一种IgAN动物模型的构建方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种IgAN动物模型的构建方法。具体步骤为：(a)体外制备IgA免疫复合物；(b)将制备得到的IgA免疫复合物注射到小鼠体内。本发明的建模方法操作简单易行、成功率高、重复性好、机体损害小，并且能够用于探究早期IgAN患者体内IgA免疫复合物的清除机制，筛选能够清除系膜区IgA免疫复合物沉积的药物、以及评价使用生物学方法清除异常沉积的IgA来治疗IgAN的效果。
【专利说明】一种I gAN动物模型的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种动物模型的构建方法及其应用，具体为一种IgAN动物模型的构 建方法及其应用。
【背景技术】
[0002] IgA肾病（IgAN)是全球范围内最为常见的原发性肾小球疾病，大约25%?50% 的患者在疾病诊断后25年内发展到终末期肾衰竭（ESRD);患者即使接受肾移植，仍有超过 50%的患者在肾移植术后两年内IgAN复发。因此，对IgAN的发病机制及其防治研究具有 重要的临床价值和社会意义。
[0003] 现有研究表明，IgAN作为一种自身免疫性疾病，是以IgA或以IgA为主的免疫球蛋 白在肾小球系膜区及毛细血管袢呈弥漫颗粒状或团块状沉积所引起一系列临床及病理改 变。半乳糖缺失的IgA暴露其铰链区抗原决定簇，使得针对异常IgA的自身IgG和IgA抗 体产生，形成的免疫复合物沉积于系膜区，激活系膜细胞及补体系统导致肾脏损伤。
[0004] 目前，在原治疗基础上从自身免疫发病机制角度出发，探索新的IgAN治疗思路成 为了研究热点。但是，各种新的治疗方法和药物能否有效减少或者去除肾小球的IgA免疫 复合物沉积，都需要先通过动物实验来进行验证。为了解决上述问题，本发明提供了一种构 建IgA免疫复合物沉积动物模型的方法，构建得到的动物模型能够成功模拟临床患者体内 IgA免疫复合物在肾小球系膜区沉积的现象，进而为研究IgAN发病机制和药物对免疫复合 物的降解作用提供研究基础。
[0005] 已经报道的可以用于构建IgAN动物模型的方法包括：尾静脉注射葡聚糖G200的 方法，口服或静脉注射葡萄球菌、大肠杆菌、副流感嗜血杆菌、仙台病毒等病原微生物成分 或免疫复合物的方法，用穿通支原体（Mpe)经尿道上行感染小鼠的方法，以及口服牛血清 白蛋白（BSA)加尾静脉注射葡萄球菌肠毒素（SEB)复合法等。但是上述方法在操作上繁琐 复杂，造模时间长，而且在造模过程中还存在着对其他器官造成严重损伤引起动物死亡，免 疫复合物沉积不明显，重复性不好等问题。因此，寻找一种操作简单易行、成功率高、重复性 好、机体损害小的IgAN动物模型构建方法，并把构建得到的模型用于IgAN的病理和药理研 究，能够为IgAN患者的临床治疗提供参考。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种IgAN动物模型的构建方法，模拟临 床IgAN患者体内IgA免疫复合物在肾小球系膜区沉积的现象，仅使用简单的步骤就能够构 建出可以用于研究IgA发病机制和药物对免疫复合物的降解作用的IgAN动物模型。
[0007] 本发明构建IgAN动物模型的方法包括以下步骤：
[0008] (a)体外制备IgA免疫复合物；
[0009] (b)将步骤（a)制备得到的IgA免疫复合物注射到小鼠体内，注射量为750 μ 1/ 次，注射一次。
[0010] 所述"免疫复合物"是指抗原和抗体特异性结合形成的复合物。
[0011] 其中，步骤（a)中IgA免疫复合物为IgAl-IgG免疫复合物。用于制备步骤（a)中 IgA免疫复合物的IgAl可以是正常糖基化的IgAl，或异常糖基化的IgAl。
[0012] 其中，步骤（a)中制备IgA免疫复合物的抗原：抗体的比例为（1:1)-(2:1)。优选 地，使用商品化IgAl制备IgA免疫复合物时，抗原：抗体的比例为1:1 ;使用IgAN患者血清 来源的IgAl制备IgA免疫复合物时，抗原：抗体的比例为2:1。
[0013] 所述商品化IgAl是指Human IgAlprotein，产品编号ab91020，abcom公司，或 Human IgAlprotein，产品编号 30C_CP7034，fitzgerald 公司，或 Human IgAl, Myelom，产品编 号 400109, Merck Chemicals 公司。
