白果内酯在制备治疗帕金森病药物中的用途的制作方法

专利名称：：白果内酯在制备治疗帕金森病药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种白果内酯在制备治疗帕金森病药物中的用途。
背景技术：
：1817年，英国医生JamesParkinson报告了第一例帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)，其主要临床症状为震颤、强直、运动迟缓和姿势步态异常。如今，PD已成为危害中、老年人健康的位居第二的神经退行性疾病(Neurodegenerativedisease,ND)。从全球范围来看，帕金森病在西欧、北美的患病率约为70—180/10万人，其年发病率在8—18/10万人。其中40岁以上的成年人患病率大约为0.1%—0.2%,而65岁以上的老人更高，其患病率高达1%。国内最新流行病学调查结果显示在55岁以上的中国人中，其患病率达1%，全国的PD患者约为500—700万。随着人口老龄化，PD的发病率必将进一步上升。帕金森病中神经元退行性病变的细胞和分子机制尚未完全阐明，目前主要有三种学说(1)氧化自由基损伤学说有足够的证据表明PD患者多巴胺神经元受到氧化应激损害。PD患者死后尸检中发现，黑质中一些氧化损害的标志物质明显增加，包括脂质过氧化物丙二醛及过氧化氢、蛋白质和DNA的氧化产物碳酰化蛋白等。黑质DA神经元代谢活跃，消耗大量分子氧，以供线粒体呼吸，产生ATP，线粒体电子传递呼吸链渗漏即可产生活性氧(ROS)，其次DA在其合成、释放、代谢过程中也伴有ROS的生成，引起氧化损伤。同时强抗氧化系统GSH-GSSG水平在中脑比其它脑区低。近年来生化分析研究发现，PD中黑质致密区内铁水平升高，铁代谢紊乱，诱发氧化应激，导致细胞死亡。(2)炎症反应近年来诸多学者报道，PD患者脑脊液和黑质纹状体系统中炎性细胞因子均较健康对照组增高。炎症反应如何诱导DA能神经元变性的机制不明，目前普遍认为小胶质细胞激活释放的致炎性细胞因子促发的毒性反应起重要作用。首先，致炎性细胞因子诱导的毒性机制主要是导致iNOS的激活，iNOS可以介导大量的NO的合成。Himot等研究发现黑质中表达iNOS的胶质细胞密度与健康组相比明显增高。相应的PD患者CSF中亚硝酸盐亦明显增高，Liberatore等通过研究发现，缺乏iNOS基因的小鼠可部分对抗MPTP毒性，在基因水平进一步证实iNOS是MPTP导致DA能神经元变性所必需的；Iravani等也发现iNOS抑制剂可以部分抑制LPS诱导的DA能神经元变性。NO诱导的神经毒性可能通过几种不同的作用机制1.NO可以与超氧自由基反应生成过氧化硝基化合物(ONOO.),ONOO—可以诱导酪胺酸残基亚硝化生成3-硝基酪氨酸，此外ONOO—还可以启动一系列的细胞毒性过程。在PD患者、MPTP和LPS模型的动物脑内-硝基酪氨酸免疫染色均增强进一步支持这一机制。2.NO可以破坏铁稳态平衡，在PD患者黑质发现铁浓度升高，铁可通过Fentoii反应产生大量毒性自由基。此外，小胶质细胞源性致炎性细胞因子可以通过结合特定的细胞表面受体，直接促发细胞内死亡相关信号传递途径。例如，在PD患者中发现胶质细胞表达TNF-a，而且其受体在黑质均增高。TNF-a可以激活Caspase途径和神经酰胺途径，而神经酰胺途径不仅能放大Caspase途径而且可以激活NF-kB，NF-icB的激活可以诱导多种炎症相关基因的表达。Hunot等用免疫组化方法发现PD患者脑中细胞核内NF-kB呈阳性的多巴胺能神经元数量是正常人的70倍，提示NF-kB的活化与PD的发病机制密切相关。(3)基因缺陷目前研究发现IO个染色体定位以孟德尔遗传方式与帕金森病连锁。其中，5个涉及常染色体显性遗传4个以常染色体隐性遗传方式传递，1个可能属于晚发性散发帕金森病。在这些染色体定位中有4个基因已被克隆a-synuclein(突触核蛋白)基因、parkin基因、DJ-1基因和UCH-L1基因。