没药枝抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和医药应用
【专利摘要】本发明属医药技术领域，具体涉及一种维吾尔药没药枝抗肿瘤有效部位及其组合物的制备方法和其在制备预防及治疗肝癌、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、胶质瘤等恶性肿瘤药物上的应用。没药枝经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚洗脱，继用甲醇溶剂洗脱，甲醇洗脱液干燥后得提取物；或维吾尔药没药枝经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚洗脱，继用石油醚：乙酸乙酯=100：10-100：50的溶剂洗脱，收集100：10-100：50的洗脱液，洗脱液干燥后得提取物。
【专利说明】
没药枝抗肿瘤提取物及其组合物的制备方法和医药应用
技术领域
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种维吾尔药没药枝抗肿瘤提取物及其组合物 的制备方法和其在制备预防及治疗肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、脑胶 质瘤等恶性肿瘤的上的用途。
【背景技术】
[0002] 没药枝（Ramulus myrrhae)为撤揽科植物没药树（Commiphora myrrha EngL )的 干燥树枝。割取树枝，切断、晾干。主产于非洲索马里、埃塞俄比亚以及印度等地。旧约时 期，常被做成油膏，涂抹在伤口，促进伤口愈合。该药材主治增强营养离，通滞散气，解毒散 寒，用于头昏目眩，气短咳嗽，癫痫，瘫痪，失眠，胃寒胁痛，久婚不孕，毒蛇咬伤等。
[0003] 本发明在研究没药枝抗肿瘤活性时意外地发现，没药枝亦具有很好的乳腺癌、宫 颈癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤的预防及治疗作用，可以应用 癌症的预防和治疗。
[0004] 但是，对其抗肿瘤的有效成分一直不清楚，本发明通过系统地筛选研究，发现了没 药枝的有效提取提取物，可以应用于肿瘤的预防和治疗。
【发明内容】
[0005] 本发明所解决的技术问题是提供一种没药枝提取物，该提取物可以用于治疗肝 癌、肺癌、胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、脑胶质瘤等恶性肿瘤。
[0006] 本发明还提供了该提取物的制备方法。
[0007] 本发明还提供了以没药枝提取物作为活性成分的组合物及其制备方法和用途。
[0008] 本发明是通过如下技术方案实现的：
[0009] 维吾尔药没药枝经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶 柱，先用石油醚洗脱，继用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶剂洗脱，收集100 : 10-100 :50的洗脱液，洗脱液干燥后得提取物，具有显著的抗肿瘤活性，其TLC分析表征如 图1，TLC分析色谱条件：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮=6:1:1，显色方 法：香草醛-浓硫酸。
[0010] 具体，发现过程如下：
[0011] 1、没药枝经溶剂超声提取物的制备
[0012] 取维吾尔药没药枝20g，经100mL溶剂超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物 SN0019A759. 9mg，SN0019B 219. lmg，合并共 979mg,留样 31. 2mg 剩余 947. 8mg。
[0013] 2、石油醚：乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱方法和结果
[0014] 取维吾尔药没药枝20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物 SN0019A759. 9mg，SN0019B 219. lmg，合并共 979mg,留样 3L 2mg 剩余 947. 8mg。上柱，甲醇 溶解，共用甲醇20ml。上硅胶柱色谱，拌样硅胶lg，空白硅胶10g，玻璃柱内径2. 0cm，石油 醚：乙酸乙酯系统梯度洗脱（条件见表1)，柱体积22ml，每个梯度洗脱200ml，得到，各个浓 度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得，石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱提取物，收率见表1， TLC分析结果见图2, TLC分析色谱条件=GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮= 6:1:1，显色方法：香草醛-浓硫酸。
[0015]表 1
[0017] 3、抗肿瘤活性筛选方法和结果
[0018] 1)实验条件
[0019] a)细胞株信息
[0020] 大鼠脑胶质瘤细胞C6购于中国典型培养物保藏中心细胞库。
[0021] b)药品及试剂
[0022] 样品无菌条件下，DMSO溶解配置成母液浓度为100mg/mL，使用时用RPMI-1650培 养液稀释至所需浓度（DMSO彡1%。）。
[0023] RPMI Medium 1650培养基干粉购于美国GIBCO公司。胎牛血清购于北京元亨圣马 生物技术研究所。Trypsin 1:250、二甲基二苯基四氮唑溴盐（MTT)。
[0024] c)仪器
[0025] CO2培养箱（SANYO,日本）
[0026] 垂直层流洁净工作台（上海上净净化设备有限公司）
