一种酵母展示草鱼出血病疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用酵母表面展示技术制备的草鱼出血病疫苗，涉及基因工程疫苗制备。该疫苗通过糖基化基因敲除后的酿酒酵母细胞EBY100△Mnn9表面展示GCRV-VP7蛋白制备。酿酒酵母是真核的表达系统，其表达的病毒外壳蛋白会经过糖基化修饰，能诱导草鱼免疫系统产生病毒中和抗体。本发明的优点在于：本发明所使用的糖基化缺失酵母菌株EBY100△Mnn9可以有效去除酵母表面蛋白超糖基化，从而避免GCRV-VP7抗原被掩盖而导致疫苗效率缺失和下降的问题；由于酵母细胞培养简单，生产廉价，可以大规模低成本生产草鱼出血病疫苗。
【专利说明】
一种酵母展示草鱼出血病疫苗及其制备方法
技术领域
[0001 ] 本发明涉及基因工程技术，更具体涉及基因工程疫苗制备。
【背景技术】
[0002]草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus, GCRV)是一种双链RNA病毒，隶属于水生呼肠孤病毒属(Aquareoviridae)，是目前毒性最强的水生呼肠孤病毒(Rangeletal,Identificat1n ofgrass carp haemorrhage virus as a new genogroup ofaquareovirus, J Gen Virol, 1999(80):2399-2402)。该病毒引起我国的主要淡水养殖品种一一草鱼发生出血病，死亡率高达90%，给我国的水产养殖产业造成了巨大的损失(刘等，草鱼出血病病毒VP6蛋白的原核表达、纯化及免疫效果，水产学报，2012 (03):429-435)。除草鱼外，GCRV 也能感染青鱼(Mylopharyngodon piceus)、麦糖鱼(Pseudorasbora parva)和稀有鉤鲫(Gob1cypris rarus) ( 丁等，草鱼出血病病毒对其它鱼的感染性研究，中国病毒学，1991 (04):371-373)。疫苗是防治水产类疾病有效的方式之一 (Heng et al, The polymorphism and haplotype ofTLR3gene in grasscarp(Ctenopharyngodon idella)and their associat1ns with susceptibility/resistance to grass carp reovirus, Fish Shellfish Immunol, 2011，30(I):45-50)，最早针对草鱼出血病的疫苗是用灭活的患病草鱼组织匀浆液制备的灭活组织疫苗，随后甲醛灭活的GCRV病毒被用作疫苗，这也是亚洲最早的商业化草鱼出血病疫苗(杨等，草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究一一疫苗株的免疫原性及其有效免疫剂量的比较，水产学报，1989 (02): 138-144.)。灭活疫苗具有研制周期短，使用安全，易于保存等优点，但同时也具有接种后不能在体内繁殖，所需的疫苗量大，免疫持续周期短，需要免疫佐剂增强免疫等缺点，因此，人们将研究方向转向了减毒疫苗，这种疫苗可以在体内繁殖，不用添加佐剂，免疫保护期长。由珠江水产研究所研制的草鱼出血病减毒疫苗(GCHV-892)获得农业部颁发的一类新兽药证书，这是国内外第一个获批的草鱼出血病活疫苗。但是减毒疫苗仍然存在一定的安全隐患，有潜在的致病风险，且制备和生产成本高，贮存和运输不便，因此，研制一种安全、有效且质量可控的草鱼出血病疫苗非常必要。
