构建阻塞性睡眠呼吸暂停综合征动物模型的方法【专利摘要】本发明公开了一种构建阻塞性睡眠呼吸暂停综合征动物模型的方法，将麻醉大鼠，通过插入岛叶皮层与微量注射装置直接相连的玻璃微电极，将药物向核团内注射到脑内岛叶皮层中。通过本发明的方法，刺激岛叶皮层可以产生类似于阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的呼吸困难症状，可以成功构建阻塞性睡眠呼吸暂停综合征动物模型。【专利说明】构建阻塞性睡眠呼吸暂停综合征动物模型的方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物和药物学【
技术领域：
】，具体而言，涉及一种构建阻塞性睡眠呼吸暂停综合征动物模型的方法。【
背景技术：
】[0002]阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(obstructivesleepapneasyndromeOSA)近年来越来越受到人们的关注，目前OSA已成为高血压、冠心病、心肌梗死及脑中风等发病的主要危险因素[1_6]，近几年对其机制的研究已引起许多学者的关注。研究表明:0SA的发生受多种因素的影响，但根本原因是由于上呼吸道解剖和功能的改变，GG(GenioglossusGG)活动性丧失是引起OSA患者气道闭塞的主要因素[7]。岛叶皮质(InsulaCortexIC)是大脑颞叶皮层的一个区域，与大脑内的其他结构有着广泛的神经联系。Ic、杏仁核、海马回有呼吸单位参与醒觉的呼吸调节。来自呼吸道和肺内感受器的迷走神经刺激投射至Ijlc，Ic在健康人呼吸困难传入过程发挥重要作用M。已有研究证实OSA患者血浆5-HT(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平明显异于正常人水平[9,]。而刺激Ic致使中缝核5-HT的释放减少，可能参与睡眠呼吸调节[11]。[0003]OSA是具有潜在生命威胁的疾病，所引起的慢性呼吸衰竭是影响患者生活质量的最严重的综合征。OSA患者的夜间最低血氧饱和度常低于80%。长期低氧血症导致交感神经兴奋，机体内环境紊乱，多脏器功能损害，患者后期常并发高血压、脑出血、脑梗塞、心肌梗塞、肺源性心脏病、糖尿病、高血脂、心律失常是OSA常见的并发症，特别是夜间缓慢性心律失常，是夜间猝死的主要原因。现认为OSA是独立于年龄、体重、饮食、遗传等原因的高血压发生、发展的重要危险因素。目前，睡眠呼吸暂停低通气综合征与高血压、中风、心梗及充血性心衰等疾患仍是世界性广泛关注的问题，已成为医学界、生物学界亟待解决的问题。[0004]由于阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的发病机制不清，因而目前对该病的治疗效果不理想，因此，如何构建阻塞性睡眠呼吸暂停综合征动物模型，为研究该病的发病机制以及研究该病的治疗效果是本领域技术人员亟待解决的技术问题。【
发明内容】[0005]本发明的目的是提供一种构建阻塞性睡眠呼吸暂停综合征动物模型的方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:[0006]本发明一方面涉及构建阻塞性睡眠呼吸暂停综合征动物模型的方法，其特征在于通过插入将麻醉动物岛叶皮层与微量注射装置直接相连的玻璃微电极，将药物向核团内注射到脑内岛叶皮层中。[0007]在本发明的一个优选实施方式中，所述的药物中含有L-谷氨酸。[0008]在本发明的另一个优选实施方式中，所述的药物为人工脑脊液配制的L-谷氨酸，优选的，所述的L-谷氨酸的浓度为5-20mmol/L。[0009]本发明另一方面还涉及L-谷氨酸在配制刺激脑内岛叶皮层的药物中的应用。[0010]在本发明的一个优选实施方式中，所述的应用是用于构建阻塞性睡眠呼吸暂停综合征动物模型。[0011]通过本发明的方法，L-谷氨酸刺激岛叶皮层可以产生类似于阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的呼吸困难症状，可以成功构建阻塞性睡眠呼吸暂停综合征动物模型。此外，岛叶皮层可能是OSA的皮层中枢，在岛叶皮层及其传导通路上的某个部位采取措施，可以干预OSA的发生和发展，使之成为治疗OSA的方法。【具体实施方式】[0012]实施例1[0013]材料:本实验所用的试剂包括:L-谷氨酸(购自北京鼎国生物制品研究中心)，7.5%EDTA钠和滂胺天蓝(美国，Sigma公司)，盐酸利多卡因(无锡市第七制药有限公司)，生物素标记的羊抗鼠/兔IgG(二抗)和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(三抗)，(中国，福州迈新生物技术开发有限公司)，SerotoninRIA试剂盒(德国，LaborDiagnostikaNordGmbH&C0.KG);使用的仪器有:VDT_1型脑立体定向仪(日本，TAKAHASHICompany),BL-420E+生物技能实验系统(中国，四川成都泰盟科技优先公司)，HTEC-500荧光光度仪(Japan,EIcomCorporation)等。