帕金森病主要病理特征是黑质多巴胺能神经元减少，最终导致其在纹状体的神经末梢退变，导致纹状体的DA含量减少，相应的胆碱能神经元活性增强，最终导致多巴胺和乙酰胆碱两种递质的平衡失调。表现为静止性震颤、强直、运动缓慢及姿势步态异常，可伴有智能减退、行为情感异常、言语错乱等非运动症状以及其它合并症。现有的治疗帕金森运动症状的方法见表1。YanagisawaN认为21世纪药物治疗帕金森病的进展集中在以下几个方面新的多巴胺受体激动剂的研究、神经营养因子的研究、特异性酶抑制剂的研究、肉毒素的应用及咖啡因在PD的新发现。其中除神经生长因子外都不能保护黑质多巴胺能神经元，神经生长因子虽然在动物实验发现可保护黑质多巴胺能细胞少受神经毒素的损伤，但因其不能透过血脑屏障，必须直接大脑内注射才能有效，这一问题影响了它的使用。咖啡因是由流行病学调査发现的，但其神经保护作用在实验室却未得到证实。其它三类是虽然能改善PD病人的运动症状，但不能根本地保护黑质神经元免于死亡。从上可知，寻找新的能保护黑质多巴胺能细胞的药物，然后结合现有改善PD运动症状的药物，可有效地治疗PD,提高PD患者的生活质量和存活年限，但目前为止，尚无预防或根治帕金森病的有关药物或疗法。表1.现有的治疗帕金森病运动症状的方法<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>
发明内容本发明的目的是提供一种白果内酯在制备治疗帕金森病药物中的用途。本发明的技术方案是白果内酯是从植物叶中提取所得，近年来研究发现白果内酯有多方面的神经保护作用1.脑缺血时的神经保护作用提高细胞内细胞色素C氧化酶III亚单位和NADH脱氢酶I亚单位的mRNA水平、增加线粒体呼吸链3、4阶段的氧耗和呼吸链控制速率，从而维持线粒体的氧化磷酸化，稳定线粒体的功能。2.降低低氧或低血糖时脑脊液中谷氨酸的释放，抑制低氧或NMDA诱导的磷脂A2的激活、磷脂降解和胆碱外流，抑制GABA(A)受体的激活。3.降低无血清诱导的鸡胚胎神经元的凋亡，抑制黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统生成的自由基诱导的PC12细胞凋亡，研究发现其能抑制早期氧化应激诱导的凋亡及减轻Caspase3、c-myc和p53的激活，减轻NO生成体3-morpholinosydnonimine对PC12细胞的细胞毒作用，并发现PC12胞内超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的水平升高，降低THP-1巨噬细胞内iNOS的蛋白和mRNA水平，增加鼠星型细胞中GDNF和VEGF的蛋白和mRNA水平。4.促外周神经再生作用。从上可知，白果内酯具有多方面的神经保护作用，包括保护线粒体、对抗神经兴奋性毒性、对抗凋亡、抗氧化应激和抑制iNOS的表达。而PD发病机制中涉及到氧化应激，炎症反应(iNOS的激活)，因此我们认为白果内酯对PD具有治疗作用。目前在临床上尚未有白果内酯单体制剂，对它的研究还在临床前实验研究阶段。白果内酯的神经保护作用正逐渐受到重视，但迄今为止，尚未有人报道白果内酯对帕金森病的治疗作用，本发明将首次探讨白果内酯对实验性帕金森病的治疗作用及其机制。本发明用立体定位技术将神经毒素6-羟基多巴(6-OHDA)注射到左侧大鼠黑质(Substantianigra,SN)制作PD大鼠模型。22天后，用左旋多巴(L-dopa)诱导大鼠向对侧旋转检测大鼠的行为改变；24天后，免疫组化法测定黑质和纹状体内酪氨酸羟化酶(TH)的表达；尼氏染色观察黑质的病理改变。在6-OHDA注射之后，使用NF-kB核转位抑制剂SN50,采用TUNEL和NF-kBp65荧光双标记法探索6-OHDA诱导的黑质细胞凋亡与NF-kB的关系。