[0003]酿酒酵母是一种理想的用于生产疫苗的宿主细胞，它无致病性，遗传背景清楚，容易培养，而且生产廉价(Schreuder et al, Immobilizing proteins on thesurface of yeast cells,Trends B1technoI, 1996, 14 (4):115-120 ；Ueda, M.andA.Tanaka, Cell surface engineering of yeast:Construct1n of arming yeast withb1catalyst, J B1sci B1eng, 2000，90 (2): 125-136) 0 对于生产病毒疫苗来说，酵母表达系统比原核表达系统具有更大的优势，酵母能识别并修饰糖蛋白的糖基化位点，糖基也是影响中和抗体产生的重要因素(Goochee et al, The oligosaccharides ofglycoproteins:b1process factors affecting oligosaccharide structure and theireffect on glycoprotein properties, B1technology, 1991，9(12):1347-1355 ;Romanosetal, Foreign gene express1n in yeast: a review, Yeast, 1992，8(6):423-488)。 酉孝母中表达的重组蛋白和酵母细胞壁成分一起注射具有更强的免疫原性，而且酵母细胞壁中的葡聚糖可以作为免疫佐剂，用于注射和口服免疫(Berneret al, Conjugat1nofprotein antigen to microparticulate beta—gluean from Saccharomycescerevisiae:a new adjuvant for intradermal and oral immunizat1ns, Appl Microb1lB1technolj 2008,80 (6):1053-1061 ;Stubbset al, Whole recombinant yeast vaccineactivates dendritic cells and elicits protective cell-mediated immunity, NatMed, 2001，7(5):625-629)。酵母细胞表面的蛋白可以被免疫系统识别，即使小的多肽表达在细胞表面也具有较强的免疫原性(Schreuder et al, Immobilizing proteins on thesurface ofyeast cells, Trends B1technolj 1996, 14(4): 115-120) 0 将外源蛋白与酵母细胞壁上GPI锚定蛋白融合，在酵母中表达并展示到酵母细胞表面的技术即为酵母表面展示技术，它广泛应用于生物转化、疫苗、蛋白质工程、抗体等领域(Tanakaet al，Recentdevelopments in yeast cell surface display toward extended applicat1ns inb1technology, Appl Microb1l B1technolj 2012，95 (3): 577-59) 0 酵母表面展不外源蛋白用作疫苗由 Schreuder 等(Schreuder et al, Immobilizing proteins on thesurface of yeast cells, Trends B1technolj 1996, 14(4): 115-120)首先提出，他将乙肝表面抗原展示到酵母细胞表面，用于免疫小鼠，在小鼠的血清中检测到了能特异性识别乙肝表面抗原的抗体，至此以后，多种外源蛋白被展示到酵母细胞表面用作疫苗。高致病性禽流感血凝素展示到酵母细胞表面上后仍保留了其生物活性，将此酵母用于口服免疫鸡以后，在鸡体内诱导产生了中和性抗体(ffasilenkoet al, Cell surface displayof highly pathogenic avian influenza virus hemagglutinin on the surfaceof Pichia pastoris celIs using alpha-agglutinin for product1n of oralvaccines, B1technol Prog, 2010，26(2): 542-547) o展示到酵母细胞表面的真鯛虹彩病毒的380R抗原和哈维氏弧菌的溶血素也是潜在的用于相应鱼类疾病防治的疫苗(Tamaruet al，Applicat1n