帕金森病的生物标志物的制作方法

专利名称：：帕金森病的生物标志物的制作方法
技术领域：
：本发明一般而言涉及分子生物学、神经生物学、药理学以及诊断、预后或预防/治疗帕金森病(PD)的领域，尤其是涉及帕金森病的生物标志物。
背景技术：
：帕金森病是一种进行性神经退行性病变，其特点是黑质中多巴胺能神经元的损失以及存活神经元中存在包含体(Lewy小体)。帕金森病的典型临床特征包括进行性震颤、强直和运动迟緩。然而，在其早期阶段，帕金森病是很难诊断的，这是由于缺乏临床症状并且缺乏可靠的生物标志物。此外，帕金森病可能与其他疾病十分类似，这其中包括但不限于以下几种疾病，如特发性震颠和多系统萎缩，这使得可能的诊断更为复杂。可以基于仅在脑内易发病变区域中细胞显著丧失之后才出现的神经学表现来作出PD诊断。
发明内容本发明一般涉及血清样品的分析性测试，在一些方面中还涉及为了帕金森病的诊断、预后或预防/治疗而进行的对生物标志物的说明。在本发明的一个方面中，本文提供了帕金森病的诊断或监测方法，其包括(a)测定受试者样品中至少一种生物标志物的水平，其中所述生物标志物选自触珠蛋白、运铁蛋白、栽脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体以及运甲状腺素蛋白(trans仇yretin,TTR);(b)将样品中生物标志物的水平与参考表达水平进行比较，其中样品中生物标志物的水平与参考表达水平的差异指示了受试者中PD的存在或该病的发展阶段。在一个实施方案中，参考水平是指未患帕金森病的对照群体中至少一种生物标志物的水平。在一个实施方案中，参考水平是指更早些的某个时间受试者中至少一种生物标志物的水平。在一个实施方案中，参考水平是指接受治疗方案之前受试者中至少一种生物标志物的水平。4在一个实施方案中，所述样品选自血浆、血清、全血和脑脊液(CSF)。在一个实施方案中，测定步骤包括测量样品中至少一种生物标志物多肽的量。在一个实施方案中，测定步猓包括测量样品中至少一种生物标志物的翻译后修饰多肽的量。在一个实施方案中，测定步骤中包括测量样品中至少一种生物标志物的单体或多聚体，或者对单体和多聚体均进行测量。在一个实施方案中，至少有一种生物标志物是运甲状腺素蛋白。在一个实施方案中，对至少一种生物标志物水平的测定步猓包括测量样品中单体或二聚体形式运甲状腺素蛋白的相对量。在一个实施方案中，单体形式运甲状腺素蛋白的水平与参考水平相比有所提高，从而指示受试者患有帕金森病，或指示该病的阶段。在一个实施方案中，二聚体形式运甲状腺素蛋白水平与参考水平相比有所降低，从而指示受试者患有帕金森病，或指示该病的阶段。在一个实施方案中，所述测定步骤通过免疫测定来进行。在一个实施方案中，所述免疫测定是ELISA或者western印迹。在一个实施方案中，所述测量步骤是利用双向凝胶电泳和质镨来进行的。在一个实施方案中，选择治疗方案的步骤是基于受试者患有帕金森病这一情况或者基于该病的阶段来进行。在一个实施方案中，测定至少一种生物标志物的步骤是在已对受试者施用该治疗方案之后进行的。在本发明的另一个方面中，本文提供了筛选可用于治疗帕金森病的化合物的方法，包括(a)在已施用测试化合物的受试者的样品中测量至少一种生物标志物的表达水平，其中所述生物标志物选自触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体以及运曱状腺素蛋白；(b)将所述生物标志物的表达水平与参考表达水平进行比较；(c)确定测试化合物的效力，其中所述生物标志物的表达水平与参考表达水平相比的差异指示该测试化合物可用于治疗帕金森病。在一个实施方案中，参考水平是接受测试化合物之前该受试者中至少一种生物标志物的表达水平。在本发明的另一个方面中，本文提供了用于诊断或监测受试者的帕金森病的试剂盒，其包括(a)用于测量受试者样品中至少一种生物标志物的一种或多种检测试剂，其中所述生物标志物选自触珠蛋白、运铁蛋白、栽脂蛋白A-I前体、oil-抗胰蛋白酶前体以及运甲状腺素蛋白；(b)至少一种来自未患帕金森病对照群体的对照样品；以及(c)所述一种或多种检测试剂的使用说明。在一个实施方案中，本发明提供至少一种生物标志物的一种或多种检测试剂用于制备帕金森病的诊断或监测试剂盒的用途，其中所述至少一种生物标志物选自触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体和运甲状腺素蛋白。在一个实施方案中，其中所述试剂盒用于测定来自受试者的样品中所述至少一种生物标志物的水平，并与参考水平进行比较，其中样品中所述至少一种生物标志物的水平与参考水平的差异指示该受试者患有帕金森病，或者指示帕金森病的阶段。在一个实施方案中，其中所述参考水平是未患帕金森病的受试者对照群体中所述至少一种生物标志物的水平。在一个实施方案中，其中所述参考水平是早些时候该受试者中所述至少一种生物标志物的水平。在一个实施方案中，其中所述参考水平是该受试者在接受治疗方案之前所述至少一种生物标志物的水平。在一个实施方案中，其中所述样品选自血浆、血清、全血和脑脊液。在一个实施方案中，其中所述测定包括测量样品中所迷至少一种生物标志物的多肽的量。在一个实施方案中，其中所述测定包括测量样品中所述至少一种生物标志物的翻译后修饰多肽的量。在一个实施方案中，其中所述测定包括测量样品中单体或多聚体形式的所述至少一种生物标志物的量，或者对这两种形式均进行测量。在一个实施方案中，其中所述至少一种生物标志物为运甲状腺素蛋白。在一个实施方案中，其中所述测定至少一种生物标志物的水平包括6测量样品中运甲状腺素蛋白单体或二聚体形式的相对量。在一个实施方案中，其中单体形式运曱状腺素蛋白的水平与参考水平相比发生提高，指示该受试者患有帕金森病，或者指示帕金森病的阶段。在一个实施方案中，其中二聚体形式运曱状腺素蛋白的水平与参考水平相比发生降低，指示该受试者患有帕金森病，或者指示帕金森病的阶段。在一个实施方案中，其中所述测定通过免疫测定进行。在一个实施方案中，其中所述免疫测定提供ELISA或western进行。在一个实施方案中，其中所述测定步骤通过双向电泳和质谱分析来实现。以上的概述仅用于说明，而并无意进行任何形式的限制。除了上述说明性的方面、实施方案和特征之外，其它更多的方面、实施方案和特征可在参考附图和下文的详细描述之后将是#明显的。附图简述图1A和1B显示帕金森病患者和对照群体的血清中差异表达的蛋白质点这一示例性实施方案的双向凝胶图像。图2显示对切下的双向凝胶多肽样品进行串联质谱(MS)这一说明性示例方案中图片，所述多肽样品的质荷比(m/z)为697.93。图3A显示用帕金森病患者和对照的血清进行TTRwestern印迹这一示例性实施方案的图片。图3B显示单体及二聚体TTR相对强度这一示例性实施方案的图片。具体实施例方式本文公开用于至少部分基于样品测试结果来检测受试者中是否存在PD或检测其阶段的蛋白质和方法。本文还公开用于至少部分基于样品测试结果来监测已诊断为帕金森病的受试者中疾病发展状态的蛋白质和方法。本文公开的测试样品包括但不限于如血(或血液的级分，包括但不限于例如血浆或血清)、淋巴液、粘液、泪液、唾液、嚢液、尿液、粪便、脑脊液(CSF)、腹水、全血以及身体组织的活检样品。本发明一般提供对样品中的例如(但不仅限于)触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体蛋白、运曱状腺素蛋白或其任何翻译后修饰变体的检测、测量和比较。相应地，本发明的多个方面涉及对检测样品中瞬时生物标志物(instant-biomarker)的收集、制备、分离、鉴定、表征和比较。