[0014]分组:健康Wistar成年大鼠60只，随机分为3组:药物刺激岛叶组20只(人工脑脊液配制lOmmol/LL-谷氨酸，pH7.4，0.3ul2_3min微量注射)，对照组20只(L-Glu刺激岛叶周围组10只，人工脑脊液刺激岛叶组10只)，假手术组20只(仅行同前麻醉、头部固定、岛叶部位埋置套管)。[0015]麻醉:实验用各组动物用20%urethane,6ml/kg,腹腔注射麻醉,使动物在整个实验过程中处于浅麻状态(有较灵敏的角膜反射，夹后肢可引起屈腿反射，但动物没有任何自发活动)。实验过程中，根据需要补充麻醉剂，一般为初剂量的1/5。以热垫使肛温保持在36°C。实验在环境安静、光线柔和的条件下进行。[0016]刺激岛叶皮层:用耳棒将各刺激组动物固定在脑立体定位仪上，切开头皮暴露颞骨。岛叶皮层坐标为AP:+1.0，L:5.4-5.5，H:4.2~4.4。在大鼠呼吸平稳状况下，通过插入岛叶皮层与微量注射装置直接相连的玻璃微电极，将药物向核团内注射，为了避免因注射过快而发生短时间内颅内压突然升高而影响神经元功能，注射时间至少持续3min，并密切观察注药前后大鼠的呼吸变化。[0017]以手术埋置同心圆电极，刺激组通过埋置在相应核团的微电极注射。呼吸运动和颏舌肌肌电用BL-420E2多导记录仪记录。动物出现呼吸暂停后，由内眦静脉抽血，应用HTEC-500荧光光度仪(EIcomCorporation,Japan)检测血浆五羟色胺含量。处死动物后，取桥脑下段和延髓上端之间脑干组织行矢状位切片，并取颏舌肌组织。然后行脑干和颏舌肌HE染色及五羟色胺的免疫组化染色。[0018]主要观察指标:观察刺激岛叶皮层后大鼠呼吸运动曲线和颏舌肌肌电变化、五羟色胺在大鼠脑干神经细胞和颏舌肌细胞胞浆的表达及血浆五羟色胺含量的变化。[0019]结果:L_谷氨酸刺激岛叶皮层后，动物出现呼吸暂停，颏舌肌肌电振幅由刺激前(100±59.47)μV,降低到刺激后(13.41±1.58)μV(P<0.01);肌电积分减少(93.51±0.99)%(与对照组(使用人工脑脊液注入岛叶)比较)(P<0.01);脑干神经细胞和颜舌肌细胞胞浆内五羟色胺棕黄色颗粒颜色变淡，数量减少，图像灰度值明显降低(1698936±725837)与对照组(3203352±194972)比较差异显著(t=3.073.P<0.05)。颜舌肌细胞胞浆内的棕黄色颗粒颜色变淡，数量减少，图像灰度值明显降低(1698936±725837)与对照组(3203352±194972)比较差异显著(t=3.073.p<0.05)；外周血五羟色胺浓度显著低于对照组(P<0.05)。[0020]结论:谷氨酸剌激岛叶皮层可以产生类似于阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的呼吸困难症状；阻塞性睡眠呼吸暂停综合征主要症状一呼吸困难的脑内最高级代表区在岛叶皮层。[0021]参考文献[0022]1.SaboiskyJPjChamberIinNL，MalhotraA.potentialtherapeutictargetsinobstructivesleepapnoea.SaboiskyJPjetal.ShExpertOpinTherTargets.2009Jul；13(7):795-809.[0023]2.SaboiskyJPjStashukDWjHamiIton-WrightAjCarusonaAL,CampanaLMjTrinderJjEckertDJjJordanAS,McSharryDGjWhiteDPjNandedkarSjDavidWSjMalhotraA.Neurogenicchangesintheupperairwayofpatientswithobstructivesleepapnea.SaboiskyJPjetal.ShowAmJRespirCritCareMed.2012Febl；185(3):322-9.Epub20110ct20[0024]3.MckayLCjEvansKCjFrackowiakRSjCorfieldDR.Neuralcorrelatesofvoluntarybreathinginhumans.JApplPhysiol.2003；95:1170-8.[0025]4.HendersonLA,WooMA，MaceyPM，MaceyKEjFrysingerRCjAlgerJRjYan-GoFjHarperRM.NeuralresponsesduringValsalvamaneuversinobstructivesleepapneasyndrome.JApplPhysio12003:94(3):1063-1074.[0026]5.CuiLjWangJHjWangM，HuangMjWangCY，XiaH，XuJGjLiMX,WangS.1njectionofL—glutamateintotheinsularcortexproducessleepapneaandserotoninreductioninrats.SleepBreath2011.2011；Sep27..