ofthe arming system for the express1n ofthe 380R antigenfrom red sea bream iridovirus(RSIV)on the surface ofyeast cells:a first stepfor the development ofan oral vaccine,B1technol Prog，2006，22 (4):949-953 ;Zhuj The surface display of haemolysin from Vibr1 harveyi on yeast cellsand their potential applicat1ns as live vaccine in marine fish,Vaccine，2006，24(35-36):6046-6052)
[0004]糖基化修饰在酵母展示疫苗中是一把双刃剑，一方面，被展示的抗原蛋白由于被正确糖基化而保持其免疫原性；另一方面，酵母细胞表面蛋白的超糖基化糖链会掩盖被表达在酵母细胞表面的抗原分子，从而降低疫苗的效率。因此对酵母糖基化的深入了解以及合理化改造成为酵母展示疫苗设计中的关键点。
[0005]酿酒酵母中的多种蛋白在翻译后修饰的过程中，在天冬酰胺上进行N-连接的糖基化，在丝氨酸或苏氨酸上进行O-连接的糖基化。其中O-连接的糖基化影响较小，因为在酵母细胞中，O-连接的糖链通常由1-5个甘露糖残基组成。而N-连接的糖链则由最多200个甘露糖残基构成，从而形成超糖基化(Dean,.Asparagine-linked glycosylat1n in theyeast Golgi，B1chim B1phys Acta，1999，1426 (2): 309-322)，因此可能极大地影响酵母展示疫苗的效率。因此对酵母细胞N-连接的糖基化进行适度改造有助于提高酵母展示疫苗的效率。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种酵母展示草鱼出血病疫苗，该疫苗通过糖基化基因敲除后的酿酒酵母细胞EBY100 Δ Mnn9表面展示GCRV-VP7蛋白制备。本发明的优点在于，该疫苗使用的载体酿酒酵母是真核表达系统，其表达的病毒外壳蛋白会经过糖基化修饰，这对诱导草鱼免疫系统产生病毒中和抗体非常重要。由于酵母细胞培养简单，生产廉价，可以大规模低成本生产草鱼出血病疫苗。
[0007]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0008]—种酵母展示草鱼出血病疫苗，该疫苗为表面展示GCRV-VP7蛋白的EBY100 Δ Mnn9酵母细胞。
[0009]制备上述一种酵母展示草鱼出血病疫苗的方法，该方法包含下列步骤:
[0010]1、用玻璃珠破碎Mnnl基因敲除的酿酒酵母BY4741 Λ Mnnl酵母细胞壁，用苯酚和氯仿从酵母细胞裂解液中抽提基因组DNA ;
[0011]2、设计一对长引物，上游引物 F9 的序列为:GAAITTAAAAGAGCTAGAATAAAAAGTTAGGAAACAATGCGGATCCCCGGGTTAATTAA，下游引物 R9 的序列为:AACGCTATAGCTTCTGTATGCTITTTGCTCAGTTGCTCAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC，用该对引物从BY4741 Δ Mnnl酵母基因组中扩增出含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段；
[0012]3、用醋酸锂法将扩增出的含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段转化到EBY100酵母菌中，含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段与EBY100酵母中的Mnn9基因发生同源重组，从而敲除Mnn9基因，并替换为KanMAX基因，然后用PCR和测序的方法确定Mnn9基因成功敲除，获得EBY100 Δ Mnn9酵母细胞；