本发明还涉及检测和/或监测含有触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体蛋白、TTR或其任何翻译后修饰变体的样品，以上标志物可单独或联合用于确定受试者是否患有帕金森病，或确定其发病阶段。另一个方面包括基于受试者中PD的存在与否或其程度来选择治疗方案。相应地，本发明还涉及选择和监测药剂(例如药物、化合物)对生物标志物表达的影响，如本文所述。本发明的另一个方面涉及用于检测和监测PD的诊断试剂盒，其在下文的部分中进一步详细描述。实施本发明时，使用了分子生物学、蛋白质生物化学、细胞生物学、免疫学、微生物学和DNA重组的常规技术。这些技术是众所周知的，并且分别在许多文献中得到了阐述，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,第I-III巻，Ausubel编辑.(1997);Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1989);DNACloning:APracticalApproach,第一巻和第二巻，Glover编辑(1985);OligonucleotideSynthesis,Gait编辑(1984);NucleicAcidHybridization,Hames&Higgins编辑.(1985);TranscriptionandTranslation,Hames&Higgins编辑.(1984);AnimalCellCulture,Freshney编辑.(1986);ImmobilizedCellsandEnzymes(IRLPress,1986);Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning;Meth.Enzymol.丛书，(AcademicPress,Inc.,1984);GeneTransferVectorsforMammalianCells,Miller&Calos编辑.(ColdSpringHarborLaboratory,NY,1987);和Meth.8Enzymol.，第154和155巻，Wu&Grossman和Wu编辑。用于检测和测量多肽基因产物表达的水平(即基因翻译水平)的方法在本领域中是众所周知的，包括使用多肽检测法，其包括但不限于例如抗体检测和定量技术。(还可参阅Strachan&Read,HumanMolecularGenetics,第二版.(JohnWileyandSons,Inc"NY，1999)).单位、前缀和符号均以其公认的SI形式表示。除非另有说明，氨基酸序列是按照从氨基端到羧基端方向从左向右进行书写。本文中的氨基酸可按照IUPAC-IUBMB术语命名委员会所推荐的公认的三字母符号或单字母符号来表示。在下文的描述中广泛运用了许多术语。本文的这些用法是为了方便对本发明的了解。以下术语通过参考说明书整体而得到更充分的定义。在本文中，除非明确指明，当没有数量词修饰或以"一种(个)"表示时，相应的名词应理解为"一或多种(个)"。本文所使用的对受试者"施用"药剂或药物包括将化合物引入或递送至受试者从而发挥其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径来进行，所述途径包括经口、鼻内、胃肠外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠或局部。施用包括自我施用或由他人施用。还应理解，所述对医学状况的多种治疗或预防模式旨在表示"基本上"，这包括完全治疗或预防，但也包括得到了一些生物学或医学相关结果的非完全治疗或预防。术语"评价"和"评估"可互换使用，是指任何形式的测量，包括确定因素存在与否。术语"确定"、"测量"、"评估"和"测定"可以互换使用，并且定量和定性测量均包括在内。评估可以是相对或绝对的。"评估……的存在情况"包括测定其存在量，以及确定其是否存在。本文所使用的术语"生物标志物"在本发明背景下是指多肽(其拥有特定的表观分子量)，其在取自PD患者的样品与取自对照受试者或对照群体的可比较样品之间存在差异。本文使用的术语"对照群体"，是指PD为阴性诊断或者检测不到PD的个体，即正常或健康受试者。本文使用的术语"水平差异"，是指取自PD患者的样品中存在的生物标志物的量与对照相比的差异。在一个实施方案中，生物标志物可以是多肽，其在PD患者的样品中的存在量与对照水平相比出现升高或者降低。在另一个实施方案中，生物标志物可在生物标志物的量或者变体形式(即同工型、多聚变体和/或翻译后修饰变体)方面差异性表达。本文使用的术语测试化合物的"有效性"是指足够实现理想的治疗和/或预防效果的量，并且包括如预防或减轻受治疾病(即PD)的症状的量。对受试者施用的化合物量将取决于疾病的严重程度和类型以及个体的特征，这包括但并不限于如一般健康情况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。这还将取决于疾病的程度、严重性和阶段。本领域技术人员能够根据这些因素以及其它因素来确定合适的剂量。本文使用的术语"免疫测定"，是指使用高灵敏度和特异性的免疫反应来检测或定量生物样品中的特定物质(如生物标志物)的化学测试，所述生物样品包括但不限于如血或体液样品。其高灵敏度是由于使用抗体和纯化抗原作为试剂。本文中用于免疫测定的抗体是由B淋巴细胞(免疫细胞)应答于抗原刺激而产生的蛋白质(免疫球蛋白)。免疫测定法测量抗体-抗原复合体的形成，并通过指示反应对其进行检测。通过使用放大信号的指示剂系统(如酶标记)来实现高灵敏度。本文使用的术语"单体"是指以能够聚合成多聚体的单个组分形式存在的肽、多肽或蛋白质。以单个组分形式存在的单体含有该肽、多肽或蛋白质整体的所有基本特性，除非那些特性仅在装配后出现。本文使用的术语"多聚体"(包括术语"二聚体")是指以多于单个组分的形式存在的肽、多肽或蛋白质。二聚体是指通过共价键、离子键、氢键或范德华力串联在一起发挥功能的两个单体。本文使用的术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"可互换使用，指氨基酸残基的多聚体。该术语可适用于这样的氨基酸多聚体，即其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学类似物，该术语也同样适用于天然存在的氨基酸多聚体。本文使用的术语"幹水"可以是任何至少两个个体的组。幹沐可以包10括但不仅限于对照幹本、患者群体、参考群体、群体组、家族群体、临床群体和同性别群体等本文使用的术语"翻译后修饰的多肽、肽和蛋白质"也包含修饰，例如但不限于糖基化、脂附着、硫酸化、羧基化、羟基化、ADP核糖基化和添加其它复合多糖。本文使用的术语"参考水平"是指用于比较目的的生物标志物的量或浓度。在一个实施方案中，参考水平可以是健康受试者对照群样品中至少一种生物标志物的平均水平。在另一个实施方案中，参考水平可以是早些时候(即在此次测定之前)同一受试者中至少一种生物标志物的水平。在另一个实施方案中，参考水平可以是接受治疗方案之前该受试者中至少一个生物标志物的水平。本文使用的术语"样品"可以包括但不限于身体的组织或体液，包括但不限于如血(或血的级分，如血浆或血清)、淋巴液、粘液、泪液、唾液、胆嚢液、尿液、精液、粪便、CSF、腹水或全血，并包括来自身体组织的活枱，样品。样品可以来自任何受试者，如患有PD或有患PD风险的受试者/患者以及对照受试者。