玛咖提取物的应用及含有玛咖提取物的免疫佐剂和疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种玛咖提取物的应用及含有玛咖提取物的免疫佐剂和疫苗，玛咖提取物在制备免疫佐剂中的应用。本发明用玛咖提取物作为流感疫苗佐剂，具有良好的有效性，能提高抗原的免疫原性，增强免疫效果，其安全性高、副作用小；解决了目前免疫佐剂单一，副作用难以避免，疫苗生产供应量有限，难以满足疫情爆发时急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效时间慢等诸多问题。玛咖提取物制备方法简便，疫苗质量容易控制。
【专利说明】
玛咖提取物的应用及含有玛咖提取物的免疫佐剂和疫苗
技术领域
[0001]本发明涉及玛咖提取物的应用及含有玛咖提取物的免疫佐剂和疫苗，属于生物技 术领域。
【背景技术】
[0002]玛咖属于十字花科独行菜属一年或两年生草本植物，原产于秘鲁海拔3500~ 4500m的南美安第斯山区。玛咖因其可媲美人参的功效，在南美被称为"秘鲁人参"，在我国 又被称为玛卡，是药食兼用的植物。玛咖地下膨大多汁的储藏根形似萝卜，是具有商业价值 的主要食用部分。在过去的20年当中，世界各地对玛咖的了解越来越深，关注日益增多，从 2005年开始，玛咖成为了 7中秘鲁标志产品之一，玛咖的种植面积也逐渐扩张，我国西部部 分地区的自然条件适合玛咖的生长，现在我国云南、新疆、吉林和西藏等省（区）都实现了引 种，并且经济和社会效益很好。
[0003] 玛咖含有丰富的碳水化合物、蛋白质、纤维、脂肪、矿物质、维生素等丰富的营养物 质，玛咖干粉中组蛋白含量较高，达8.87%，云南栽培玛咖根的蛋白质含量可达16.7 X l〇4mg/kg，显著高于秘鲁玛咖的蛋白质含量。玛咖中含有17种氨基酸，其中人体必需氨基酸 有8种，含量占氨基酸总量的32.8%。其中矿物质含量较多的为钾、钙、铁、锌。玛咖所含有的 营养成分能全面、合理的供给人体所需的各种营养素。玛咖中还含有许多次生代谢产物，玛 咖生物碱、玛咖酰胺、玛咖烯、羟基吡啶衍生物、芥子油苷和异硫氰酸酯、留醇类、多酚类以 及其他微量成分，足以解释玛咖强大的生理功能和生物活性。
[0004] 现代许多研究证明，玛咖具有抗氧化、增强生育能力、改善性功能、抗疲劳、调节内 分泌以及抗压力和抗肿瘤等作用。并对风湿症、呼吸疾病、抑郁症、贫血症等有很好的治疗 效果。
[0005] 佐剂是一种加入疫苗后能显著增强抗原的免疫原性，而本身无免疫原性的物质， 将其应用于流感疫苗，能显著增强疫苗的免疫效果，减少抗原的用量，从而有利于流感疫苗 的生产效率的提高与生产成本的降低，扩大接种人群数量，更好的保护易感人群，降低疫苗 生产企业因产量不足而带来的巨大压力。以应对突然爆发的流感疫情，佐剂在新型流感疫 苗的研究与开发中具有极为重要的作用。目前应用较为广泛的佐剂主要有：铝佐剂(氧化 铝、氢氧化铝、磷酸铝）、MF59(是一种包含1%的鲨烯）、0.5%的Tween80和0.5%的三油酸聚山 梨脂的水包油乳液）、LTK63和新型佐剂。
[0006] 目前上市流感疫苗使用的佐剂主要是铝佐剂和MF59。但事实上铝佐剂对蛋白亚单 位疫苗诱导抗体产生的能力较弱，不能有效地诱导免疫应答，其不能诱导产生Thl型反应， 干扰细胞免疫，并阻断CD8 + CTL的激活，使得疫苗的免疫保护作用不全面，不持久，在某些 情况下还会产生与过敏反应有关的IgE，其副作用难以避免;MF59作为佐剂使用时，在增加 免疫原性的同时也增强了反应原性在成年人中出现了局部疼痛、发热、红斑、硬结、肌痛等 症状的增加。另外，一些新型佐剂正处于研发中，像多聚脱氧核苷酸类、抗菌肽类、细胞因子 类、多糖类佐剂，但进展都比较缓慢。因此，随着各种新发流感在全世界的爆发和对人感染 性的增强，加快了新型流感疫苗的研究，寻求更高安全性和免疫原性的佐剂仍然是流感疫 苗发展的一个需要。