[0013]4、用上游引物VP7-F和下游引物VP7-R从pR/GCRV_VP7质粒上扩增GCRV-VP7基因，上游引物VP7-F序列为:CCGGGATCCATGCCACTTCACATGATTCC ;下游引物VP7-R序列为:CCGCTCGAGATCGGATGGCTCCACATGCA，将扩增出的 GCRV-VP7 基因片段连接到 pMD18_T 载体中，用限制性内切酶切下GCRV-VP7基因，再连接到pYDl质粒中，构建重组质粒pYDl_VP7 ;
[0014]5、将pYDl-VP7重组质粒通过醋酸锂法转入EBY100 Δ Mnn9酵母细胞，培养并用半乳糖诱导该酵母细胞，通过流式细胞术确认GCRV-VP7蛋白展示到EBY100 Δ Mnn9酵母细胞表面，该酵母细胞即为酵母展示草鱼出血病疫苗；
[0015]6、用表面展示有GCRV-VP7蛋白的EBY100 Λ Μηη9细胞经腹腔注射的方式免疫BALb/c小鼠，三次免疫结束后，抽取小鼠血液制备抗血清；
[0016]7、用小鼠抗血清在CIK细胞上测试血清对GCRV病毒的中和能力，结果显示该抗血清对GCRV-873病毒具有中和作用，表明酵母表面展示的GCRV-VP7蛋白诱导小鼠产生了能中和病毒的抗体，可以用作疫苗用于草鱼出血病防治。
[0017]本发明的优点在于，酿酒酵母是真核的表达系统，其表达的病毒外壳蛋白会经过糖基化修饰，这对诱导草鱼免疫系统产生病毒中和抗体是非常重要的。并且本发明所使用的糖基化缺失酵母菌株EBY100 Λ Mnn9可以有效去除酵母表面蛋白超糖基化，从而避免GCRV-VP7抗原被掩盖而导致疫苗效率缺失和下降的问题。同时，酵母细胞壁是一种天然的佐剂，展示到酵母细胞表面的病毒蛋白可以直接用于免疫，不用添加佐剂。酵母细胞培养简单，生产廉价，可以大规模低成本生产草鱼出血病疫苗。
【附图说明】
[0018]图1:不同浓度血清对GCRV-873病毒的中和效果。
[0019]EBY Δ M9-VP7:表面展示有GCRV-VP7蛋白的EBY100 Λ Mnn9酵母细胞免疫小鼠获得的抗血清；EBY100:EBY100野生型酵母细胞免疫小鼠获得的抗血清。将两种血清分别按1:50，1:100，1:200，1:400稀释，与GCRV-873病毒一起孵育一段时间后感染CIK细胞。
[0020]图2:小鼠抗血清对GCRV-873病毒的相对中和能力。
[0021 ] EBY Δ M9-VP7:表面展示有GCRV-VP7蛋白的EBY100 Δ Mnn9酵母细胞免疫小鼠获得的抗血清；EBY100:EBY100野生型酵母细胞免疫小鼠获得的抗血清。横坐标为抗血清的稀释倍数，纵坐标为通过细胞培养板上病毒的噬斑数量计算而得的相对中和能力。
【具体实施方式】
[0022]1、用玻璃珠破碎Mnnl基因敲除的酿酒酵母BY4741 Λ Mnnl酵母细胞壁，用苯酚和氯仿从酵母细胞裂解液中抽提基因组DNA，其具体操作过程如下:
[0023]1.1将酿酒酵母细胞ΒΥ4741 Δ Mnnl接种到Iml YPD (含2%葡萄糖)培养基中，300C，200转/分振荡培养16小时；
[0024]1.2取1.5ml酵母菌液，6000转/分离心2分钟，取沉淀物；
[0025]1.3加入200 μ I抽提溶液重悬细胞；
[0026]1.4加入0.3g玻璃珠，苯酚和氯仿各200 μ 1，涡旋振荡3分钟；
[0027]1.512000转/分离心10分钟，取上清加入新离心管中；
[0028]1.6加入2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀溶液，放入_20°C冰箱中30分钟；
[0029]1.712000转/分离心10分钟，去掉上清，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀一次；
[0030]1.8去掉上清，将离心管放入37°C培养箱中至乙醇完全挥发；
[0031]1.9将沉淀重悬在50 μ I超纯水中，-20°C保存备用。
[0032]2、扩增出含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段；