黑质受损12h后，免疫组化检测NF-kBp65、IkBouiNOS、p53、Bcl-2、HSP60蛋白的表达，24h后检测p53蛋白的表达。分别取3h、6h、12h、24h和60h时间点，采用免疫组化法观察腹腔注射白果内酯对NF國kBp65、lKBa、Bcl-2和iNOS的影响。实验结果白果内酯可明显减少L-dopa诱导的PD大鼠向对侧旋转圈数(P〈0.01);6-OHDA注射24天后，大鼠黑质TH阳性细胞大部分消失，但在腹腔注射白果内酯后，黑质TH阳性细胞存活明显增多，其中10mg*kg-l*d-l的白果内酯的作用最强(P4.01);同时，白果内酯组大鼠同侧纹状体内TH的表达明显高于模型组(P4.01);尼氏染色发现模型组大鼠损伤侧的SN神经元大部分消失，并伴有大量的胶质细胞增生，但白果内酯组损伤侧SN残存的神经元较多，胶质细胞增生减少。黑质损伤48h时，NF-kBp65向核转位的细胞TUNEL染色阳性，而在使用SN50后，未发生核转位的神经元TUNEL染色明显减少。与模型组相比，白果内酯在黑质受损3h、6h和12h时均能增强NF-kBp65向核转位，而在24h和60h时其核转位较模型组减少，相应的其抑制蛋白lKBa在3h、6h、12h和24h表达降低，而在60h有所增加；黑质受损后12h，白果内酯可提高黑质神经元HSP60的表达；在黑质损伤24h时发现，白果内酯可降低促凋亡蛋白p53的表达；与模型组相比，在6-OHDA注射3h、6h、12h和24h后，白果内酯组大鼠黑质iNOS蛋白的表达降低，而Bcl-2的表达升高。因此，白果内酯对帕金森病大鼠具有治疗作用，其作用机制与双向调控NF-kB的激活、降低细胞内促凋亡蛋白p53和iNOS的表达、增加抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60的表达有关。下面结合实施例对本发明作进一步的描述具体实施例方式实施例第一部分白果内酯对实验性帕金森病大鼠的治疗作用随着人口老龄化，帕金森病的发病率正逐渐上升，目前的治疗手段主要是药物治疗和手术治疗，其中手术治疗代价高，风险大，故限制了其推广。而药物治疗现在主要有多巴胺替代疗法，多巴胺受体激动剂等，对黑质神经元具有保护作用的药物很少。我国是一个天然药物大国，中药资源十分丰富，基于白果内酯在抗缺血损伤，神经兴奋损伤，氧化凋亡中的重要作用，而帕金森病人黑质内有在氧化应激，神经细胞凋亡等，考虑到两者的相衬之处，故本发明将探讨白果内酯对帕金森病大鼠的治疗作用。材料和方法1.实验动物SD大鼠，雄性，体重270士5g，清洁级，由苏州大学医学院实验动物中心提供(生产许可证XCYK(苏)No2002—0008，使用许可证SYXK(苏)No2002—0037)。2.主要试剂2.1白果内酯。2.2左旋多巴，批号为013K0677,购自SIGMA公司2.3鼠抗TH单克隆抗体，购自SIGMA公司2.46-羟基多巴，批号为043K4622,购自SIGMA公司2.5水合氯醛，批号为W20040420,购自上海化学试剂公司2.6二甲亚砜，批号为0303B39，购自上海生工生物工程有限公司2.7焦油紫，购自SIGMA公司生产2.8无水乙醇，批号为0402073601，购自安徽特酒总厂2.9多聚甲醛，批号为F20010606，购自上海化学试剂厂2.10生理盐水，批号为04030704，购自国营张家港市制药厂2.11Triton-X100，批号为BR2681，购自华美生物工程公司2.12牛血清白蛋白，批号为BP0041,购自华美生物工程公司2.13银杏总内酯(GGs),购自宁波利华制药有限公司2.14CYTM3驴抗鼠IgG，批号为56908,购自JacksonImmunoresearchLaboratories,InC公司3.主要仪器3.1立体定位仪，美国Stoelting公司3.2微量注射泵，PO-2213,美国PicoPlusHarvardApparatus公司3.3振动切片机，VT1000S，德国Leica公司3.4微量进样器，200309,中国上海医用激光仪器厂3.5荧光显微镜，Te2000U，日本Nikon公司3.6脱色摇床，TY-20型，中国上海西巴斯生物技术开发有限公司4.