[0014] 其中，步骤（b)所述的注射可选择肌肉注射，尾静脉注射，但优选为尾静脉注射； 所述的小鼠优选为Babl/c小鼠。
[0015] 判断所构建动物模型体内的IgA免疫复合物沉积程度的方法为：分别在lh、4h、 8h、16h、24h时间点处死小鼠，取肾组织做冰冻切片，免疫荧光检测IgA免疫复合物沉积情 况。
[0016] 本发明还提供利用本发明方法制备的动物模型在筛选IgAl酶类药物中的用途， 包含以下步骤：
[0017] (1)将IgAl酶类药物注射到动物模型体内；
[0018] (2)免疫荧光判断动物模型体内IgA免疫复合物的分解程度；
[0019] (3)根据分解程度对IgAl酶类药物的效果进行评价。
[0020] 其中，步骤⑴所述的IgAl酶类药物是商品化的IgAl酶，或细菌中提取的IgAl 酶。
[0021] 在一个具体的实施例中，采用商品化的人多发性骨髓瘤血浆IgAl或者IgAN患者 血清中提取的低糖基化IgAl作为抗原，采用商品化的IgG作为抗体在体外形成免疫复合 物。
[0022] 在一个具体的实施例中，采用商品化的IgAl酶和从流感嗜血杆菌ATCC49247中提 取的IgAl酶注射到动物模型中，评价不同的IgAl酶对体内IgAl的消化能力。
[0023] 已有研究提示，即使行肾移植治疗，约50%的病人术后3-5年IgAN将再次复发，其 原因仍是IgA免疫复合物沉积于移植肾。说明清除异常沉积的IgA免疫复合物是治疗的根 本。现有的制作IgAN动物模型的方法存在繁琐复杂的问题，本发明方法从模拟IgAN的发 病机制出发，将体外形成的IgA免疫复合物直接注射到小鼠体内，通过免疫荧光观察IgA及 其IgA免疫复合物在肾小球系膜区的沉积现象，为筛选能够分解系膜区免疫复合物沉积的 药物、探究早期IgA清除机制，以及采用生物学方法清除异常沉积的IgA从而达到治疗IgA 肾病的研究提供一种简单易行的动物模型。
[0024] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0025] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图llgA患者血清中Jacalin结合蛋白的SDS-PAGE电泳：
[0027] 1. IgAl标准品；2.稀释血清；3. 50 %饱和（NH4)2S04沉淀；4. Jacalin穿透液； 5. PBS流出液；6.蜜二糖洗脱液1 ;7.蜜二糖洗脱液2 ;8.蜜二糖洗脱液3 ;9.蜜二糖洗脱 浓缩液
[0028] 图2Western blot鉴定提取的IgAl蛋白：
[0029] 1. IgA患者血清；2.过Jacalin纯化柱穿透液；3. PBS流出液；4.过Jacalin柱蜜 二糖洗脱液；5. PBS流出液；6-9.过S印hadex G-200分子筛层析流出液
[0030] 图3Jacalin结合蛋白过Sephadex G-200分子筛层析：
[0031] 第1峰为plgA，第2峰为mlgA，第3峰为非IgA峰
[0032] 图4IgAl蛋白过Sephadex G-200分子筛层析：
[0033] 第 1 峰为 plgAl，第 2 峰为 mlgAl
[0034] 图5-1商品化的IgAl形成的免疫复合物1的免疫荧光观察图（4h)
[0035] 图5_2IgAN患者血清中提取的低糖基化IgAl形成的免疫复合物2的免疫荧光观 察图（4h)
[0036] 图5-3阴性对照组的免疫荧光观察图
[0037] 图5-4同源对照组的免疫荧光观察图
[0038] 图5-5免疫复合物沉积8h的免疫荧光观察图
[0039] 图5-6免疫复合物沉积24h的免疫荧光观察图
[0040] 图5-7免疫复合物沉积1周后重复注射1次的免疫荧光观察图
[0041] 图6-1低糖基化IgAl形成的免疫复合物与NaCl (对照）作用后的免疫荧光观察 图
[0042] 图6-2低糖基化IgAl形成的免疫复合物与提取自流感嗜血杆菌ATCC49247的 IgAl酶作用后的免疫荧光观察图
[0043] 图6-3低糖基化IgAl形成的免疫复合物与商品化的IgAl酶作用后的免疫荧光观 察图
[0044] 图6-4商品化IgAl形成的免疫复合物与NaCl (对照）作用后的免疫荧光观察图
[0045] 图6-5商品化IgAl形成的免疫复合物与提取自流感嗜血杆菌ATCC49247的IgAl 酶作用后的免疫荧光观察图
[0046] 图6-6商品化IgAl形成的免疫复合物与商品化的IgAl酶作用后的免疫荧光观察 图