[0033]根据Mnn9基因和kanMX4基因序列设计上游引物F9:GAATTTAAAAGAGCTAGAATAAAAAGTTAGGAAACAATGCGGATCCCCGGGTTAATTAA 和下游引物 R9:AACGCTATAGCTTCTGTATGCTTTTTGCTCAGTTGCTCAGAATTCGAGCTCGTTTAAACo其中，引物的5’端分别与Mnn9基因上下游序列同源，而3’端与kanMX4基因同源。以BY4741 Λ Mnnl基因组DNA为模板，用PCR扩增kanMX4基因，扩增出的产物用于转化EBY100酵母细胞。
[0034]3、酵母超糖基化基因Mnn9的敲除和验证
[0035]将PCR扩增的含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段转化到酵母细胞EBY100中，利用酵母自身同源重组机制敲除糖基化基因，并用PCR和测序的方法进行验证，其具体操作过程如下:
[0036]3.1将酿酒酵母细胞EBY100接种到Iml YPD培养基中，30°C，200转/分振荡培养16小时；
[0037]3.2加入2ml YPD培养基，30 °C，200转/分振荡培养4小时；
[0038]3.3取1.5ml酵母菌液，6000转/分离心2分钟，取沉淀物；
[0039]3.4将沉淀悬于400 μ I的10mM醋酸锂中，6000转/分离心2分钟，取沉淀物；
[0040]3.5将沉淀物悬于10mM的100 μ I醋酸锂中，将10mg/ml的鲑鱼精单链DNA煮沸5分钟，取2 μ I与50 μ I PCR扩增产物一同加入酵母悬液中，室温放置5分钟；
[0041 ] 3.6加入280 μ I 50 %的PEG4000，涡旋振荡至混匀，室温静止30分钟；
[0042]3.7加入39 μ I DMSO, 30 °C水浴热击5分钟；
[0043]3.86000转/分离心2分钟，取沉淀物，用无菌水洗一次，6000转/分离心2分钟，取沉淀悬于100 μ I无菌水中，涂YPD-G418(含150 μ g/ml G418)平板，30°C培养箱中培养2-3天，至生长出单克隆；
[0044]3.9待YPD-G418抗性平板上生长出单克隆后，挑取酵母单克隆，接种到YPD-G418液体培养基中，按照步骤I中操作提取酵母基因组，用PCR方法检测抗性基因是否整合到目的基因的位点，所筛选出来的阳性克隆送北京擎科新业生物技术有限公司测序，阳性克隆即EBYlOO Δ Mnn9酵母菌株，加20%甘油保存在-80 °C冰箱中。
[0045]4、构建重组质粒pYDl-VP7
[0046]根据GCRV-VP7基因序列设计上游引物(VP7-F):CCG GGATCCATGCCACTTCACATGATTCC 及下 游弓 I 物(VP7-R):CCGCTCGAGATCGGATGGCTCCACATGCA，下划线部分别是 BamHI 和 Xhol I 酶切位点。以 pR/GCRV-VP7质粒为模板，用PCR方法扩增出GCRV-VP7基因后，用BamHI和XholI双酶切，并将其连接入PYDl质粒中构建重组质粒pYDl-VP7。
[0047]5、将pYDl-VP7重组质粒通过醋酸锂法转入EBYlOO Δ Mnn9酵母细胞，培养并用半乳糖诱导该酵母细胞，通过流式细胞术确认GCRV-VP7蛋白展示到EBYlOO Δ Mnn9酵母细胞表面，该酵母细胞即为酵母展示草鱼出血病疫苗；
[0048]5.1用质粒提取试剂盒提取pYDl-VP7质粒并转化酵母细胞EBYlOO Δ Mnn9，其过程如下:
[0049]5.1.1将酿酒酵母细胞EBYlOO接种到Iml YPD培养基中，30°C，200转/分振荡培养16小时；
[0050]5.1.2加入2ml YPD培养基，30°C，200转/分振荡培养4小时；
[0051 ] 5.1.3取1.5ml酵母菌液，6000转/分离心2分钟，取沉淀物；
[0052]5.1.4将沉淀重悬于10mM的400 μ I醋酸锂中，6000转/分离心2分钟，取沉淀物；
[0053]5.1.5将沉淀物重悬于10mM的100 μ I醋酸锂中，将10mg/ml的鲑鱼精单链DNA煮沸5分钟，取2 μ I与重组质粒(约0.1-1 μ g) 一同加入酵母悬液中，室温放置5分钟；
