帕金森病动物模型的制备方法及其用图
【专利摘要】本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种帕金森病动物模型的制备方法及其用途。本发明中的帕金森病动物模型的制备方法包括：(1)在每只动物皮下注射大麻素受体拮抗剂，每天一次，连续5～15天；(2)将步骤(1)中得到的动物样本进行检测运动协调性的实验；(3)取步骤(2)评估后动物的脑部组织进行检测，即得帕金森病动物模型。通过本发明中的制备方法制备的动物模型具有造模成功率高，无其他毒副作用的优点，且获得的帕金森病动物模型可用于研究大麻素系统与帕金森病的病理进程的机制，进而筛选用于延缓、治疗帕金森病的药物，具有很好的应用前景。
【专利说明】
帕金森病动物模型的制备方法及其用途
技术领域
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体的，本发明涉及一种帕金森病动物模型的制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002]帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是继阿尔茨海默病后最常见的以黑质致密部多巴胺(DA)能神经元的变性、缺失为主要病理学改变的神经退行性疾病，在65-69岁的老年人群中发病率约占0.5%-1%，在80岁以上的老年人中发病率能达到I %-3%。虽然近些年来，随着对帕金森病研究的深入，已有一些治疗方法能够减轻疾病的某些症状，但是都达不到彻底治愈的目的，因此，更深入的研究H)的发病机制和治疗方法很有必要，而稳定高效的动物模型是深入研究该疾病的前提。
[0003]目前较为公认的建立PD模型的方法主要有两种:一种是应用6-羟基多巴胺(6-0HDA)注入黑质纹状体系统来损毁大鼠黑质-纹状体系统多巴胺(DA)能神经元所制成的模型，该建模需要三维立体定向注射，技术操作要求较高，存在较高失败率；另一种是运用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)制备猴等灵长类动物模型和C57B小鼠H)模型，但是MPTP对人类同样具有不可修复的神经毒性，操作需要严格的安全控制。且两种方法都不能准确模拟帕金森病的病理过程，比如MPTP模型中路易小体(Lewy body)并不出现。上述模型存在的不足之处极大地限制了这些模型的应用。本领域迫切需要开发更可靠的帕金森病动物模型。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种帕金森病动物模型的制备方法及其用途，解决了现有技术中造模成功率低，模型不可靠的问题。
[0005]为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种帕金森病动物模型的制备方法，包括以下步骤:(I)在每只动物皮下注射大麻素受体拮抗剂，每天一次，连续5?15天，SP得动物样本I; (2)将所述动物样本I进行检测运动协调性的实验，即得动物样本2; (3)取所述动物样本2的脑部组织进行检测，即得帕金森病动物模型。
[0006]本发明的另一目的在于是提供上述方法制备的该帕金森病模型的用途，其中，该帕金森病模型被用于大麻素系统参与帕金森病的病理过程机制的研究和药物开发。
[0007]本发明相对于现有技术而言，在动物体内注射大麻素受体拮抗剂，使动物出现帕金森病样症状，通过对帕金森病样动物进行行为学评估及脑部组织检测得到可靠有效的帕金森病动物模型，且提高了造模的成功率。
[0008]进一步地，大麻素受体拮抗剂优选为BML-190，BML-190可穿过血脑屏障，通过抑制CB2受体，抑制帕金森病相关蛋白Parkin/PINKl的活性，抑制PI3K/AKT信号转导通路，进而加剧多巴胺能神经元的死亡，使动物出现帕金森病的症状。
[0009 ]更进一步地，为了使被注射BML-190的动物出现帕金森病的症状，BML-190的质量浓度设置为20?40mg/kg。
[00?0]进一步地，检测运动协调性的实验为转棒实验，转速为4?40rpm，时间为200?400s，记录小鼠掉落时间，重复3次。
[0011]进一步地，动物脑部组织包括黑质区组织、海马区组织、脑干区组织、皮质区组织，黑质区组织、海马区组织、脑干区组织、皮质区组织为帕金森病变的主要脑区，取上述组织可以更好的检测到帕金森病变后脑组织的病变。
[0012]进一步地，动物为非人哺乳动物。
[0013]更进一步地，非人哺乳动物选自小鼠、大鼠。
[0014]更进一步地，所述小鼠为C57B小鼠，C57B小鼠为实验室常用帕金森病模型建立小
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[0015]更进一步地，大麻素受体拮抗剂注射于C57B小鼠的腹腔部位，本发明选取的药物注射部位为腹腔，小鼠腹腔部具有注射范围大、操作简单、易于实现的优点。
【附图说明】
[0016]图1是根据本发明实施方式一中的转棒实验分析BML-190对小鼠行为学影响的实验结果图；
