.48mg贝伐单抗的MES溶液混合;室温搅拌4h， 离心后分散在PBS(pH7.4)中；冷冻干燥后，4°C保存。[〇〇26]Si02@LDH-Bev和Si02@LDH与Dox按质量比2:1混合搅拌24h，定量，待用。
[0027] 实施例2: Si〇2@LDH-Bev-Dox细胞毒性研究 (DMTT96孔板铺板密度5000个/孔，37°C，5%C02条件下培养18-24h后，用培养基依照Dox浓度配制 Si02@LDH-Dox，Si〇2@LDH-Bev-Dox 和 Dox 溶液，浓度为 1，5，10yg/mL，培养 24h 后，每孔加入20yLMIT溶液(PBS配制5mg/mL)，避光放置4h后，每孔加入150yLDMS0，避光震荡15min，酶标仪测0D值。[〇〇28](2)细胞周期细胞按照细胞密度1.5*105个/mL接种于12孔板中，5%C02、37°C培养至融合密度70%，培养液配制Dox、Si02@LDH-Dox、Si02@LDH-Bev-Dox溶液，使得Dox浓度为lyg/mL，加入到12孔板中，留有两个空白对照孔，继续培养24h后PBS洗一遍，lOOOrpm离心收集细胞并调整细胞密度为1*106个/mL，取lmL单细胞悬液离心去上清，加入预冷的70%乙醇4°C固定过夜，离心去除固定液，PBS洗一遍，过200目筛网，加入100yLRNaseA37 °C水浴30min，再加入400yLPI染色液，混匀，4 °C 30min，流式细胞仪检测，488nm激发实施例3:体外革E1向评价细胞按照细胞密度1〇5个/mL接种于共聚焦小皿中，5%C02、37°C孵育16-18h，使细胞贴壁;配制三种材料，使得最终加入的药物终浓度为lyg/mL;吸去培养液，用roS洗涤三遍，4% 多聚甲醛室温避光固定15min，吸去固定液，用PBS洗涤三遍，DAPI室温避光染15min，吸去染液，PBS洗涤三遍，加入500yLPBS，激光共聚焦检测。[〇〇29] 实施例4:体内靶向SH-SY5Y荷瘤小鼠随机分组，尾静脉注射三种药物制剂(依照Dox浓度配制，5mg/kg)，注射24h后脊椎断颈处死，取出肿瘤等组织，用荧光显微镜进行观察拍照。
【主权项】
1.一种具有主动革G向肿瘤的纳米药物载体-贝伐单抗介导的Si〇2@LDH，其特征在于以介 孔二氧化硅为核心，镁铝双氢氧化物(LDH)为包裹层，并在其表面修饰靶向肽重组人源化单 克隆抗体贝伐单抗〇^￥3(^111]^13，六￥381:；[11)，其中:介孔3；[〇2平均粒径为19711111，3；[〇2@1^)11平 均粒径为226nm，贝伐单抗介导的Si02@LDH(Si02@LDH-Bev)平均粒径为270nm，所述材料具有 肿瘤特异性靶向，抑制血管生成，高效低毒，提高肿瘤治疗效果的优点。2.—种如权利要求1所述的具有主动靶向肿瘤的纳米药物载体-贝伐单抗介导的Si02@ LDH的制备方法，其特征在于具体步骤如下:(1)Si〇2@LDH 的制备:通过模板剂法，以110_130mL甲醇和90-110mL水的混合液体为体系，以0.8-lg CTAB为 模板，0.25-0.5mL TE0S为硅源，在碱性条件下合成介孔硅前体，再通过1，3，5-三甲苯水热 法扩孔，除去模板剂后得到介孔Si02;9_13g异丙醇铝在酸性条件，加热回流，蒸发结晶得到晶体，用90-110mL双蒸水溶解，酸 性条件下加热回流，得到中间体A100H;将介孔Si02用A100H重悬，搅拌，离心收集，沉淀，用水-无水乙醇交替洗涤6-8次，得到 Si02-A100H；将Si02-A100H与40mL2.4g尿素、1.25g氢氧化镁混合，水热24h后收集沉淀，水-无水乙 醇-水洗后，冷冻干燥，得到S1#LDH;(2)Si02@LDH-Bev 的制备:100mgSi02@LDH通过lOOyl氨基硅烷修饰氨基(APTES)，经10mL250mgN-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，200mgl-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺化0〇腿3(0.0謂，？册.5)混合溶液活化 后，与贝伐单抗进行反应可制得。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述碱性条件为加入0.3-0.7mLlM NaOH。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述1，3,5_三甲苯水热法中采用 的乙醇:水:1，3，5-三甲苯的体积比3:2: 2。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(1冲酸性条件为加入1MHN03，控制pH值 为 3-4。6.—种如权利要求1所述的纳米药物载体-贝伐单抗介导的Si02@LDH作为治疗制剂的应 用，其特征在于所述治疗制剂选择广谱抗癌药物盐酸阿霉素，也可尝试其他药物或基因、疫苗。
【文档编号】A61P35/00GK105999262SQ201610346455
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】汪世龙, 朱融融, 王兆琪
【申请人】同济大学