[0047] 图5-1至图6-6中，a为荧光抗体2 :检测IgAl的Fc段；b为荧光抗体1 :检测IgAl 的F(ab)段；c为荧光抗体3 :检测羊抗人抗体的F(ab)段，即免疫复合物中的IgAl的Fab 段。
【具体实施方式】
[0048] 用于形成免疫复合物的抗原：
[0049] 抗原1 :购买商品化的人多发性骨髓瘤血楽IgAl, Myeloma(Fitzgrald公司）
[0050] 抗原2 :从IgAN患者血清中提取的低糖基化IgAl
[0051] 用于形成免疫复合物的抗体：
[0052] 抗体 1 :AffiniPure F (ab，）2Fragment Goat Anti-Human IgG，F (ab，）2Fragment Specific (Jackson 公司），为特异抗 IgAl 的 IgG
[0053] 抗体 2 :ChromPure Goat IgG. F (ab，）2Fragment (Jackson 公司），为非特异抗 IgAl 的普通的IgG
[0054] 荧光抗体：
[0055] 荧光抗体1 :检测IgAl的F(ab)段
[0056] (FITC)-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgG, F (ab，）2Fragment Specific (Jackson 公司）
[0057] 荧光抗体2 :检测IgAl的Fc段
[0058] Mouse monoclonal B35〇64B4Anti_Human IgAlFc (FITC) ab"793 (abeam 公司）
[0059] 荧光抗体3 :检测羊抗人抗体的F(ab)段
[0060] Rhodamine (TRITC) - conjugated AffiniPure Rabbit Anti -Goat IgG, F(ab，）2Fragment Specific (Jackson 公司）
[0061] 8-10W的Babl/c雌性小鼠购自成都达硕生物科技有限公司
[0062] 实施例1本发明IgA免疫复合物的制备
[0063] 将抗原1 (商品化的IgAl)与抗体1按照1:1浓度比例形成免疫复合物1 :
[0064] 将商品化 IgAl 稀释至 lmg/ml 与 lmg/ml Goat anti-human F(ab) 2 抗体，即抗体 1 混合，室温放置5min后，取5 μ 1滴在洁净载玻片上，显微镜下观察可见有明显复合物形成， 将形成的复合物置4°C保存备用。
[0065] 实施例2本发明IgA免疫复合物的制备
[0066] 1、从IgAN患者血清中提取低糖基化IgAl
[0067] 将IgAN患者血清样品通过硫酸铵沉淀、阴离子交换进行初步分离纯化后，利用凝 集素 Jacalin对IgAl的糖链末端特异结合的特性，通过Jacalin亲和层析柱制备IgAl亚 型纯品，利用葡聚糖凝胶S印hadex G-200可分离5-600KD分子量范围内的蛋白质原理，将 IgAl通过SephadexG-200分子筛层析柱进一步分离获得不同形式的IgAl，混合不同形式的 IgAl即可得到总IgAl。
[0068] 1. 1硫酸铵沉淀
[0069] 步骤：取血清5. 0ml于小试管中，边搅拌混匀边缓慢滴加饱和硫酸铵5. 0ml，防止 形成团块降低沉淀物的特异性，混匀后室温静置30min或置4°C冰箱过夜，高速低温离心 10000rpm，10分钟，将上清液（含白蛋白）弃去，取沉淀物（含球蛋白）溶于0.02mol/LTris 缓冲液（PH8. 0)中，重复洗涤一次，加入2ml0. 02mol/L Tris缓冲液（pH8. 0)溶解，此液即为 粗提的Y -球蛋白溶液，将溶解的粗提液转移到10KD的透析卡中，置于盛适量Tris缓冲 液的大烧杯中，4°C搅拌情况下透析过夜，用纳氏试剂检测水中的NH4+，直到阴性为止。
[0070] 1. 2DEAE52-纤维素离子交换层析
[0071] 材料：样品（经ρΗ8· 0,0· 02mol/LTris缓冲液透析过的IgAN患者血清），DEAE - 纤维素（阴离子交换剂），2. 5 X 25cm层析柱及不同离子强度的Tris洗脱剂。
[0072] 步骤：用0.02M Tris缓冲液（pH8.0)平衡柱子，将透析袋内的蛋白质溶液用 0. 22 μ m的过滤器过滤后缓慢加入层析柱上，开下端出口，使样品进入柱床，吸附的蛋白质， 用连续增加 NaCl的浓度来洗脱，用线性梯度缓冲液（20-200mmol/L NaCl)洗脱，流速lml/ min，分部收集洗脱液1. 5ml/管。