本文使用的术语"筛选"是指确定测试化合物是否具有预防或延緩(减轻)本文所述的目的病理状态(即PD)的能力或特征。诊断方法的灵敏度可以有所不同。诊断测定的灵敏度是指对检测化合物产生良好反应的患病个体的百分比。本文使用的术语"受试者"是指哺乳动物，包括但不限定于如人类、也可以是动物，如家养动物(如狗、猫等)、家畜(如牛、羊、猪、马等)以及实验动物(如猴、大鼠、小鼠、兔、豚鼠等等)。术语"患者"是指患有PD或怀疑患有PD的"受试者"。本文使用的术语"治疗"是指治疗性处理以及预防或防护措施，其目的是预防或延緩(减轻)目的病理状态或疾病。如果根据本发明方法接受治疗量的测试化合物后，受试者表现出一个或多个PD体征或症状的可观察和/或可检测的减弱或消失，或出现Hoehn-Yahr和/或UPDRS分级的改善，或出现一个或多个生活质量指标的改善，则可以认为患者ii的PD疾患成功地得到了治疗。本文使用的术语"变体"是指互换形式(如单体、二聚体或多聚体)或任何翻译后修饰形式的多肽、肽和/或蛋白质或其片段。"变体"包括但不限于多肽、肽和/或蛋白质或其片段在二级、三级或四级结构上的差异。I.诊断和/或监测PD的方法A.测量PD的生物标志物在一方面中，本文提供从样品(包括但不限于如血、尿液、脑脊液和脑组织)中分离PD生物标志物。CSF可用于检测脑化学方面的改变，所述改变可以影响蛋白质的表达、功能或稳定性，由此使CSF直接接触脑的胞外空间。腰推穿刺是可以获得CSF样品的几种现有方法之一。但是，腰推穿刺是一种侵入性方法，这使得获得受试者的脑脊液样品变得困难。不希望限于理论，每天有约500亳升的CSF被吸收入血，这提示血液测定可用作CSF测定的代用方法。因此，通过静脉穿刺或其它熟知的常规方法获得的血液样品可以提供脑脊液的来源，用于PD表型相应生物标志物的测定。在一个实施方案中，可在人組织样品中对本文所述的生物标志物进行筛选。这些标本可以包括组织样品、完整细胞、细胞裂解物或分离的蛋白，其中包括但不限于如针刺活检的芯(core)、外科切除的标本、淋巴结组织或血清。在一个实施方案中，本文所述样品的制备、分离和/或提取可通过熟知的常规方法来进行。在一个实施方案中，可以应用于或组合应用于分离和/或纯化生物标志物的技术包括化学提取(如酚或氯仿提取)、透析、沉淀(如硫酸铵沉淀)、电泳和色谱技术。化学分离技术一般不提供对单个蛋白质的特异性分离，但是可用于去除样品中大量的非蛋白质材料或污染材料。电泳分离包括将提取的样品置于凝胶的孔中，所述凝胶可以是变性或非变性的聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。对凝胶施加直流电或脉冲电，样品中的多种成分会根据其分子量大小、构型、电荷和/或其物理特性的组合而进行分离。可在胶上区分之后，包含被分离蛋12白质的部分可以从胶上取下。从聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶上纯化蛋白质的方法为本领域所熟知，并且已经商品化。在一个方面中，本文提供了用于检测多肽生物标志物的免疫测定。多肽生物标志物可以通过已标记的抗体或其后进行标记的抗体进行检测。可使用多种形式来确定样品中是否包含结合给定抗体的蛋白质。可用于检测生物标志物的免疫测定方法包括但不限于，如斑点印迹、western印迹、蛋白质芯片、免疫沉淀(IP)、竟争性及非竟争性蛋白质结合测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)以及其它普遍使用并在科学文献及专利文献中广泛描述的方法，其中很多已经商品化。本领域技术人员能够很容易地使已知蛋白质/抗体检测法适用于测定样品中是否含有生物标志物，以及测定样品中该特定多肽表达产物的相对浓度或变体形式。来自受试者的蛋白质可以利用本领域技术人员熟知的技术进行分离。分离蛋白质的方法包括但不限于如在《Antibodies:ALaboratoryManual》中所描述的方法(Harlow&Lane，Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，1988).抗体可在多种方法中用于检测表达的生物标志物，包括但不限于如western印迹或ELISA。在这些用途中，可以将抗体或蛋白固定在固体支持物上。支持物或栽体包括任何可结合抗原或抗体的支持物。熟知的支持物或栽体包括但不限于如玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然及改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。在一个实施方案中，western印迹测定可以用来检测生物标志物。本文所使用的"western印迹"旨在涵盖基本蛋白质测定的所有变化类型。western印迹技术在本领域中已经非常成熟，一般包括通过在变性或非变性条件下通过PAGE将蛋白质按照分子量进行分离，其后进行检测。免疫荧光和酶免疫测定(EIA)在本领域中均已非常成熟。然而，也可以使用其它的报告分子，包括但不限于如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。对于本领域技术人员来说，如何调整实验方法来适应所需用途是显而易见的。在另一个实施方案中，IP测定可以用来检测生物标志物。本文所使用的"免疫沉淀"或"IP"旨在涵盖基本蛋白质检测测定的所有变化类型。IP技术在本领域中已经很成熟，一般包括利用特异性或非特异性抗体将蛋白质从样品中沉淀下来。而后，沉淀下来的蛋白可以利用SDS-PAGE进行分离，再进行检测。然而，也可以使用其它报告分子，包括但不限于如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。对于本领域技术人员来说，如何调整实验方法来适应所需用途是显而易见的。在另一个实施方案中，存在多种不同变化形式的ELISA和/或夹心ELISA可以用于本发明的方法和测定当中。本文所使用的"ELISA"旨在涵盖基本免疫吸附测定的所有变化类型。本文所使用的"夹心测定"旨在涵盖基本两位点免疫吸附结合技术的所有变化类型。免疫荧光和EIA技术在本领域中均已十分完善。然而，也可以使用其它报告分子，包括但不限于如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。对于本领域技术人员来说，如何调整实验方法来适应所需用途是显而易见的。在另一方面，本文提供了用于检测多肽及其单体和多聚体形式的双向凝胶电泳技术。双向凝胶电泳为本领域所熟知，通常包括在第一个维度上等电聚焦以及随后在第二个维度上进行SDS-PAGE电泳。对于本领域技术人员来说，如何调整实验方法来适应所需用途是显而易见的。参阅如Hames等,GelElectrophoresisofProteins:APracticalApproach(IRLPress,NY,1990);Shevchenko等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,第93巻，14440-14445页，(1996);Sagliocco等，Yeast，第12巻，1519-1533页，(1996);以及Lander,Science,第274巻，536-539页(1996)。在另一方面，本文提供了利用质语(MS)来对多肽进行鉴定。可以通过质镨技术来确定靶多肽的身份和表达水平。基于MS的分析法可用于分析分离的靶多肽以及样品中的靶多肽。