[0027] 倒置生物显微镜（重庆光电仪器有限公司）
[0028] 低/高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）
[0029] 电子天平（奥豪斯仪器有限公司）
[0030] 酶标仪（伯乐生命医学产品有限公司）
[0031] 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）
[0032] 鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）
[0033] PH 计（SART0RIUS，德国）
[0034] 2)实验方法和过程
[0035] 大鼠脑胶质瘤细胞C6以5000/孔的密度铺于96孔板，每孔100ul，12h后使用。 各组分以DMSO溶解为lOOmg/mL储存液，保存于-20°C待用。铺板后12h，观察细胞汇合率 约为50%，加药，浓度均为100yg/mL，每个组分3个复孔。每板细胞设立二个对照组（培 养基+细胞；含〇. 1% DMSO培养基+细胞），3个空白孔（只有培养基）。加入药物24小 时后，加入20 μ 1四甲基偶氮唑盐化学名为3- (4, 5-二甲基噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴盐 (3_(4, 5-dimethyl_2thiazolyl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide，ΜΤΤ)，继续培养 4 小时。完全弃去上清液，加入100 μ I DMS0,混匀使MTT完全溶解，去气泡。490nm测定OD 值。
[0036]
[0037] 3)实验结果
[0038] 表 2
[0046] 维吾尔药没药枝经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶 柱，先用石油醚洗脱，继用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶剂洗脱，收集100 : 10-100 :50的洗脱液，洗脱液干燥后得提取物，具有显著的抗肿瘤活性。
[0047] 4、抗肿瘤有效提取物的提取方法研究
[0048] 1)提取溶剂的种类研究
[0049] 分别用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等溶 剂提取，并测试提取物对C6细胞的抗肿瘤活性，结果如下：
[0050] 表 3
[0052] 研究结果表明：提取用溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合 溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0053] 2)提取溶剂的用量研究
[0054] 分别用1、2、5、10、20、30、50、50倍（重量/体积比）溶剂提取，并测试提取物对〇6 细胞的抗肿瘤活性，结果如下：
[0055] 表 4
[0059] 提取物提取用溶剂用量为药材重量的2-50倍（重量/体积比）。
[0060] 3)干燥方法的研究
[0061] 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到 的抗肿瘤活性部位进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、冷冻干燥 法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对抗肿瘤活性部位进行干燥，其中，最优为真空 干燥法、冷冻干燥法。
[0062] 表 5 :
[0064] 因此，没药枝抗胛瘤提取物的制备方法为：
[0065] 维吾尔药没药枝经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶 柱，先用石油醚2-50倍洗脱，继用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶剂2-50倍洗脱， 收集100 :10-100 :50的洗脱液，洗脱液干燥后得提取物，具有显著的抗肿瘤活性。最优为先 用石油醚洗脱10倍柱体积，继用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50洗脱15倍柱体积；
[0066]其中，
[0067] 1)提取物提取用溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、 乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。提取物提取用溶剂用量为药材重量的2-50 倍（重量/体积比）。
[0068] 2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0069] 5.没药枝抗肿瘤有效提取物（先用石油醚洗脱，继用甲醇洗脱）的抗肿瘤活性研 究
[0070] 利用各种肿瘤细胞，如胶质瘤、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌等 恶性肿瘤细胞株，分别测试没药枝抗肿瘤提取物的抗肿瘤活性，IC50结果如下：
[0071] 表 6
[0074] 因此，我们发现，没药枝抗肿瘤提取物具备抗肿瘤活性，可望用于各种肿瘤如胶质 瘤、肺癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌等恶性肿瘤的预防及治疗。
[0075] 6、没药枝抗肿瘤有效提取物的组合物及其制备方法研究
[0076] 1)固体分散体
[0077] 处方 没药枝提取物 2〇g 聚乙烯吡咯烷酮 Sflg 固体分散1:0?