[0073] 1. 3Jacalin 亲和层析
[0074] 试剂
[0075] (1) 0· 1M，PH77· 4 憐酸盐缓冲盐液（Phosphate Buffered Saline，PBS) (2) 0· 1M 蜜二 糖 /PBS Elution Buffer
[0076] (3)0. 02% NaN3
[0077] 实验步骤：
[0078] (1)用5倍柱体积的PBS液平衡层析柱；
[0079] (2)将样品手动加入Immobilized Jacalin亲和层析柱，4°C孵育30min ;
[0080] (3)用10倍柱体积的PBS洗柱（或直至洗脱液在280nm的光吸收度低于0· 01)，血 清中的IgAl将吸附于层析柱上，不与柱子结合的蛋白质随缓冲液流出柱外，弃去洗脱液；
[0081] (4)用5倍柱体积的0· 1M蜜二糖/0· 1M PBS (PH7. 4) 0· 5ml/min洗脱层析柱至紫外 分光光度仪280nm波长下光吸收度低于0. 01，吸附于柱上的血清IgAl将随溶液流出，2ml/ 管子收集洗脱液；
[0082] (5)再用10倍柱体积PBS平衡层析柱，柱子保存于含0· 02% NaN3的超纯水中：
[0083] (6)将洗脱液转移入分子限量10KD的透析袋中，结扎，用相对分子质量为20000的 聚乙二醇（PEG)4°C浓缩。
[0084] 1. 4Superdex2〇0 凝胶柱层析
[0085] 试剂
[0086] 0· 05M PB/0. 15M NaCl 缓冲液（PH7. 2)
[0087] 实验步骤：
[0088] (1)将浓缩洗脱液上样于Sephacryl S200分子筛层析柱；
[0089] (2)用 3 倍柱体积的 0· 05M ΡΒ/0· 15M NaCl 缓冲液（PH7. 2) 0· 5ml/min 洗柱，每种 IgAl中含有不同分子量成分将按照分子量由大到小的顺序随缓冲液流出柱外，共有3个洗 脱峰，分别为多聚 IgAl (polymeric IgAl，plgAl)、单体 IgAl (monomeric IgAl，mlgAl)和其 他非IgAl蛋白；
[0090] (3)收集峰1和峰2洗脱液，PEG20000浓缩后，重复上样，再次洗脱，此次有2个洗 脱峰，收集各峰洗脱液，混合后得到纯品IgAl，PEG20000浓缩后保存于EP管中，BCA法测蛋 白浓度。
[0091] (4)胶体的再生与保存：用0· 5mol/L NaCl溶液浸泡胶体30min，倾去NaCl溶液， 蒸馏永冲洗数次，再用缓冲液充分平衡即可。
[0092] 1. 5western blot 法验证提取的 IgAl
[0093] SDS-PAGE电泳后，转膜，5%脱脂牛奶封闭lh，加入TBST稀释的辣根过氧化物酶标 记的羊抗人IgAl抗体（a链，SouthernBiotech公司），37°C杂交袋中孵育2h，TBST洗3次， 进行化学发光反应。
[0094] 纯化提取结果：分离纯化血清IgA的SDS-PAGE电泳结果如图1所示。Western Blot 法鉴定提取的血清IgAl如图2所示。Jacalin结合蛋白过Sephadex G-200分子筛层析分 离结果如图3所示。不同形式IgAl过Sephadex G-200分子筛层析分离结果如图4所示。
[0095] 2、制备免疫复合物
[0096] 将抗原2 (按照上述方法从患者血清提取的低糖基化IgAl)与抗体1按照2:1的 浓度比例体外形成免疫复合物2 :
[0097] 将制备的 IgAl 稀释至 2mg/ml 与 lmg/ml Goat anti-human F(ab) 2 抗体，即抗体 1 混合，室温放置5min后，取5 μ 1滴在洁净载玻片上，显微镜下观察可见有明显复合物形成， 将形成的复合物置4°C保存备用。
[0098] 实施例3本发明动物模型的制备
[0099] 将实施例1和实施例2得到的免疫复合物尾静脉注射到小鼠体内，构建类似于 IgAN患者的免疫复合物沉积的动物模型。
[0100] 3. 1实验分组：
[0101] 随机选取8-10W的Babl/c雌性小鼠30只，进行分组，每组5只。
[0102] 3. 2尾静脉注射：
[0103] 实验组1注射750μ 1的免疫复合物1(商品化IgAl+抗体1);实验组2注射750μ 1 的免疫复合物2 (血清提取的低糖基化IgAl+抗体1);阴性对照组分别为注射商品化IgAl 或血清提取的低糖基化IgAl+NaCl ;同源对照组分别为注射商品化IgAl或血清提取的低糖 基化IgAl与抗体2形成的免疫复合物3 ;