用于分析靶多肽的质镨形式包括离子化(ionization,I)技术，其包括但不限于如基质辅助激光解吸(MALDI)、持续或脉冲电喷雾离子化(ESI)及相关方法，包括但不限于如离子喷雾或热喷雾、大块团簇碰撞(massiveclusterimpact,MCI)。这些离子源可以与检测形式相匹配，包括线性或非线性反射飞行时间(TOF)、单个或多个四极杆、单个或多个扇形磁场、傅里叶变换离子回旋共振(Fouriertransformioncyclotronresonance,FTICR)、离子阱以及其组合，包括但不限于如离子阱/TOF。就离子化而言，可以使用许多基质/波长组合(如MALDI)或者溶剂组合(如ESI)。本领域技术人员容易理解，将这些技术与液相色镨技术(LC)組合可增强MS法的灵敏度。对于本领域技术人员来说，如何调整实验方法来适应所需用途是显而易见的。就MS分析而言，可以将靶多肽溶解在合适的溶剂或试剂体系中。溶剂或试剂体系的选择(例如有机或无机溶剂)将取决于靶多肽的特性和所用MS的类型，并基于本领域熟知的技术来进行。MALDI可参阅如Vorm等，Anal.Chem.第61巻，3281页，(1994);ESI可参阅如Valaskovic等，Anal.Chem.第67巻3802页(1995)。选择这样的溶剂它能使靶多肽因为汽化过程而引入的能量而被降解的风险尽可能小。可通过例如将样品包埋进基质来实现靶多肽降解风险的降低。合适的基质可以是有机化合物，其包括但不限于糖，如戊糖或己糖，或包括但不限于多糖，如纤维素。这样的化合物通过热分解作用降解成二氧化碳和水，从而不会形成会产生化学反应的残留物。基质也可以是无机化合物，包括但不限于如硝酸铵，它可以被彻底分解而不留下任何残留物。特别地，苯丙醇家族的化合物成员(包括但不限于如a-氰基-4-羟基肉桂酸)也可以用来作为本文描述的基质。这些溶剂以及其它溶剂的使用是本领域技术人员已知的。电喷雾MS描述于Fenn等，J.Phys.Chem.第88巻4451-4459页，(1984))，一些综述文献总结了其目前的应用。参阅Smith等，Anal.Chem.第62巻882-89页(19卯)，以及Ardrey等，Spectroscopy第4巻10-18页，(1992)。通过MS测定的靶多肽质量可以与相应已知多肽的质量进行比较。例如，当靶多肽是变体蛋白时，其相应的已知多肽可以是相应的非变体蛋白，比如野生型蛋白或对照蛋白。利用ESI可以精确测定飞摩尔(femtomole)级别样品量的分子量，这是由于存在多个离子峰，它们均可以用来进行分子量的计算。阿摩尔(attomole)水平以下的蛋白质已经通过如ESIMS(Valaskovic等.，Science第273巻1199-1202页，(1996))以及MALDIMS(Li等，J.Am.Chem.Soc.第118巻1662-1663页，(1996))技术被检测出来。样品中靶蛋白的水平可以通过质谱方法来进行测量，包括但不限于本领域熟知的技术，如基质辅助激光解吸/离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和表面增强激光解吸/离子化-飞行时间质镨(SELDI-TOF-MS)。进行MALDI的方法为本领域技术人员所熟知。参阅如Juhasz等，Analysis,Anal.Chem.第68巻941-946页(1996)。许多用于提高溶解度的技术也是已知的。MALDI-TOF-MS描述于Hillenkamp等，BiologicalMassSpectrometry,Burlingame和McCloskey编辑.(ElsevierSciencePubl"Amsterdam,1990)49-60页。样品中靶蛋白也可以通过串联MS法进行检测，它包括但不限于本领域已知的技术，如液相色镨电喷雾离子化串联质镨(LC-ESI-MS/MS)。参阅如Cagney和Emili,Nat.Biotech.第20巻163-170页(2002)，以及Gu等.，J.Am.Soc.MassSpectrom.第14巻l画7页，(2003)。使用和改进LC-ESI-MS/MS的方法为本领域技术人员所熟知。B.比较PD生物标志物的水平在另一个方面，本文提供将受试者样品中生物标志物水平与参考水平进行比较。生物标志物是受试者中可用于测量疾病发展、恢复或治疗效果的生物化学特征或表现。当与参考水平进行比较时，本文所述生物标志物的表达水平可以与受试者的疾病状态相关联。因此，生物标志物可以用来指示受试者的疾病或健康状态。在另一个实施方案中，生物标志物水平与参考水平的相似性可指示受试者中无此疾病状态。在另一个实施方案中，生物标志物与参考水平相比的差异可指示受试者中存在该疾病，或指示该疾病的阶段。在另一个实施方案中，可在不同时间点将生物标志物与参考水平进行比较，以监测疾病的进展或消退。在另一个方面，本文提供了比较选自以下的生物标志物触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体和/或运甲状腺素蛋白。触珠蛋白是45KDa的血浆蛋白质，其结合红细胞释放的游离血红蛋白。见NCBI非冗余蛋白质数据库登录号4826762。在一个实施方案中，PD患者的触珠蛋白水平与对照相比是升高的。在另一个实施方案中，运铁蛋白是与帕金森病的病理相关的铁转运蛋白，其理论分子量为77KDa。见NCBI非冗余蛋白质数据库登录号4557871。尸检PD患者黑质中的铁水平高于对照水平。参阅如Sofic等，J.Neurochem.第56巻978-982页(1991)。因此，运铁蛋白的水平在16PD患者中比参考水平要更高。栽脂蛋白A-I前体是高密度脂蛋白(HDL)的主要栽脂蛋白的前体蛋白，其在血浆中的丰度相对较高(1.0-1.5mg/ml)。参阅如Brewer等，Biochem.Biophys.Res.Commun.第80巻623-630页(1978)。载脂蛋白A-I前体的理论分子量为31KDa。见NCBI非冗余蛋白质数据库登录号4557321。在一个实施方案中，栽脂蛋白A-I前体在帕金森病患者中比参考水平要低。al-抗胰蛋白酶前体是al抗胰蛋白酶的前体蛋白，后者是血液中含量最为丰富的蛋白酶抑制剂，并且是SERPIN家族蛋白酶抑制剂的成员。参阅如Forsyth等，Genomics.第81巻，第3期336-345页(2003)。al-抗胰蛋白酶前体的理论分子量为47KDa。见NCBI非冗余蛋白质数据库登录号1703025。在一个实施方案中，al-抗胰蛋白酶前体在PD患者中比参考水平要低。TTR是在肝脏和大脑的脉络丛中合成的。参阅如Schreiber等，Comp.Biochem.Phys.第105巻，第2期317-325页(1993)。它参与甲状腺素和血浆视黄醇结合蛋白的血清转运。参阅如Zheng等，Toxicol.Sciences.第61巻107-114页(2001)。在CSF中，TTR是主要的曱状腺素结合蛋白。参阅如Hagen等，J.Clin.Endocrinol.Metab.第37巻415-422页(1973)。TTR是分子量55KDa的同源四聚体蛋白，其中每一个单体都包含通过氢键形成二聚体的两个p折叠片。见文献Soprano等，J.Biol.Chem.第260巻11793-11798页(1985)。TTR二聚体在许多生物学样品中占优势，并且在变性条件下不被破坏。参阅如Sanchez等，Electrophoresis第16巻1131-1151页(1995)。如前所述，TTR可以在测试样品中以单体、二聚体存在或二者皆有。单体TTR的预计分子量约为14KDa，而二聚体形式的TTR预计分子量约为28-36KDa。