实验方法4.1试验分组和给药SD雄性大鼠，46只，体重260-280g，随机分为六组模型组(Model),小剂量组(L-BB)，中剂量组(M-BB)，大剂量组(H-BB)，假手术组(Sham)，阳性对照组(GGs)，除假手术组6只外，其余各组均8只。白果内酯和阳性药GGs溶解在二甲亚砜和生理盐水的混合溶剂中(以5:4的比例混合)，小、中、大剂量组大鼠分别腹腔注射5、10、20mg-kg《(T1的白果内酯，阳性对照组大鼠腹腔注射10mgAg+d"的GGs，假手术组和模型组大鼠腹腔注射等量的混合溶剂。手术前预防给药3天，手术后继续给药4天。6-OHDA溶解于生理盐水中，浓度为4fig卞r1。除假手术组大鼠黑质内注射2fd的生理盐水外，其余各组大鼠黑质内注射2(d的6-OHDA。4.26-OHDA损伤大鼠黑质制备PD类型实验前预试，大鼠黑质致密部注射蓝墨水后快速取脑，振动切片，鉴定注射部位是否准确，调整坐标，最后确定黑质致密部坐标为前囟后5.1mm，左旁开2.1mm,硬脑膜下7.8mm。实验时，缓慢进针，注射速度0.4nPmiiT1，注射5min，留针lOmin。模型组和假手术组腹腔注射混合溶剂(DMSO和生理盐水5:4混合)。手术后22天，腹腔注射50mg'kg丄d—1L-dopa诱导大鼠旋转，注射15miii后记数各大鼠右侧旋转圈数，模型组小于lOr/min视不成功帕金森病模型。4.3大鼠脑片的制备手术24天后，4%水合氯醛(0.4g*kg-l)麻醉，打开胸腔，暴露心脏，于左心室开一小口并剪破右心耳，用0.1mol'L-V的PBS左心室灌流至流出液澄清后，用含0.1mol丄"PBS的4%多聚甲醛灌流固定，断头取脑，保存在含0.1mol丄'1的PBS的4%多聚甲醛，4'C保存过夜。冠状面振动切片，45fiM。观察针眼位置，若不在黑质部位视手术不成功并弃之。脑片在30%的甘油中-20'C保存备用。4.4免疫组化观察大鼠黑质和纹状体内TH蛋白的变化取上述脑片用0.1mol.L—1PBS清洗两次，滴加1.0%牛血清白蛋白誦0.iy。TritonX-100后常温摇床lh，取出脑片并用PBS清洗三次，滴加鼠抗TH单克隆抗体(1:3000)并在常温下摇床lh，4'C孵育过夜。PBS清洗三次，滴加CYTM3驴抗鼠IgG(1:600)后常温摇床lh，PBS清洗三次。铺于载玻片，荧光封闭液覆盖，加盖盖玻片，指甲油封片。荧光显微镜10倍物镜下记数脑片同一冠状面SN处的TH阳性细胞数，2倍物镜下观察纹状体TH荧光密度。4.5Nissl染色检测大鼠黑质神经元的损伤情况取上述脑冠状切片贴于载玻片上，自然晾干后，依次浸泡在二甲苯中10min，100%的乙醇中10min，95°/。的乙醇中5min,70%的乙醇中5min，蒸馏水冲洗后放入PH值为3.9的0.5%的焦油紫溶液中染色30min，再用蒸馏水漂洗3min，然后依次在70%的乙醇，PH值为4.1的95%的乙醇，100%乙醇中脱色，二甲苯透明，最后中性树胶封片。在显微镜下观察大鼠黑质的形态学变化。实验结果1.白果内酯对左旋多巴诱导的大鼠旋转行为的影响左旋多巴可诱导6-OHDA损伤大鼠的健侧旋转，白果内酯和银杏总内酯可明显减少左旋多巴诱导的对侧旋转旋转次数，其中10和20mg-kg—、(T1的白果内酯效果非常显著(P<0.01)(表1.1)。提示白果内酯可减少左旋多巴诱导的大鼠对侧旋转次数。齐糧(mg'kg".d-1)nrotation(r'miiT1)假手术组6O.OO士O.OO模型组614.55±2.96^L-BB5610.07±2.69M-BB1060.00士0.0(TH-BB2060.00士0.00"GGs1060.00士0.0(T表l.l白果内酯对左旋多巴诱导的大鼠旋转行为的影响.注统计结果采用学生t检验.