[0007] 佐剂发挥作用是由于能增强抗原的免疫原性、提高疫苗效果，因此佐剂一般可在 多种疫苗中进行使用，如目前的铝佐剂。所以佐剂的研究不仅对流感，而且对其它感染性疾 病的防治也有很高的价值。
[0008] 流感是由流感病毒引起的一种可造成大规模流行的急性呼吸道传染病，它的特点 是短期内爆发，然后迅速蔓延，造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴发流行及散 发，发病率高并伴有一定的死亡率，一旦流感疫情爆发，将会对人类的生命健康带来巨大的 威胁。预防流感疫情爆发的最主要也是最有效的手段就是接种流感疫苗。由于流感病毒变 异很快，通常每年的流行类型都有所不同，生产企业一般都在世界卫生组织(WHO)指导下选 择流感病毒毒株进行疫苗生产，每年接种最新的流感疫苗才能达到预防的效果。一旦流感 病毒变异造成大规模流行或者是世界性流行，疫苗需求量必将猛增，但目前由于受流感疫 苗生产工艺的限制，短时间内难于提供大规模流行所需的足量疫苗，因此，应用免疫佐剂， 减少疫苗用量并提高免疫效果，是应对大规模流行期间疫苗量不足的途径之一。
[0009] 经查阅文献，目前未发现关于玛咖提取物应用于免疫佐剂研究的报道。
【发明内容】
[0010] 为解决目前免疫佐剂单一，副作用难以避免，疫苗生产供应量有限，难以满足疫情 爆发时急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效时间慢等诸多问题，本发明提供玛咖提取 物的应用及含有玛咖提取物的免疫佐剂和疫苗，能有效提高疫苗免疫效果，降低疫苗抗原 用量。
[0011] 本发明通过下列技术方案实现:玛咖提取物在制备免疫佐剂中的应用。
[0012] 进一步地，玛咖提取物在制备流感疫苗中的应用。
[0013] 所述玛咖提取物为玛咖乙醇提取物或者玛咖水提取物，或者以常规溶剂提取的提 取物，常规溶剂如甲醇、丙酮、乙酸乙酯等。
[0014] 玛咖乙醇提取物经以下操作提取： 将玛咖粉碎成玛咖粉，用乙醇经常规冷浸、温浸或者加热回流提取，再经过滤后取滤 液，对滤液进行减压回收乙醇，剩余物经真空冷冻干燥或喷雾干燥，即得玛咖乙醇提取物； 其中，乙醇的质量浓度为75~99.7%，乙醇加入量是玛咖粉质量的5~50倍;冷浸是在室温 下浸泡1~10天，温浸是在40~60°C下浸泡1~3小时，提取次数为1~3次；加热回流提取是 在30~75°C下，回流提取1~3次，每次30~180分钟；真空冷冻干燥的冷凝温度在-20~-50 °C下预冻3~16小时，真空度5~20KPa;喷雾干燥进风温度100~300°C，出风温度30~140 cC。
[0015]玛咖水提取物经以下操作提取： 将玛咖粉碎成玛咖粉，用蒸馏水经常规冷浸、温浸或超声波辅助提取，再经过滤后取滤 液，进行喷雾干燥或冷冻干燥，得玛咖水提取物;其中，蒸馏水的加入量是玛咖粉质量的5~ 100倍，冷浸是在室温下浸泡1~10天，温浸是在40~60 °C下浸泡1~3小时，提取次数为1~3 次;超声波辅助提取是在温度20~60°C、超声功率100~650W、超声频率19~23KHz、超声波 输出功率70~100%的条件下进行，提取次数1~3次，每次20~120分钟；真空冷冻干燥的冷 凝温度在-20~-50 °C下预冻3~16小时，真空度5~20KPa;喷雾干燥进风温度100~300 °C， 出风温度30~140 °C。