[0027]6.KouZYjLiMSjZhangCXjWangS.[Habenulaparticipatesthevasopressorresponsebystimulationoftheinsularcortex,central—，lateralamygdaloidnucleusrespectively].ZhongguoYingYongShengLiXueZaZh1.2003Nov；19(4):334-6.[0028]7.LiMjWangJ，HuangM，LinWjWangM，YuLjWangS.Blockageofthehabenularnucleuscaneliminatedyspneainducedbyelectrostimulationoftheinsularcortex.NeuralRegenerationResearch2010:5(13):1025-1029。[0029]8.TheMinistryofScienceandTechnologyofthePeople’sRepublicofChina(2006).GuidanceSuggestionsfortheCareandUseofLaboratoryAnimals.2006-09-30.[0030]9.FieldsHLjBryJ，HentallI,ZormanG(1983).Theactivityofneuronsintherostralmedullaoftheratduringwithdrawalfromnoxiousheat.JNeurosc1.1983；3(12):2545-2552.[0031]10.WangS，FuQ，FuJ.Modulationofpreopticareaondischargesofparafascicularpainneurons.KexueTongba0.1983；28(3):401-405.[0032]11.CaoY，FujitoYjMatsuyamaK，AokiM(2006).Effectsofelectricalstimulationofthemedullaryraphenucleionrespiratorymovementinrats.JCompPhysiolANeuroetholSensNeuralBehavPhysiol.2006;192(5):497-505.[0033]12.CarleyDWjTrbovicSjRadulovackiM.SleepapneainnormalandREMsleep-deprivednormotensiveWistar-Kyotoandspontaneouslyhypertensive(SHR)rats.[J]PhysiolBehavj1996，59:827-831.[0034]13.LingL.SerotoninandNMDAreceptorsinrespiratorylong-termfacilitation.RespirPhysiolNeurobiol.2008Decl0;164(1-2):233-41.[0035]14.GraceKP，LiuH，HornerRL.5-HTlAreceptor-responsivepedunculopontinetegmentalneuronssuppressREMsleepandrespiratorymotoractivity.JNeurosc1.2012Febl；32(5):1622-33.[0036]15.SheltonL，BecerraL，BorsookD.Unmaskingthemysteriesofthehabenulainpainandanalgesia.ProgNeurobiol.2012Feb；96(2):208-19.[0037]16.WangS.Habenula—anewtargetfortreatmentofintractabledepression.ShengLiKeXueJinZhan.2011Dec；42(6):407-12.[0038]17.PobbeRLjZangrossiHJr.Thelateralhabenularegulatesdefensivebehaviorsthroughchangesin5-HT—mediatedneurotransmissioninthedorsalperiaqueductalgraymatter.NeurosciLett.2010Jul26；479(2):87-91.[0039]18.C.PeyronjJ.-M.Petit,C.RamponjM.JouvetandP._H.LuppijForebrainafferentstotheratdorsalraphenucleusdemonstratedbyretrogradeandanterogradetracingmet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