在一个实施方案中，与参考水平相比，PD患者的样品中可存在二聚体TTR量的下降或单体TTR量的提高，或者两种情况同时出现。在另一个实施方案中，与参考水平相比，血清TTR二聚体/单体比在PD患者中也可能更低。因此，对TTR二聚体/单体比可以作为PD诊断和发病的早期生物标志物。本文所示的蛋白质之间的质量差异可以通过多种生物化学技术进17行检测，包括但不限于如快速高效反向液相色镨(HPLC)法、质镨法、疏水色谱、DEAE纤维素、Bio-GelP-60和DEAE-SephadexTM柱上的连续色谱和/或凝胶电泳(包括但不限于如SDS-PAGE或双向凝胶电泳)，其后根据需要利用商品化抗体进行检测。用于通过本文所述任何免疫测定检测运甲状腺素蛋白的抗体是可购得的(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)。见目录号sc-13098(命名为前白蛋白(FL-147),抗兔IgG)。本文所述的技术还将比较受试者样品与参考水平从而测量任何一种单独生物标志物或任何可能组合的可能性考虑在内。II.选择治疗方案以及用于筛选有用化合物的方法本文所述的方法可以用于PD的预后、诊断、分级、治疗以及选择和/或筛选测试化合物。在一些实施方案中，这些方法可以用于检测PD的进展，选择有效的特定治疗，和/或筛选对PD的治疗和预防可能有治疗或预防效果的化合物。因此，本文所描述的方法可以用于确定在采用特定治疗方案和/或化合物后PD是否存在。所述方法还可用于监测PD治疗以及生物标志物或PD症状的再现，或用于事先确定多种治疗和/或化合物是否有效。为此，本发明的一些实施方案提供了用于确定受试者是否有PD发病风险、选择临床实验的受试者、检测临床效果和划分受试者的预后或预测测定。在一个实施方案中，测定可以用于预后或预测目的，从而确定受试者是否具有发生帕金森病的风险，以及随后任选地在受试者发病之前对其实施预防性治疗。此外，本文所述的预后测定可以用于确定受试者是否可作为临床试验的可能候选者，其中可以确定所施用的帕金森病治疗是否有效。例如，这些方法可用于确定受试者是否可以用影响触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体和al-抗胰蛋白酶前体蛋白和/或TTR和/或其任何变体的化合物来有效治疗受试者。因此，本发明提供了用于确定受试者是否可以用针对PD的化合物有效治疗的方法，其中获得测试样品并将本文所述的生物标志物与参考水平相比较(例如，其中受试者生物标志物表达水平的升高或降低是施用所述化合物预防和/或治疗帕金森病的诊断依据)。因此，受试者可以在临床试验前根据本文所述的诊断测定结果进行分类。对此，本发明的一个实施方案提供的化合物可用于有效治疗帕金森病的筛选，其中受试者分类可以在得到治疗/临床试验结果后重新评估。为了推导对治疗的临床响应与特定生物标志物水平之间的相关性，需要获取接受治疗的受试者幹本(即临^W)的临床响应数据。可以通过对临床试验结果的回顾性分析得到这些临床数据。在一个实施方案中，可以通过i殳计并实施一个或多个新的临床试验得到所述临床数据。临^N^数据分析可用于定义标准参考幹体，接着可用于以参与临床试#选择治疗方案为目的将受试者分类.在一个实施方案中，对临^体中的受试者针对帕金森病的存在进行分级。对潜在受试者的分级包括但不仅限于例如Hoehn&Yahr分级法或UDPRS得分分析并随后确定临>^体生物标志物表达水平相对于对照群体升高或降低。在一个实施方案中，根据受试者一个或多个生物标志物的测量水平和标准参考群体中所观察的一种或多种生物标志物水平的相似性，可以将其划分或分配为特定的组或类。在另一个实施方案中，将目的治疗方案施加于实验群体中每个受试者，通过一个或多个预先确定的标准测量每个受试者对治疗的反应(即治疗的效力)。在许多情况下，预期试验群体会表现出一系列的响应，研究人员将选择由多种响应组成的响应者分组的数目(例如高、中、低)。另外，对生物标志物(如降低或提高的TTR单体或二聚体)的表达水平进行定量，这可以在治疗前和/或后实施。接下来对这些结果进行分析以确定是否组之间观察到的任何临床响应(即疗效)改变是统计学显著的。可用的统计分析方法在LD.Fisher&GvanBelle,必/os加/幼'wjMe幼i^/ogy/w*幼e份"/幼(Wiley國lnterscience，NY,1993)中有描述。本领域技术人员可以建立数学模型以预测作为上述分析中生物标志物表达水平函数的临床响应或帕金森病分级。临床响应和生物标志物表达水平之间相关性的鉴定可以作为设计诊断方法的基础，所述诊断方法用以确定受试者是否对治疗有响应，或者以较低水平响应由此可能需要更多的治疗，即更大剂量的化合物、药物或治疗。诊断方法可以采取多种形式之一，例如ELISA或基于抗体的测试、血清学测试、western印迹测试、IP测试或双向凝胶电泳其后进行质谱分析。惟一的要求是在诊断测试的结果与其背后的PD之间存在相关性。在一个实施方案中，该诊断法利用western印迹来确定受试者中是否存在如上所述的血清TTR单体的升高或血清TTR二聚体的降低。在另一个实施方案中，该诊断法利用western印迹来确定受试者与参考水平相比是否存在上述触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体和/或ocl-抗胰蛋白酶前体蛋白和/或其任何翻译后修饰变体的水平差异。在一个实施方案中，本文所述测定可用于确定是否可对受试者施用化合物或其他治疗方案来治疗或预防PD,所述化合物包括但不限于如激动剂、拮抗剂、拟肽、多肽、肽、核酸、小分子或其它候选药物。在另一个实施方案中，目标治疗性或预防性治疗可以选自下列蛋白、多肽、肽、核酸、病毒、病毒样颗粒氨基酸、氨基酸类似物、修饰氨基酸、经修饰M酸类似物、类固醇、蛋白多糖、脂类和碳水化合物，或其组合(例如包身、蛋白和DNA组分的疗法，或疗法组合，其中一个或多个成分将其它成分转化为活性形式，例如催化)。在另一个实施方案中，治疗性或预防性治疗还可包括核酸，其包括但不限于例如，寡核苷酸或《务饰寡核苷酸、反义寡核普酸或修饰的反义寡核苷酸、适配体、cDNA、基因组DNA、人工或天然染色体(例如，酵母人工染色体)或其一部分、RNA(包括siRNA、shRNA、mRNA、tRNA、rRNA或核酶)；肽核酸(peptidenuleicacid，PNA);病毒或病毒样颗粒；核苷酸或核糖核普酸或其合成类似物，它们可以是^务饰或未修饰的。所述治疗还可以^Jl^酸或其类似物，其可以是修饰或未修饰的激素或非肽类(如胆固醇)激素；蛋白聚糖；脂类或碳水化合物。在一个实施方案中，还可以使用小分子，其包括无机和有机物质。在另一个实施方案中，所述小分子是药物活性剂。可用的药物活性剂种类包括但不仅限于抗生素、抗炎药物、血管生成或血管活性剂、生长因子和化疗剂。在另一个实施方案中，感兴趣的治疗性或预防性治疗可选自PD药物左旋多巴、COMT抑制剂、恩他卡朋、托卡朋、多巴胺激动剂、溴隐亭、普拉克索、罗匹尼罗、阿朴吗啡、金刚烷胺、抗胆碱能药物、甲磺酸千托品、丙环啶、比派立登、和/或司立吉林。在另一个实施方案中，感兴趣的治疗性或预防性疗法实际上可以是手术，其程序可以选自苍白球切开术、丘脑切开术、丘脑刺激、神经组织移植和/或深度脑刺激(deepbrainstimulation,DBS)。在一个实施方案中，一个或多个生物标志物的表达水平与PD的分级具有相关性。可以通过基于分为五个不同阶段的Hoehn和Yahr分级法对患者分类来进行性地监测PD的发展。每一阶段都描述了PD的症状和临床表现。