[0016] 本发明的另一目的在于提供一种含有玛咖提取物的免疫佐剂的流感疫苗，其特征 在于:所述含有玛咖提取物的免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为50:1~150000:1。
[0017] 本发明提供的含有玛咖提取物的免疫佐剂与传统氢氧化铝佐剂相比，具有以下优 占. 1)玛咖是一种天然中草药，常作为保健品使用。在以往的研究中展现出了多种保健功 效，将其作为流感疫苗佐剂应用，安全性高、副作用低。在研究中发现，用含玛咖提取物的流 感疫苗注射小鼠，小鼠未见全身不良反应，活动及饮水进食未见明显影响，而用含氢氧化铝 佐剂的流感疫苗注射小鼠，则偶见注射局部出现红斑、肿胀结节的现象。
[0018] 2)用玛咖提取物制备的佐剂用在流感疫苗上，不仅佐剂效果明显，而且疫苗质量 容易控制；而以氢氧化铝为佐剂制备的流感疫苗，在制备和存储过程中，影响因素较多，对 疫苗的质量较难控制。
[0019] 3)用玛咖提取物作为流感疫苗佐剂，展现出了良好的有效性，能够更好的提高抗 原的免疫原性，增强免疫效果。
[0020] 4)玛咖提取物制备方法简便，较为经济、环保。
[0021] 本发明用玛咖提取物作为流感疫苗佐剂，具有良好的有效性，能提高抗原的免疫 原性，增强免疫效果，其安全性高、副作用小;解决了目前免疫佐剂单一，副作用难以避免， 疫苗生产供应量有限，难以满足疫情爆发时急需提供大量疫苗的要求，以及疫苗起效时间 慢等诸多问题。玛咖提取物制备方法简便，疫苗质量容易控制。
【附图说明】
[0022] 图1为不同接种组在56天内的血凝抑制抗体效价变化图； 图2为不同接种组在接种后7天内的体重增长情况。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但并不以此来限定本发明。
[0024] 本发明实施例所用的流感病毒疫苗原液为本所自制，并且是按照《中国药典》三部 2010版中所述流感病毒裂解疫苗制造方法制备的，按照《中国药典》三部2010版所述项检 定标准检验合格的流感病毒疫苗原液。
[0025] 本发明实施例中未特别指明的组分均为市购产品，所用设备或仪器均是常规的。
[0026] 实施例1 玛咖提取物在制备免疫佐剂中的应用;其中，玛咖提取物为玛咖乙醇提取物，经以下操 作提取： 将玛咖粉碎成玛咖粉l〇〇g，用质量浓度为95%乙醇1000 ml经常规加热回流提取，再经过 滤后取滤液，对滤液进行减压回收乙醇，剩余物经真空冷冻干燥，即得玛咖乙醇提取物；其 中，加热回流提取是在50°C下，回流提取3次，每次60分钟;真空冷冻干燥的冷凝温度在-20 °C下预冻15小时，真空度6KPa。
[0027] 玛咖提取物在制备流感疫苗中的应用，是将玛咖提取物直接作为佐剂（即玛咖提 取物占100%)，制备含有玛咖提取物的免疫佐剂的流感疫苗，其中，含有玛咖提取物的免疫 佐剂与流感疫苗血凝素(H3N2流感病毒抗原）的质量比为15984:1。
[0028] 实施例2 玛咖提取物在制备免疫佐剂中的应用;其中，玛咖提取物为玛咖水提取物，经以下操作 提取： 将玛咖粉碎成玛咖粉100g，用1000 ml蒸馏水经常规超声波辅助提取，再经过滤后取滤 液，进行喷雾干燥，得玛咖水提取物;其中，超声波辅助提取是在温度60 °C、超声功率130W、 超声频率20KHz、超声波输出功率100%的条件下进行，提取次数3次，每次35分钟;喷雾干燥 进风温度180°C，出风温度120°C。