结果以均数土标准差表示.A表示P^.05，与假手术组.*和**表示P<0.05、P<0.01，与模型组比较.2.白果内酯对大鼠黑质TH阳性细胞的影响TH免疫组化发现6-OHDA注射24天后，大鼠黑质TH阳性细胞几乎消失。与模型组相比，白果内酯组大鼠黑质TH阳性细胞增多，其中10mg.kg^(T1的白果内酯效果最为显著(P<0.01)，阳性药银杏总内酯也可减轻TH阳性细胞的缺失(表1.2，图1.1和图1.2)。3.白果内酯对纹状体TH蛋白表达的影响TH免疫组化发现6-OHDA注射24天后，纹状体TH蛋白消失明显。而与模型组相比，白果内酯组大鼠纹状体TH蛋白增加，其中10mg，kg^cT1的白果内酯效果最为显著(P<0.01)，阳性药银杏总内酯也可减轻TH荧光密度的消失(图1.3)。假手术组6217.33±16.10模型组64.67±1.21AAL-BB566.67±2.25M-BB10656.50±17.78**H誦BB20641.00±13.28**GGs10648.67±7.97**表1.2白果内酯对大鼠黑质残存TH阳性细胞的影响.注统计结果采用学生t检验.结果以均数士标准差表示.AA表示P<0.01，与假手术组比较.*和**表示P<0.05、P<0.01，与模型组比较.图1.1损伤黑质内TH阳性细胞数.注统计结果采用学生t检验.结果以均数±标准差表示.#和##表示P<0.05、P<0.01，与假手术组比较.*和**表示P<0.05、P<0.01，，与模型组比较.n-6图1.2TH免疫组化显示白果内酯对损伤黑质内TH阳性细胞的保护作用.假手术组A(X20)和H(X200).模型组B(X20)和I(X200).L-BB:C(X20)和dJ(X200).M-BB:D(X20)和K(X200).H誦BB:E(X20)和L(X200).GGs:F(X20)和M(X20O).蓝色箭头指的是TH阳性细胞.图1.3免疫荧光显示白果内酯对同侧纹状体TH荧光强度的影响.(I)假手术组A，模型组B，L-BB:C，M-BB:D，GGs:E(X20).(II)图像分析软件分析各组大鼠(n=6)同侧纹状体TH平均荧光强度.统计结果采用学生t检验.结果以均数土标准差表示.##表示P<0.01，与假手术组比较.*和**表示卩<0.05、P<0.01，与模型组比较.4.Nissl染色检测白果内酯对黑质形态学变化的影响Nissl染色发现6-OHDA注射24天后，模型组大鼠黑质神经元几乎消失并伴有大量的胶质细胞增生。而与模型组相比，白果内酯组大鼠黑质神经元较多，胶质细胞增生减少，其中10mg'kg《d—1的白果内酯效果最为显著，阳性药GGs也可减轻神经元的缺失(图1.4)。图1.4白果内酯对6—OHDA损伤黑质神经元的保护作用.大鼠预先服用白果内酯并用6—OHDA损伤.Nissl染色大鼠脑片.假手术组A(X20)和G(X200).模型组B(X20)和H(X200).L-BB:C(X20)和I(X200).M-BB:D(X20)和J(X200).H-BB:E(X20)和K(X200).GGs:F(X20)和L(X200).绿色和黄色箭头分别指向神经元和胶质细胞.小结1.大鼠在6-OHDA损伤22天后，L-dopa诱导的大鼠向对侧旋转作用可被白果内酯抑制。2.白果内酯可抑制6-OHDA产生的大鼠黑质TH阳性细胞及同侧纹状体内TH蛋白减少作用。3.白果内酯可抑制6-OHDA产生的大鼠黑质神经元减少和胶质细胞增生作用。以上结果提示白果内酯对6-OHDA所致实验性大鼠帕金森病具有一定的治疗作用。第二部分白果内酯对实验性帕金森病大鼠治疗作用的机制研究一、白果内酯对6-OHDA损伤大鼠黑质DA神经元NF-kB通路激活的影响Hunot等用免疫组化方法发现PD患者脑中细胞核内NF-kB呈阳性的多巴胺能神经元数量为正常人的70倍，提示NF-kB的激活与PD的发病机制有关，NF-kB是一种重要的核转录因子，在调控细胞凋亡中发挥关键作用。