[0078] 制备方法：
[0079] 称取没药枝提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的质量比 分别放入烧杯中，加入无水乙醇，磁力搅拌器搅拌至没药枝提取物和载体完全溶解，转入旋 蒸仪中去除有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得没药枝提取物PVP包合物。
[0080] 2)环糊精包合物
[0081] 处方：
[0082] 没药枝提取物 20g β-环糊精 80g 包合物100g
[0083] 制备方法：
[0084] 将β -环糊精与1~5倍水研匀，加没药枝提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）充分研磨至成糊状物，低温干燥即得。
[0085] 3)分散片处方：
[0086] 没药枝提取物 IOQ 十二烷基硫酸钠 1 预胶化淀粉 10 可溶性淀粉 100 交联聚维酮 1:0
[0087] 微晶纤维素 10 微分硅胶 0,3 L0088」 制爸万沄：
[0089] 1.没药枝提取物淀粉分散体的制备，精密称取没药枝提取物提取物，加入适量的 十二烷基硫酸钠，用70%的乙醇溶解加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C的温度 下蒸干，粉碎，过100目筛；
[0090] 2.称取处方量，没药枝提取物淀粉分散体，交联聚维酮，预胶化淀粉，用70 %乙 醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min后，60°C烘箱烘干 45min，16目筛整粒，加入滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片。
[0091 ] 7、没药枝抗肿瘤有效提取物的检测方法研究
[0092] 我们发现，可以用薄层色谱的方法，很好地检测和标示没药枝抗肿瘤有效提取物 的特征。见图1
[0093] 具体条件为：色谱条件：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮= 6:1:1，显色方法：香草醛-浓硫酸
【附图说明】：
[0094] 图1提取物的TLC色谱图；
[0095] 图2没药枝得到的化学组分的TLC色谱图。
【具体实施方式】
[0096] 以下实施例表示本发明的实用性，本发明不受此限制。
[0097] 实施例1 :
[0098] 取没药枝20g，经100mL溶剂超声提取15min，提取液浓缩后回收溶剂，真空干燥， 即为该提取物，收率15. 1%。
[0099] 实施例2 :
[0100] 取没药枝20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样 后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚洗脱20倍柱体积，继用甲醇洗脱30倍柱体积， 甲醇洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥，即为该提取物，收率8. 3%。
[0101] 实施例3:
[0102] 取没药枝20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上 样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚洗脱20倍柱体积，继用石油醚：乙酸乙酯= 100 :50洗脱30倍柱体积，洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥，即为该提取物，收率6. 6%。
[0103] 实施例4:
[0104] 取没药枝20g，经100mL乙醇超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上 样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚洗脱20倍柱体积，继用石油醚：乙酸乙酯= 100 :50洗脱30倍柱体积，洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥，即为该提取物，收率5. 1 %。
[0105] 实施例5 :
[0106] 取没药枝20g，经100mL丙酮超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上 样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚洗脱20倍柱体积，继用石油醚：乙酸乙酯= 100 :50洗脱30倍柱体积，洗脱液经回收有机溶剂，鼓风干燥，即为该提取物，收率4. 8%。
[0107] 实施例6:
[0108] 取没药枝20g，经100mL氯仿超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上 样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚洗脱20倍柱体积，继用石油醚：乙酸乙酯= 100 :50洗脱30倍柱体积，洗脱液经回收有机溶剂，离心干燥，即为该提取物，收率3. 7%。
[0109] 实施例7 :
[0110] 取没药枝20g，经100mL乙酸乙酯超声提取15min，提取液浓缩后，用硅胶柱分 离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚洗脱20倍柱体积，继用石油醚：乙酸 乙酯=100 :50洗脱30倍柱体积，洗脱液经回收有机溶剂，旋蒸干燥，即为该提取物，收率 4. 4%〇
[0111] 实施例8:
[0112] 取没药枝20g，经100mL甲醇水混合溶剂（甲醇：水=1:1)超声提取15min，提取 液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚洗脱20倍柱体 积，继用石油醚：乙酸乙酯=100 :50洗脱30倍柱体积，洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥， 即为该提取物，收率5. 3%。
[0113] 实施例9:
[0114] 取没药枝20g，经100mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=1:1)超声提取15min，提取 液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚洗脱20倍柱体 积，继用石油醚：乙酸乙酯=100 :50洗脱30倍柱体积，洗脱液经回收有机溶剂，真空干燥， 即为该提取物，收率5.0%。
[0115] 实施例9:
[0116] 取没药枝20g，经100mL乙醇水混合溶剂（乙醇：水=90:10)超声提取15min，提 取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱（I. 5cm内径小柱），先用石油醚洗脱20倍柱体 积，继用石油醚：乙酸乙酯=100 :50洗脱30倍柱体积，洗脱液经回收有机溶剂，冷冻干燥， 即为该提取物，收率4. 5%。
[0117] 实施例10 :固体分散体
[0118] 称取没药枝提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例、1:2、1:4、1:6的质量比 分别放入烧杯中，加入无水乙醇，磁力搅拌器搅拌至没药枝提取物和载体完全溶解，转入旋 蒸仪中去除有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得没药枝提取物PVP包合物。
[0119] 实施例11 :环糊精包合物
[0120] 将β -环糊精与1~5倍水研匀，加没药枝提取物（水难溶性的应先溶于少量有 机溶剂中）充分研磨至成糊状物，低温干燥即得。
[0121] 实施例12 :分散片
[0122] 1.称取干燥的没药枝提取物，加入适量的十二烷基硫酸钠，使用70%的乙醇充分 溶解，加入水溶性淀粉与没药枝提取物（1 :1)，搅拌混合均匀，在70°C下干燥，粉碎，过100 目筛，得没药枝提取物分散体。
[0123] 2.精密称取处方量，没药枝提取物分散体，交联聚维酮，可压性淀粉，用70 %乙醇 做湿润剂，边加入边搅拌，14目筛制成湿颗粒，室温下放置15min后，70°C烘箱烘干45min， 16目筛整粒，加入滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压片。
【主权项】
1. 一种维吾尔药没药枝提取物，其特征为，维吾尔药没药枝经溶剂超声提取，提取液浓 缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用石油醚洗脱，继用甲醇溶剂洗脱，甲醇洗脱液干 燥后即得； 或维吾尔药没药枝经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后 的硅胶柱，先用石油醚洗脱，继用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶 剂洗脱，收集100 :10-100 :50的洗脱液，洗脱液干燥后得提取物。2. 如权利要求1所述的维吾尔药没药枝提取物，其特征在于，所述的溶剂为甲醇、乙 醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂或乙醇水混合溶剂，最优为甲醇和95%乙醇。3. 如权利要求1所述的维吾尔药没药枝提取物，其特征为，样后的硅胶柱，先用石油醚 洗脱2-50倍柱体积，继用甲醇洗脱2-50倍柱体积；优选先用石油醚洗脱10倍柱体积，继用 甲醇洗脱15倍柱体积。4. 如权利要求1所述的维吾尔药没药枝提取物，其特征为，先用石油醚2-50倍洗脱，继 用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶剂2-50倍洗脱，优选先用石油醚10倍洗脱，继 用石油醚：乙酸乙酯=100 :10-100 :50的溶剂15倍洗脱。5. -种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-4任何一项所述的没药枝提取物和 药学上可接受的载体。6. -种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1-4任何一项所述的没药枝提取物或权 利要求5所述的药物组合物。7. 如权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，所述的制剂为固体分散体、环糊精包合 物、分散片。8. 权利要求1-4任何一项所述的没药枝提取物或权利要求5所述的组合物或权利要求 6所述的药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。9. 如权利要求8所述的应用，其特征为，所述的肿瘤为乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、胃 癌、结肠癌、胰腺癌或脑胶质瘤。10. 权利要求1-4任何一项所述的维吾尔药没药枝提取物，其特征在于，用TLC法检 测，其色谱条件为：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮=6:1:1，显色方法：香 草醛-浓硫酸。
【文档编号】A61P35/00GK105982942SQ201510081741
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月15日
【发明人】王金辉, 黄健, 郑雅鑫
【申请人】沈阳药科大学