[0104] 3. 3检测免疫荧光，判断免疫复合物的沉积程度
[0105] (1)分别在111、411、811、1611、2411，颈处死小鼠，取小鼠肾组织，做冰冻切片 ；
[0106] (2)免疫荧光检测各时间点肾脏IgAl及含IgAl的免疫复合物沉积情况。通过荧 光抗体1和荧光抗体2来检测IgAl沉积情况，另用荧光抗体3来检测免疫复合物中抗体的 沉积情况。
[0107] (3)动物实验荧光染色方法
[0108] 1)取各组织切片，每只小鼠选取3个标本，双蒸水脱胶后用圈存笔圈存组织，冷丙 酮 4°C固定 5 - lOmin，PBST 洗 5minX3 次。
[0109] 2)封闭：各标本加入即用型兔血清30 - 40 μ 1，37度温箱湿盒内孵育lh，PBST洗 5minX 3 次。
[0110] 3)避光下，将按1:50稀释的兔抗人IgG - Fab和兔抗羊IgG - Fab30y 1共同加入 一标本上，1:50稀释的鼠抗人IgA - Fc30 μ 1加入另一标本，第三个标本则加入PBS做阴性 对照，37°C温箱湿盒内孵育45min，PBST洗5minX7次。
[0111] 4)各标本上加入1:5000稀释的DAPI30 - 40μ 1，室温湿盒内孵育3min，PBST洗 3min〇
[0112] 5)封片：各标本上加入15 μ 1抗焚光淬灭剂，倾斜盖上盖玻片，正置焚光显微镜下 观察。
[0113] 实验结果：在荧光显微镜下，与阴性对照组（如图5-3)和同源对照组（如图5-4) 相比，无论是免疫复合物1(如图5-1)还是免疫复合物2(如图5-2)均能明显观察到免疫复 合物在肾小球系膜区的沉积现象。在注入小鼠体内lh到8h内，荧光强度无明显差别，16h 时荧光强度有逐渐增强趋势，24h时的荧光强度明显强于8h，差异有统计学意义（P < 0. 05) (如图5-5和5-6所示）。
[0114] (表1为4h时的荧光面积和强度）
[0115] 表1免疫荧光分析结果G=S),
[0116]
【权利要求】
1. 一种IgAN动物模型的构建方法，包括以下步骤： (a) 体外制备IgA免疫复合物； (b) 将步骤（a)制备得到的IgA免疫复合物注射到小鼠体内，注射量为750μ 1/次，注 射一次。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（a)所述IgA免疫复合物为IgAl-IgG 免疫复合物。
3. 根据权利要求1-2任意一项所述的方法，其特征在于：步骤（a) IgA免疫复合物中， IgAl是正常糖基化的IgAl，或者是异常糖基化的IgAl。
4. 根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于：制备IgA免疫复合物的抗原： 抗体的比例为（1:1)-(2:1)。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：制备IgA免疫复合物的抗原：抗体的比例 为 1:1。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：制备IgA免疫复合物的抗原：抗体的比例 为 2:1。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（b)所述的注射为尾静脉注射。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（b)所述的小鼠为Babl/c小鼠。
9. 一种权利要求1?8所述的方法制备的动物模型。
10. 权利要求9所述的动物模型在筛选IgAl酶类药物中的用途，包含以下步骤： (1) 将IgAl酶类药物注射到动物模型体内； (2) 免疫荧光判断动物模型体内IgA免疫复合物的分解程度； (3) 根据分解程度对IgAl酶类药物的效果进行评价。
11. 根据权利要求10所述的用途，其特征在于：步骤（1)所述的IgAl酶类药物是商品 化的IgAl酶，或细菌中提取的IgAl酶。
【文档编号】G01N33/53GK104049070SQ201410299703
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月27日 优先权日:2014年6月27日
【发明者】樊均明, 王丽, 文集, 李雪英 申请人:樊均明