因此我们在这部分实验中主要观察在6-OHDA诱导的黑质DA神经元死亡过程中细胞凋亡与NF-kB的关系，同时探讨白果内酯对NF-kB及其抑制蛋白lKBa的影响。材料与方法1.实验动物SD大鼠，雄性，体重270士5g,由苏州大学医学院实验动物中心提供(生产许可证XCYK(苏)No2002—0008，使用许可证SYXK(苏)No2002—0037)。2.主要试剂2.2兔抗NF-kBp65多克隆抗体，批号为弁J119，购自SantaCruz公司2.3鼠抗TH单克隆抗体，购自SIGMA公司2.4兔抗IKBa多克隆抗体，批号为弁H259，购自SantaCruz公司2.5InSituCellDeathDetectionKit,POD，批号为11684817910，购自Roch公司2.6CYTM3驴抗兔IgG，购自JacksonImmunoresearchLaboratories'InC公司2.7FITC驴抗鼠IgG，购自JacksonImmunoresearchLiaboratories，InC公司2.8FITC驴抗兔IgG，购自JacksonImmunoresearchLaboratories，InC公司3.主要仪器3.1激光共聚焦显微镜，SP2，德国Leica公司3.2电热鼓风干燥箱，CS101-2EB，重庆四达实验仪器有限公司实验方法4.1不同剂量的白果内酯对大鼠黑质lKBa蛋白的影响4.1.1实验分组和给药方案SD雄性大鼠，34只，体重260-280g，随机分为五组模型组(Model),小剂量组(L-BB)，中剂量组(M-BB)，大剂量组(H-BB)，假手术组(Sham),除假手术组6只外，其余各组均7只。白果内酯溶解在二甲亚砜和生理盐水的混合溶剂中(以5:4的比例混合)，小、中、大剂量组大鼠分别腹腔注射5、10、20mg，kg丄d"的白果内酯，假手术组和模型组大鼠腹腔注射等量的混合溶剂。手术前预防给药3天。大鼠黑质内注射6-OHDA方法同论文第一部分所述。4.1.2免疫组化脑片制备取6-OHDA损伤后12h时间点大鼠。免疫组化脑片制备方法见第一部分4.34.1.3免疫组化观察大鼠黑质lKBa蛋白的变化免疫组化方法见第一部分4.4，其中兔抗lKBa多克隆抗体的稀释度为1:50,CYTM3驴抗兔IgG为1:800。4.2不同时间点白果内酯对大鼠黑质lKBa蛋白的影响4.2.l实验分组和给药方案90只SD雄性大鼠，260-280g，随机分为三组模型组(Model),中剂量组(M-白果内酯)，假手术组(Sham)，除假手术组6只外，其余各组均42只。白果内酯溶解在二甲亚砜和生理盐水的混合溶剂中(以5:4的比例混合)，中剂量组大鼠腹腔注射10mg，kg"-cT1的白果内酯，假手术组和模型组大鼠腹腔注射等量的混合溶剂。手术前预防给药3天。大鼠黑质内注射6—OHDA如同论文第一部分所述。4.2.2免疫组化脑片制备分别取黑质损伤后3h、6h、12h、24h、48h和60h不同时间点的模型组和中剂量组大鼠各7只，假手术在3h时间点6只。免疫组化脑片制备方法见第一部分4.3。4.2.3免疫组化观察黑质lKBa蛋白的变化方法同本节4.1.3。4.3不同剂量白果内酯对大鼠黑质DA神经元中NF-KB激活的影响4.3.1实验分组和给药方案方法同本节4.1.1。4.3.2免疫组化脑片制备脑片是本节4.1.2保存的脑片。4.3.3免疫组化双标记观察大鼠黑质DA神经元中NF-kB蛋白的变化取上述脑片用0.1MPBS清洗两次，滴加1.0。/。牛血清白蛋白-0.1。/。TritonX-100后常温摇床lh，取出脑片并用O.lmol'I/1PBS清洗三次，滴加鼠抗TH单克隆抗体(1:3000)和兔抗NF-kBp65多克隆抗体(1:40)，并在常温下摇床1h，4'C孵育2天。0.1MPBS清洗三次，先滴加FITC驴抗鼠IgG(1:600)，常温摇床1h，PBS清洗三次。滴加CYTM3驴抗兔IgG(1:800)后常温摇床lh，0.1rnol.I/1PBS清洗三次。