[0029] 玛咖提取物在制备流感疫苗中的应用，是将玛咖提取物直接作为佐剂（即玛咖提 取物占100%)，制备含有玛咖提取物的免疫佐剂的流感疫苗，其中，含有玛咖提取物的免疫 佐剂与流感疫苗血凝素(H3N2流感病毒抗原）的质量比为150000:1。
[0030] 实施例3 玛咖提取物在制备免疫佐剂中的应用;其中，玛咖提取物为常规溶剂提取的提取物。
[0031] 玛咖提取物在制备流感疫苗中的应用，具体是制成含有玛咖提取物的免疫佐剂的 流感疫苗，其中，含有玛咖提取物的免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为2000:1，即 玛咖提取物 5mg/ml、 流感疫苗血凝素 2.5μg/ml。
[0032] 实施例4 玛咖提取物在制备免疫佐剂中的应用;其中，玛咖提取物为玛咖乙醇提取物。
[0033]玛咖提取物在制备流感疫苗中的应用，具体是制成含有玛咖提取物的免疫佐剂的 流感疫苗，其中，含有玛咖提取物的免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为1000:1，即 玛咖提取物 5mg/ml 流感疫苗血凝素 5μg/ml。
[0034] 实施例5 玛咖提取物在制备免疫佐剂中的应用;其中，玛咖提取物为玛咖水提取物。
[0035] 玛咖提取物在制备流感疫苗中的应用，是将玛咖提取物直接作为佐剂（即玛咖提 取物占100%)，制备含有玛咖提取物的免疫佐剂的流感疫苗，其中，含有玛咖提取物的免疫 佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为333:1，即 玛咖提取物 2mg/ml 流感疫苗血凝素 6μg/ml。
[0036] 实施例6 玛咖提取物在制备免疫佐剂中的应用;其中，玛咖提取物为以甲醇提取的提取物。
[0037] 玛咖提取物在制备流感疫苗中的应用，是将玛咖提取物直接作为佐剂（即玛咖提 取物占100%)，制备含有玛咖提取物的免疫佐剂的流感疫苗，其中，含有玛咖提取物的免疫 佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为111:1，即 玛咖提取物 lmg/ml 流感疫苗血凝素 9μg/ml。
[0038] 实施例7 玛咖提取物在制备免疫佐剂中的应用;其中，玛咖提取物是以丙酮提取的提取物。
[0039] 玛咖提取物在制备流感疫苗中的应用，是将玛咖提取物直接作为佐剂（即玛咖提 取物占100%)，制备含有玛咖提取物的免疫佐剂的流感疫苗，其中，含有玛咖提取物的免疫 佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为50:1，即 玛咖提取物 0.5mg/ml 流感疫苗血凝素 10μg/ml。
[0040] 免疫接种及检测： 1)含有玛咖提取物免疫佐剂的流感疫苗的制备，用上述实施例6所得的流感疫苗进行 免疫接种，具体制备方法为： a) 称玛咖提取物IOOmg，溶于2ml生理盐水中，得浓度为50mg/ml的玛咖提取物溶液，备 用； b) 取1)的浓度为50mg/ml的玛咖提取物溶液Iml加入到4ml生理盐水中，得浓度为IOmg/ ml的玛咖提取物溶液，备用； c) 取2)浓度为10mg/ml玛咖提取物溶液Iml加入到4ml生理盐水中，得浓度为2mg/ml的 玛咖提取物溶液，备用； d) 取Iml血凝素含量为126ug/mlH3N2流感病毒抗原稀释液加入到6ml生理盐水中，得到 浓度为18ug/mlH3N2流感病毒抗原稀释液，备用； e) 取3)浓度为2mg/ml的玛咖提取物溶液2ml加入到2ml血凝素含量为18ug/ml的H3N2流 感病毒抗原稀释液中，制得玛咖提取物免疫佐剂的流感疫苗A。