这些阶段由如下五级组成(I)仅在一侧躯体出现症状；(II)在躯体两侧均出现症状，其中无平衡障碍；(III)与轻到中度疾病相关的平衡障碍，其中患者仍能独立生活；(IV)患者出现严重残疾，但是患者仍然能够独立走路或站立；(V)除非得到帮助，患者只能坐轮椅或臣卜床。参阅Hoehn和Yahr等，Parkinsonism:onset,progressionandmortality.Neurology.第17巻:427-442页(1967)。在另一个实施方案中，可才艮据统一帕金森病评分量表(UnifiedParkinson'sDiseaseRatingScale,UPDRS)对PD进行进行性监测，这通过基于分为四个独立阶段的临床表现对患者分类来实现。每个阶段用评价PD临床表现的5分标准。阶段由与以下相关的症状组成(I)精神、行为和情绪，其中对智力损害、思维障碍、进取心/能动性和抑郁进行评价；(II)日常活动，其中对言语、流涎、吞咽、书写、切割食物、穿衣、清洁、床上翻身、摔倒、僵直、行走、震颤和感觉不适进行评价；(III)行动检查，其中对言语、面部表情、静止性震颠、动作震颤、僵硬、手指捏合、手运动、手旋前旋后运动、腿灵活性、从椅子上起立、姿势、步态、姿势的稳定性和身体动作緩慢进行评价；(IV)治疗的并发症，其中对以下进行评价运动障碍的持续时间、运动障碍的失能、运动障碍疼痛、晨张力失常；可预测的"关"状态(off)、不可预测的"关"状态(off)、突然的"关"状态(off)、"关"状态(off)的持续时间；以及厌食症、恶心、呕吐、睡眠紊乱和症状性位置性障碍(Symptomaticorthostasis)。参阅如Rascol等，TreatmentinterventionsforParkinson'sdisease:anevidencebasedassessment.Lancet.第359巻1589-1598页(2002)。因此，本文所公开生物标志物的表达水平能够与Hoehn和Yahr和/或UPDRS分级方法存在相关性，用于PD的预后、诊断、治疗方法的选择、监测和/或筛选对治疗化合物。在一个实施方案中，在第一个时间点测定来自受试者的测试样品中生物标志物(如单体或二聚体TTR)的表达水平，并将其与来源于受试者的测试样品在其后的时间点时生物标志物的水平相比较。来源于受试者的测试样品在第一个时间点处生物标志物表达水平的提高或降低可以与来源于受试者的测试样品在第二个时间点处的生物标志物的水平相比较，其21中生物标志物在第一个时间点和第二个时间点处表达水平的差异指示出需要帕金森病治疗的受试者。或者，生物标志物在第一个时间点和第二个时间点处表达水平的差异指示出对帕金森病治疗有反应的受试者。受试者中生物标志物的水平可以进一步与Hoehn&Yahr和/或UPDRS分^bt目关联。可能需要进一步的测试以做出阳性诊断。在另一个实施方案中，本发明还包括监测帕金森病患者选艮的方法，其是出于选择治疗方案和/或筛选有用化合物的目的，其中测定来源于受试者的测试样品中生物标志物在第一个时间点的表达水平(例如单体或二聚体TTR的升高或降低)，并将其与来源于受试者的测试样品中生物标志物在后一个时间点处的水平相比较。来源于受试者的测试样品中生物标志物在第一个时间点处表达水平的提高或降低可以与来源于受试者的测试样品中生物标志物在第二个时间点处的水平相比较，其中生物标志物在第一个时间点和第二个时间点处的表达水平的提高(例如单体TTR的降低和/或二聚体TTR的提高)指示出有效的帕金森病治疗或化合物。本领域技术人员容易理解，使用本文所述的所有生物标志物(即触珠蛋白、运铁蛋白、裁脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体蛋白、TTR或其变体，或者其任何翻译后修饰的变体)均可应用用于选择治疗方案和/或筛选有用化合物的方法。有多种方法可被用于上述帕金森病的诊断性或预后性评价，包括TTR和本文所述的所有生物标志物，以及受试者对这些疾病是否具有易患体质的鉴别/治疗。在一个实施方案中，触珠蛋白、运铁蛋白、栽脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体蛋白、TTR或其变体、或其任何翻译后修饰的变体的标准对照水平可以通过在不同对照组中进行检测而确定。接着将参考水平与本文所述的给定受试者的生物标志物的测量水平相比较。根据测量水平与给定组对照水平相比的相似度，可以将受试者划分或分配为特定的组。本领域技术人员会理解，做出这种测定具有某种程度上的不确定性。因此，对照组表达水平的标准偏差可以用于做出概率性判定，本文的方法在宽范围的基于概率的基因型或表型组判定中都适用。因此，例如，但不仅限于，在一个实施方案中，如果生物标志物的测量水平落入任意对照组平均值的2.5倍标准差以内，则受试者可以被分配到该组中。在另一个实施方案中，如果生物标志物的测量水平落入任意对照组平均值的2.0倍标准差以内，则受试者可以被分配到该组中。在另一个实施方案中，如果生物标志物的测量水平落入任意对照组平均值的1.5倍标准差以内，则受试者可以被分配到该组中。在另一个实施方案中，如果生物标志物的测量水平落入任意对照组平均值的l.O倍标准差以内，则受试者可以被分配到该组中。因此，该过程允许在多种概率度下做出判定，将特定受试者分配至应该处于的组内，并且这种分配接着会将风险分类确定至个体应该处于的位置。用于诊断PD的试剂盒在另一方面，本文提供用于对受试者的PD进行诊断、预后或监测的试剂盒。这样的检测试剂盒还可用于对受试者进行分类，以在临床试验中进行选择。特别地，本发明包括用于检测样品是否存在本发明生物标志物的相应多肽的试剂盒。例如，该检测试剂盒可以包含已标记的化合物或试剂，以及用于测定样品中多肽的量的手段，所述化合物或试剂能够检测样品中本发明生物标志物的相应多肽。在一个实施方案中，本发明的方法可以利用预包装的诊断试剂盒来进行，该试剂盒中包含实施任何本发明方法的必要试剂。例如，该试剂盒可以包括至少一种针对本文所述生物标志物的特异性抗体，所述特异性抗体可方便地用于如临床情况下，用以筛查和诊断患者，以及筛查和鉴定显示对PD有易感性的受试者。该试剂盒还可包含可用于本发明方法中的酶和緩冲液，以及电泳标志物，其包括但不限于如分子量标志物。该试剂盒可以包含关于试剂使用和结果解释的说明书。在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含有包装于一个或多个小管中的至少一种生物标志物作为对照。该试剂盒还可含有其它组分，包括但不限于如包装在独立容器中的杂交緩冲液(生物标志物的抗体在其中作为探针)。就基于抗体的试剂盒而言，试剂盒可以包括如(l)第一抗体，如固着于固相支持物上的第一抗体，其与本发明标志物的相应多肽结合；(2)不同的第二抗体，它可与所述多肽或所述第一抗体结合，并且缀合有可检测标记。该试剂盒还可包含如緩沖剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。该试剂盒还可以包含检测所述可检测标记所需的组分，如酶或底物。该试剂盒还可包含对照样品或一系列对照样品，可以对其进行测定并与测试样品进行比较。试剂盒中的每一组分可装于独立的容器内，所有的容器可以与说明书一起包含在单个包装内，所述说明书用于解释使用该试剂盒进行实验的结果。实施例下面的实施例对本发明进行了进一步的说明，这些实施例不应被解释为任何形式的限制。材料和方法-/,々#^举琳。本文所述实施例的目的是为了描述鉴定本发明的相关生物标志物的蛋白质组图镨。血清样品来自12名完全特发性PD患者，以鉴定促进PD或可作为PD诊断标志物的蛋白质组改变。