[0017]图2是根据本发明实施方式一中的蛋白印迹分析BML-190对小鼠作用后脑部CB2受体蛋白和Pakin蛋白表达变化。
【具体实施方式】
[0018]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
[0019]本发明的第一实施方式涉及一种帕金森病动物模型的制备方法，包括以下步骤:
(I)在每只动物皮下注射大麻素受体拮抗剂，每天一次，连续5?15天，即得动物样本I; (2)将所述动物样本I进行检测运动协调性的实验，即得动物样本2; (3)取所述动物样本2的脑部组织进行检测，即得帕金森病动物模型。
[0020]作为一种非限制性实施方式，动物可以是非人哺乳动物，优选选自小鼠、大鼠。
[0021]作为一种非限制性实施方式，大麻素受体拮抗剂可以为BML-190。
[0022 ]举例来说:一种帕金森病小鼠模型的制备方法。
[0023]将体重(0.02g)均等的C57B小鼠随机分成4组，即:A组、B组、C组、D组，每组为12只小鼠，分别为A组小鼠每天腹腔注射ΙΟΟμΙ的磷酸缓冲盐溶液(PBS)，为正常对照组;B组小鼠每天腹腔注射ΙΟΟμΙ的BML-190、C组小鼠每天腹腔注射ΙΟΟμΙ的MPTP; D组小鼠每天腹腔注射ΙΟΟμΙ的BML-190和ΙΟΟμΙ的ΜΡΤΡ;其中，BML-190和MPTP注射的时间相隔6h。连续注射12天后(注意:每天固定的时间给药，其中，上午9点注射MPTP，下午3点注射BML-190、PBS)。将4组小鼠进行转棒实验分析，将转棒实验中运动协调能力明显下降的小鼠视为帕金森病小鼠模型，其中，B组小鼠的建模成功率高达92 %。
[0024]另外，实验中每隔四天称一次小鼠的体重，其中，帕金森病建模组的小鼠比健康对照组体重低8.9%，并观察小鼠毛色。实验终点时，小鼠转棒实验进行运动协调能力分析，将转棒的速度从4转调到40转，将所有小鼠在旋转装置中预培训以达到一个稳定的行为，记录小鼠可以停留在旋转杆上的时间，重复3次。(以小鼠掉落时间的缩短判断帕金森病程度，帕金森病越严重，小鼠的运动能力越差，反应越迟缓，即在旋转装置上停留的时间越短)。
[0025]值得注意的是，小鼠在转棒上停留的时间是判断帕金森病症的一个金标准实验，如图1所示，BML-190给药的B组帕金森病小鼠转棒掉落时间显著低于(P〈0.001) A组正常对照组小鼠的水平，而BML-190联合MPTP给药的D组小鼠转棒掉落时间则更低，这说明了 CB2受体拮抗剂可以诱发加重帕金森症状。
[0026]为分析BML-190对小鼠脑部神经元凋亡的影响，在本实施方式中，将上述四组小鼠处死，并取四组小鼠的黑质、海马、脑干、皮质等脑部各区的组织，提取各个组织中的总蛋白通过蛋白印迹法分析检测多巴胺相关蛋白表达情况，如图2所示，BML-190给药后的小鼠，抑制了黑质区和海马区CB2的表达，抑制黑质区和海马区Par k i n/P INKI的活性，抑制P13K/AKT通路，在病理水平说明CB2小分子措抗剂可诱发帕金森病，需要说明的是，图2中的Contro I即为PBS正常对照组。
[0027]本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
【主权项】
1.一种帕金森病动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)在每只动物皮下注射大麻素受体拮抗剂，每天一次，连续5?15天，即得动物样本I; (2)将所述动物样本I进行检测运动协调性的实验，即得动物样本2； (3)取所述动物样本2的脑部组织进行检测，即得帕金森病动物模型。2.根据权利要求1所述的帕金森病动物模型的制备方法，其特征在于，所述大麻素受体拮抗剂为BML-190。3.根据权利要求2所述的帕金森病动物模型的制备方法，其特征在于，所述BML-190的质量浓度为20?40mg/kg。4.根据权利要求1所述的帕金森病动物模型的制备方法，其特征在于，所述检测运动协调性的实验为转棒实验，转速为4?40rpm，时间为200?400s，记录小鼠掉落时间，重复3次。5.根据权利要求1所述的帕金森病动物模型的制备方法，其特征在于，所述动物脑部组织包括黑质区组织、海马区组织、脑干区组织、皮质区组织。6.根据权利要求1所述的帕金森病动物模型的制备方法，其特征在于，所述动物为非人哺乳动物。7.根据权利要求6所述的帕金森病动物模型的制备方法，其特征在于，所述非人哺乳动物选自小鼠、大鼠。8.根据权利要求7所述的帕金森病动物模型的制备方法，其特征在于，所述小鼠为C57B小鼠。9.根据权利要求8所述的帕金森病动物模型的制备方法，其特征在于，所述大麻素受体拮抗剂注射于所述C57B小鼠的腹腔部位。10.根据权利要求1至9任一项所述方法制备的帕金森病动物模型，其特征在于，将所述帕金森病动物模型用于大麻素系统参与帕金森病的病理过程机制的研究和药物开发。
【文档编号】A61P25/16GK105878251SQ201610257341
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】靳令经, 朱融融
【申请人】上海市同济医院