[0041] 2)制备下列不同的佐剂或溶液： a) 取0.5ml血凝素含量为126ug/mlH3N2流感病毒抗原稀释液加入到5.98ml生理盐水 中，得到浓度为9.72ug/mlH3N2流感病毒抗原稀释液，备用； b) 取Iml血凝素含量为126ug/mlH3N2流感病毒抗原稀释液加入到6ml生理盐水中，得到 浓度为18ug/mlH3N2流感病毒抗原稀释液，备用； c) 2ml生理盐水，备用； d) 5ml生理盐水，备用； 3)制备下列不同的疫苗： A) 取14mg/ml的氢氧化铝佐剂0.25ml加入到3.25ml步骤a)所得浓度为9.72ug/mlH3N2 流感病毒抗原稀释液中，混匀，得到含有氢氧化铝佐剂的流感病毒疫苗样品B; B) 取步骤b)所得浓度为18ug/mlH3N2流感病毒抗原稀释液2ml与步骤c)生理盐水混合， 得到无佐剂的流感疫苗样品C; C) 步骤d)的生理盐水为不加疫苗抗原的生理盐水对照组D。
[0042] 所配置的上述样品A、B、C疫苗中血凝素含量均为9ug/ml，其中玛咖提取物佐剂流感疫 苗样品A中：玛咖提取物的质量比为100%，玛咖提取物免疫佐剂与流感疫苗血凝素的质量比 为 111:1〇
[0043] 用上述A、B、C、D四个不同的样品分别免疫标准体重雄性BALB/c小鼠，每组10只，每只肌 肉注射200ul，第1天接种一针，第21天补种一针。于首次免疫后7天、14天、21天、28天、35天、 42天、56天取尾血，分离血清测定血凝抑制效价，结果显示不同时间点玛咖提取物佐剂组与 单独疫苗组相比差异有统计学意义，说明玛咖提取物作为疫苗佐剂具有较好的佐剂效果； 在抗体最高时即35天时玛咖提取物佐剂组与氢氧化铝佐剂组相比差异无统计学意义，说明 在抗体产生的峰值时玛咖提取物佐剂与氢氧化铝佐剂效果相当，但在初免后的第一周即第 7天时以及二免后的第一周即第28天时，玛咖提取物佐剂组与氢氧化铝佐剂组相比有显著 差异，可初步说明玛咖提取物佐剂的免疫增强作用产生的时间先于氢氧化铝佐剂组以及单 独疫苗组。具体结果见表1、表2及附图1。
[0044]表1不同接种组在56天内的血凝抑制抗体效价变化
表2不同接种组在56天内的血凝抑制抗体效价变化的单因素方差分析多重比较结果
于初免之日起7d内对各组小鼠进行体重测量，并对7天内各组平均增长的体重进行计 算，所测结果显示玛咖提取物免疫佐剂组小鼠体重增长正常，与其他组相比，体重增长无显 著性差异，具体结果见表3、表4及附图2。
[0045]表3不同接种组在接种后7天内的体重增长情况
【主权项】
1. 玛咖提取物在制备免疫佐剂中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述玛咖提取物在制备流感疫苗中的应 用。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述玛咖提取物为玛咖乙醇提取物或 者玛咖水提取物，或者以常规溶剂提取的提取物。4. 一种含有玛咖提取物的免疫佐剂的流感疫苗，其特征在于:含有玛咖提取物的免疫 佐剂与流感疫苗血凝素的质量比为50:1~150000:1。
【文档编号】A61P31/16GK105963693SQ201610468707
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月25日
【发明人】李映波, 朱喆
【申请人】中国医学科学院医学生物学研究所