所有PD患者都属于Hoehn和YahrI级或II级，平均年龄为58.3±7.9岁，年龄范围为43-68岁(表1)。在收集样品之前，PD患者未接受任何先期PD治疗。对照样品来自12名性别和年龄匹配的健康个体，其平均年龄为58.5±8.2岁，年龄范围为44-68岁。对照群体和PD患者均接受了综合医学评价，其包括病史回顾、神经学状态报告和实验室测试。实验室结果表明，血清总蛋白、血液尿素氮、肌酸酐、脂质以及血糖浓度都在正常限度之内。全部血清样品均在中国北京首都医科大学宣武医院神经科收集。表1.PD患者的临床特征编号性别年龄(yr)Hoehn&Yahr分级发病年龄(岁)1男65I642男62I603女52II494女59II575男65I616女55II537男68I658女57I549女49I4724<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>浙^^^清#^。通过静脉穿刺获得PD患者和对照群体的血样。在室温孵育60分钟后，样品于41C以3,000xg离心10分钟。随后收集上清液并保存在-80lC。上清液与氯仿按l:l的比例(体积/体积)，以提取和除去脂类污染物。将不含脂类的级分应用于rProteinASepharose(GEHealthcare,Piscataway，NJ)柱，收集并再处理两次。将除去免疫球蛋白(Ig)的流出液(flowthough)应用于Cibach醒blue(Sigma，St.Louis,MO)柱，收集并再处理两次以除去白蛋白。蛋白质随后在-20"C下以1:4的比例(体积/体积)的样品和丙酮沉淀12小时，将得到的沉淀在室温下风干。将包含l亳克蛋白质样品用450微升以下緩冲液重悬7M尿素、2M硫脲、20mMTris-HCl(pH7.5)、0.5%CHAPS、0.5%(体积/体积)IPG溶液(pH3-10)、6%2,2，-二硫苏糖醇以及痕量溴酴蓝。利用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce，Rockford，IL)对血清蛋白质浓度进行测定。鍵^"夢^^浙。利用Mann-Whitney检验对双向凝胶电泳所得蛋白质点的值进行分析。同样的，使用带有标准差的Mann-Whitney检验比较western印迹的相对条带强度。所有统计学测定均用版本13.0的SPSS软件(SPSS，Inc.,Chicago,IL)进行分析。对于所有的检验结果，如果p值小于0.05，则认为是显著的。实施例1-利用双向凝胶电泳分离蛋白质并鉴定蛋白质变体/同工型利用双向凝胶电泳分析血清蛋白质样品。第一个方向上的分离通过将1毫克蛋白质样品加入24厘米IPG胶条中来进行，其中使用3-7的非线性pH梯度。利用IPGphor设备(GEHealthcare,Piscataway，NJ)，在20X:下，在如下条件下通过加压至130,000Vh来分离蛋白质样品40V10小时；100V20小时；200V2小时；500V2小时；1，000V2小时；258,000V梯度2小时；8,000伏12.5小时。随后将IPG胶条在平衡緩冲液(50mMTris-HCl、6M尿素、30%(体积/体积)甘油、2%(重量/体积)SDS、痕量溴酚蓝、1%(重量/体积)二硫苏糖醇)中孵育15分钟。将IPG胶条在含有2.5%(重量/体积)碘乙酰胺(IAA)的平衡緩冲液再孵育15分钟。等电聚焦之后，再使用12%SDS-PAGE以5W/胶(EttanDALTIIsystem,GEHealthcare,Piscataway，NJ)进一步4吏样品分离。随后利用考马斯亮蓝G-250(CBBG250)将凝胶染色12小时，用ImageScannerII技术(GEHealthcare,Piscataway，NJ)成1象。将蛋白质点的体积针对胶的总点体积进行标准化，其后使用ImageMaster2DElite软件(GEHealthcare,Piscataway,NJ)定量。如图1A所示，检测了约430个蛋白质点。图1A还显示，将PD患者的蛋白镨与对照进行比较时，有12个蛋白质点的丰度差异大于1.2倍。通过MALDI-TOF-MS和ESI-LC-MS/MS进一步表征这12个差异表达的蛋白质点。将蛋白质点从双向凝胶上切下，而后于37匸下在碳酸氢铵緩冲液(50mMol/L)中用胰蛋白酶(12.5ng/mL，Roche，Nutley，NJ)消化。按照生产商的说明书，使用ZipTipC18(Millipore,Billerica,MA)移液器尖头纯化肽。随后，将肽应用到以5%三氟乙酸和50%乙腈饱和的a-氰基-4-羟基肉桂酸基质上。利用VoyagerDEPROMALDI-TOF质镨仪(AppliedBiosystems,FosterCity，CA)得到肽镨。利用Mascot检索算法(MatrixScience,Boston,MA)将得到的数据在NCBI非冗余蛋白质数据库中进行检索。检索限定包括对于单同位素质量，质量检测的容许度为lOOppm;最大胰蛋白酶误切为一次；半胱氨酸由氨基甲酰胺进行甲基化修饰。为了进行串联质镨鉴定，将真空抽干的肽提取物重悬于20微升0.1%甲酸和2%乙腈中，应用到180nmxl0cmBioBasicC18柱(ThermoFinnigan,Waltham,MA)上，并用含0.1%甲酸的10-30%乙腈线性梯度洗脱30分钟。前体肽(precursorpeptide)的串联质谱使用+2、+3和+4的带电状态(覆盖400-1800的质荷比)来进行。利用LCQDECAXPPLUS(ThermoFinnigan，Waltham，MA)记录镨，并利用SEQUEST算法在NCBI非冗余蛋白质数据库中进行检索。对于一倍/二倍/三倍带电的肽，SEQUEST交叉相关值(Xcorr)阈值分别为1.9/2.2/3.75。此外，Delta相关值(ACn)的阈值为0.1。蛋白质通过MALDI-TOF-MS鉴定，并通过LC-ESI-MS/MS证实。结果证明，12个切下的蛋白质点中的10个是由由触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体或TTR组成的多肽片段。所鉴定蛋白质的NCBI登录号、序列表、理论等电点以及分子量列于表2<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如图l.A中所示，触珠蛋白以点l-5号点代表，其中l-4号点显示出丰度的显著提高。但是，5号点在PD患者中与对照相比出现了显著下降。此外，运铁蛋白(6和7号点)也在PD患者中显著升高。然而，载脂蛋白A-I前体(8号点)、al-抗胰蛋白酶前体(9号点)和TTR(10号点)在PD患者中均出现了显著下降。重要的是，如图l.B所示，TTR在PD患者中比对照下降了2倍，其相对丰度分别为0.011±0.004和0.023±0.007(p<0.05)。图2显示TTR的串联质谱，其中SEQUEST与b-和y-系列离子匹配。如图2所示，包含+2电荷状态的前体肽的质荷比测定为697.93。其相关前体肽的氨基酸序列鉴定为AADDTWEPFASGK(SEQIDNO:l)，对应于TTR的56-68位残基。因此，对本文所述多种蛋白质以及其相对丰度差异的鉴定可用于诊断PD的方法中。实施例2—Western印迹验证为了验证实施例1中获得的结果，将PD患者和对照的血清进一步进行Western印迹分析。12.5%SDS-PAGE分离血清蛋白质样品(50微克)，并转移到PVDF膜(Bio-Rad，Hercules,CA)上。