[0054]5.1.6加入280 μ I 50 %的PEG4000，涡旋振荡至混匀，室温静止30分钟；
[0055]5.1.7 加入 39 μ I DMSO, 42°C水浴热击 5 分钟；
[0056]5.1.86000转/分离心2分钟，取沉淀物，用无菌水洗一次，6000转/分离心2分钟，取沉淀悬于100 μ I无菌水中，涂minimal平板，30°C培养箱中培养2天至生长出单克隆；
[0057]5.1.9挑取单克隆接种到YNB-CAA(2%葡萄糖)培养一段时间后，按照I中的方法提取质粒，用PCR检测GCRV-VP7基因。
[0058]5.2酵母细胞表面展示VP7蛋白
[0059]5.2.1挑取PCR验证为阳性的酵母细胞，接种到1ml YNB-CAA(2%葡萄糖)培养基中，30°C振荡培养过夜；
[0060]5.2.2通过分光光度计测定细胞培养液的0D600值，若0D600值小于2，则继续培养细胞，若0D600值为2-5，则收集细胞；
[0061]5.2.3室温，3000g离心10分钟，取沉淀；
[0062]5.2.4将沉淀重悬在YNB-CAA(2%半乳糖)培养基中，使0D600值为0.5-1 ；
[0063]5.2.5立即取出20D600单位细胞放置在冰上，作为酵母诱导表达的零时刻；
[0064]5.2.6将剩余酵母放入20°C摇床中，250转/分振荡培养，每隔12小时取出20D600单位的细胞放置到冰上，共收集5个时间点(O小时、12小时、24小时、36小时、48小时)待后续分析。
[0065]5.3流式细胞仪检测酵母表面展示GCRV-VP7蛋白
[0066]5.3.1取诱导表达不同时间点的酵母菌液，40C，3000g离心5分钟，去掉培养基；
[0067]5.3.2将细胞重悬在除菌的I X PBS缓冲液中，洗涤细胞一次；
[0068]5.3.3于4°C，3000g离心5分钟，去掉PBS，细胞重悬于250 μ IPBS溶液(含2 %BSA, 1:500稀释的小鼠抗GCRV-VP7多克隆抗体血清);
[0069]5.3.4细胞放置在冰上30分钟；
[0070]5.3.5 于 40C，3000g 离心 5 分钟，去掉 PBS ；
[0071 ] 5.3.6用除菌的I X PBS缓冲液洗涤酵母细胞一次；
[0072]5.3.7将酵母细胞重悬于250 μ I PBS溶液(含2% BSA, 1:100稀释的ant1-mouseIgG conjugated with dylight488)；
[0073]5.3.8将酵母细胞放置在冰上，避光孵育30分钟；
[0074]5.3.9用I X PBS缓冲液洗涤细胞两次；
[0075]5.3.10将细胞重悬于40 μ I除菌的IXPBS中，流式细胞仪分析抗体标记结果。
[0076]6、用表面展示有GCRV-VP7蛋白的ΕΒΥ100 Δ Μηη9细胞经腹腔注射的方式免疫BALb/c小鼠，三次免疫结束后，抽取小鼠血液制备抗血清，具体操作程序如下:
[0077]6.1从武汉大学中南医院购买5周龄Bal b/c雌小鼠，在实验室暂养一周；
[0078]6.2将EBY100 Δ Mnn9_VP7调至5 X 108个细胞/ml，通过腹腔注射免疫小鼠，每只小鼠注射0.2ml。对照组小鼠注射等浓度的未转化质粒的EBY100酵母菌，注射的体积仍为
0.2ml ；
[0079]6.3免疫后的第14天，腹腔注射与第一次等量的酵母细胞；
[0080]6.410天后，再次腹腔注射等量的酵母细胞增强免疫一次；
[0081]6.5第三次免疫十天后，摘眼球取血于离心管中；
[0082]6.6将离心管放入37°C培养箱中放置I小时，再置4°C冰箱过夜，使血清析出；
[0083]6.7于12000转/分离心10分钟，去掉沉淀，向血清加入等体积灭菌甘油保存在-20°C中备用。
[0084]7、用小鼠抗血清在CIK细胞上测试血清对GCRV病毒的中和能力
[0085]7.1将Mnn9酵母抗血清按1:50、1:100、1:200、1:400梯度稀释，与1:5000稀释病毒液混合，28°C孵育I小时；