对膜进行封闭，并与TTR多克隆抗体(1:5000，SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)在4X:下孵育过夜。将抗兔IgG-HRP第二抗体(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz,CA)以1:10,000的比例加入。以QuantityOne软件(Bio-Rad,Hercules,CA,version4.6.3)计算条带的相对强度。如图3A所示，在PD患者(1-3泳道)或对照(4-6泳道)的血清蛋白质(50毫克)中检测TTR的存在情况。作为阳性对照，将50ng纯化的人TTR加入单独的泳道中(+)。分子量标志物以相应的KDa质量标出。如图3B所示，检测到了两条分子量为36KDa和14KDa的条带，它们分别对应于二聚体和单体形式TTR的预计分子量。如图3B所示，检测到PD患者血清中经标准化的二聚体条带强度(3.2士1.5)显著低于对照组(4.5±1.7，p<0.05)。相应地，PD患者血清中的单体条带的强度(10.5±2.7)显著高于对照(8.9士2.2，p<0.05)。与实施例l中的结果一致，western印迹分析表明，PD患者血^中出现了降低的二聚体TTR水平，和/或提高的单体TTR水平(星号所示p值小于0.05)。因此，本文所述对TTR不同形式的检测可用于诊断PD的方法中。等同方案本发明不仅限于本申请中所述的具体实施方案。对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以进^s午多修改和改变，而不偏离其构思和范围。结合上文的描述，本发明范围内除本文所列举以外的功能等同的方法和装置对于本领域技术人员而言将是很明显的。这些修改和改变旨在与权利要求书所述等同方案的完整范围一起落入权利要求书的范围内。本发明仅受限于所附的权利要求书以及这些权利要求中所述等同方案的完整范围。应当理解，本发明不受限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物体系，它们当然是可以变化的。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体的实施方案，而不旨在限制。另外，当以马库什组的形式描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员会明白，本文也涵盖了该马库什组的任何个体成员或成员亚组而言的描述。就像本领域技术人员可以理解的那样，对于任何及全部目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还包括任何及全部可能的小范围及其小范围的组合。任何列出的范围可以很容易地认为是对同一范围分成相等的至少两部分、三部分、四部分、五部分、十部分等而进行了描述。作为非限制性的实例，本文讨论过的每个范围可以容易地分为前三分之一、中间三分之一和后三分之一等。本领域技术人员还会理解，词语包括但不限于"多至"、"至少"、"多于"、"少于"等包括所提到的数值，并指可以如上所述分成小范围的范围。最后，本领域技术人员会理解，范围包括每个个体成员。因此，例如，含有1-3个细胞的组是指含有1个、2个或3个细胞的组。类似的，含有1-5个细胞的组是指含有1个、2个、3个、4个或5个细胞的组，依此类推。尽管本文公开了多个方面和实施方案，但其他方面和实施方案对于本领域技术人员来说也是显而易见的。本文公开的多个方面和实施方案仅用于说明目的而非限制，真正的范围和构思由以下的权利要求进fr说明。权利要求1.至少一种生物标志物的一种或多种检测试剂用于制备帕金森病的诊断或监测试剂盒的用途，其中所述至少一种生物标志物选自触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体、α1-抗胰蛋白酶前体和运甲状腺素蛋白。2.权利要求l的用途，其中所述试剂盒用于测定来自受试者的样品中所述至少一种生物标志物的水平，并与参考水平进行比较，其中样品中所述至少一种生物标志物的水平与参考水平的差异指示该受试者患有帕金森病，或者指示帕金森病的阶段。3.权利要求2的用途，其中所述参考水平是未患帕金森病的受试者对照群体中所述至少一种生物标志物的水平。4.权利要求2的用途，其中所述参考水平是早些时候该受试者中所述至少一种生物标志物的水平。5.权利要求2的用途，其中所述参考水平是该受试者在接受治疗方案之前所述至少一种生物标志物的水平。6.权利要求2-5中任一项的用途，其中所述样品选自血浆、血清、全血和脑脊液。7.权利要求2-6中任一项的用途，其中所述测定包括测量样品中所述至少一种生物标志物的多肽的量。8.权利要求2-6中任一项的用途，其中所述测定包括测量样品中所述至少一种生物标志物的翻译后修饰多肽的量。9.权利要求2-6中任一项的用途，其中所述测定包括测量样品中单体或多聚体形式的所述至少一种生物标志物的量，或者对这两种形式均进行测量。10.权利要求l-9中任一项的用途，其中所述至少一种生物标志物为运曱状腺素蛋白。11.权利要求10的用途，其中所述测定至少一种生物标志物的水平包括测量样品中运甲状腺素蛋白单体或二聚体形式的相对量。12.权利要求ll的用途，其中单体形式运甲状腺素蛋白的水平与参考水平相比发生提高，指示该受试者患有帕金森病，或者指示帕金森病的阶段。13.权利要求ll的用途，其中二聚体形式运曱状腺素蛋白的水平与参考水平相比发生降低，指示该受试者患有帕金森病，或者指示帕金森病的阶段。14.权利要求2-13中任一项的用途，其中所述测定通过免疫测定进行。15.权利要求14的用途，其中所述免疫测定是ELISA或western印迹。16.权利要求1-13中任一项的用途，其中所述测定步骤通过双向电泳和质谱分析来实现。17.筛选可用于治疗帕金森病的化合物的方法，其包括(a)测定已施用测试化合物的受试者的样品中至少一种生物标志物的表达水平，其中所述至少一种生物标志物选自触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体和运曱状腺素蛋白；(b)将所述至少一种生物标志物的表达水平与参考表达水平进行比较；(c)确定该测试化合物的效力，其中所述至少一种生物标志物的表达水平与参考表达水平的差异指示该测试化合物可用于治疗帕金森病o18.权利要求17的方法，其中所述参考表达水平是该受试者在接受该测试化合物之前所述至少一种生物标志物的表达水平。19.用于诊断或监测受试者的帕金森病的试剂盒，其包括(a)用于测定该受试者的样品中至少一种生物标志物的水平的一种或多种检测试剂，其中所述至少一种生物标志物选自触珠蛋白、运铁蛋白、载脂蛋白A-I前体、al-抗胰蛋白酶前体和运曱状腺素蛋白；(b)来自未患帕金森病的受试者对照群体的至少一份对照样品；和(c)用于解释使用所述一种或多种检测试剂进行测定的结果的说明。全文摘要本发明涉及帕金森病的生物标志物。更具体地说，本文描述了用于检测帕金森病(PD)的发病以及鉴定其生物标志物的方法。本发明还提供用于诊断或监测PD的试剂盒。蛋白质的同工型及其单体或多聚体形式可用于对可能患有PD的受试者进行早期诊断。例如，血清中单体运甲状腺素蛋白(TTR)水平的提高或二聚体TTR水平的降低可用作诊断和监测PD的工具。文档编号G01N33/48GK101661032SQ200810214838公开日2010年3月3日申请日期2008年8月29日优先权日2008年8月29日发明者彪陈申请人:生物远景技术有限公司