[0086]7.2将多抗血清和病毒混合液加入铺有CIK细胞的24孔板中，室温放置30分钟；
[0087]7.3用MEM培养基洗涤24孔板3次；
[0088]7.4加入200 μ I含小牛血清的MEM培养基，28°C培养2天；
[0089]7.5吸出24孔板中的培养基，用PBS洗孔3次，加入4%的多聚甲醛固定细胞20分钟，PBS洗孔3次，0.1%结晶紫染液染色30分钟，用自来水洗去未结合的染液，拍照保存照片。
[0090]如图2所示，与对照组野生型的EBY100酵母细胞抗血清比较，EBY100 Δ Mnn9_VP7酵母抗血清明显对GCRV病毒具有中和能力，并且随着抗血清稀释倍数降低，抗血清对病毒的中和能力显著增加。当抗血清1:50稀释时，对病毒的中和能力达到66.7% ;而对照组EBY100抗血清对病毒没有中和能力，不随抗血清稀释倍数增加发生变化。这说明酵母表面展示的GCRV-VP7蛋白，诱导小鼠了产生了中和抗体，可以作为疫苗用于草鱼出血病防治。
【主权项】
1.一种酵母展示草鱼出血病疫苗，其特征在于，该疫苗为表面展示GCRV-VP7蛋白的EBYlOO Δ Mnn9酵母细胞。2.制备权利要求1所述的一种酵母展示草鱼出血病疫苗的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤: a、用玻璃珠破碎Mnnl基因敲除的酿酒酵母BY4741Λ Mnnl酵母细胞壁，用苯酚和氯仿从酵母细胞裂解液中抽提基因组DNA ; b、设计一对长引物，上游引物F9的序列为:GAATTTAAAAGAGCTAGAATAAAAAGTTAGGAAACAATGCGGATCCCCGGGTTAATTAA，下游引物 R9 的序列为:AACGCTATAGCTTCTGTATGCTTTTTGCTCAGTTGCTCAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC，用该对引物从BY4741 Δ Mnnl酵母基因组中扩增出含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段； C、用醋酸锂法将扩增出的含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段转化到EBY100酵母菌中，含有Mnn9基因同源臂序列的KanMAX抗性基因片段与EBY100酵母中的Mnn9基因发生同源重组，从而敲除Mnn9基因，并替换为KanMAX基因，然后用PCR和测序的方法确定Mnn9基因成功敲除，获得EBY100 Δ Mnn9酵母细胞； d、用上游引物VP7-F和下游引物VP7-R从pR/GCRV_VP7质粒上扩增GCRV-VP7基因，上游引物VP7-F序列为:CCGGGATCCATGCCACTTCACATGATTCC ;下游引物VP7-R序列为:CCGCTCGAGATCGGATGGCTCCACATGCA，将扩增出的 GCRV-VP7 基因片段连接到 pMD18_T 载体中，用限制性内切酶切下GCRV-VP7基因，再连接到pYDl质粒中，构建重组质粒pYDl_VP7 ; e、将pYDl-VP7重组质粒通过醋酸锂法转入EBY100Δ Mnn9酵母细胞，培养并用半乳糖诱导该酵母细胞，通过流式细胞术确认GCRV-VP7蛋白展示到EBY100 Δ Mnn9酵母细胞表面，该酵母细胞即为酵母展示草鱼出血病疫苗； f、用表面展示有GCRV-VP7蛋白的EBY100Δ Mnn9细胞经腹腔注射的方式免疫BALb/c小鼠，三次免疫结束后，抽取小鼠血液制备抗血清； g、用小鼠抗血清在CIK细胞上测试血清对GCRV病毒的中和能力，结果显示该抗血清对GCRV-873病毒具有中和作用，表明酵母表面展示的GCRV-VP7蛋白诱导小鼠产生了能中和病毒的抗体，可用作疫苗用于草鱼出血病防治。
【文档编号】C12R1/865GK105879022SQ201510405035
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年7月10日
【发明人】袁丽, 方勤, 罗绍祥, 闫利明, 戴和平, 张晓华
【申请人】中国科学院水生生物研究所, 中国科学院武汉病毒研究所