铺于载玻片，荧光封闭液覆盖，加盖盖玻片，指甲油封片。激光共聚焦显微镜下观察黑质TH阳性细胞内NF-kBp65的转位。4不同时间点白果内酯对黑质DA神经元中NF-KB激活的影响4.4.1实验分组和给药方案方法同本节4.2.1。4.4.2免疫组化脑片制备脑片是本节4.2.2保存的脑片。4.4.3免疫组化双标记观察黑质DA神经元中NF-kB蛋白的变化方法同本节4.3.3。荧光双标记检测NF-kB与细胞凋亡的关系4.5.1实验分组和给药方案SD雄性大鼠，12只，体重260-280g，随机分为三组模型组(Model),假手术组(Sham)，SN50组，每组4只。模型组大鼠黑质内先注射2fil的6-OHDA(4jig卞l—4后留针5min,后注射1(il无生物活性的SN50(10ng卞l—"，留针10min。SN50组大鼠黑质内先注射2fil的6-OHDA(4ng卞l—^后留针5min，后注射1nl的SN50(—种选择性的NF-kB核转位抑制剂，10Hg卞厂"，留针10min。假手术组大鼠黑质内先注射2jil的生理盐水后留针5min，之后注射1fil的生理盐水(10ng^1—"，留针10min。黑质坐标如前所述。4.5.2大鼠脑片的制备取6-OHDA注射后48h时间点大鼠。脑片的制备方法同第一部分4.3。4.5.3荧光双标记检测NF-kB与细胞凋亡的关系取上述脑片用0.1mol.L—1PBS清洗两次，滴加1.0%牛血清白蛋白-0.1%TritonX-100后常温摇床lh,取出脑片并用PBS清洗三次，滴加兔抗p65多克隆抗体(1:40)并在常温下摇床1h，4'C孵育48h。PBS清洗三次，滴加FITC驴抗兔IgG(1:600)后常温摇床1h，PBS清洗三次。铺于载玻片，维持脑片潮湿，滴加TUNEL反应液于脑片上并加盖一层塑料薄膜，放于潮湿的盒子中，在37"C电热鼓风干燥箱中孵育1h，取出脑片用0.1mol丄—的PBS清洗干净，最后荧光封闭液覆盖，加盖盖玻片，指甲油封片。激光共聚焦显微镜下观察黑质p65及TUNEL染色共表达。实验结果1.不同剂量的白果内酯对大鼠黑质lKBa蛋白的影响实验发现，与假手术组比较，在黑质内注射6-OHDA后12h时，模型组大鼠黑质lKBa蛋白的表达降低(P^).01)。与比模型组相比，各白果内酯组大鼠黑质神经元内lKBa的表达的更低(P〈0.01)，其中10mg'kg—^d—1的白果内酯组最能促进大鼠黑质lKBa蛋白表达下降(图2.1-1.11)。2.不同时间点白果内酯对黑质lKBa蛋白的影响在黑质损伤后3h、6h、12h、24h和60h时，与假手术组相比，模型组大鼠黑质IkBoi的表达逐渐降低(P〈0.01)。同模型组比较，10mg'kg"'(T1的白果内酯组大鼠黑质神经元内lKBa表达在3h、6h、12h和24h时较低(P〈0.01)，而在60h时表达升高(P〈0.01)(图2.2-I.11)。3.不同剂量白果内酯对大鼠黑质DA神经元中NF-KB激活的影响结果发现，大鼠黑质损伤12h时，模型组大鼠TH阳性细胞内NF-kBp65的核转位显著；与模型组大鼠比较，白果内酯各剂量组均可增强NF-KBp65在该时间点的转位，其中10mg'kg人d"的白果内酯作用最强(图2.3)。4.不同时间点白果内酯对大鼠黑质DA神经元中NF-KB激活的影响在黑质损伤后3h、6h、12h、24h和60h时，模型组大鼠黑质TH阳性細胞中NF-kBp65的核转位逐渐增强，在24h时达到高峰，之后持续激活。10mg*kg—、d"的白果内酯对NF-kBp65的核转位影响不一，其中在3h、6h和12h时能促进其核转位，而到24h和60h时又能抑制NF-kBp65的核转位(图2.4-2.8)。5.荧光双标记检测大鼠黑质NF-kB与细胞凋亡的关系实验发现，假手术组大鼠黑质内未发现TUNEL染色，p65蛋白也未发生核转位，模型组大鼠黑质有大量的TUNEL染色阳性细胞，p65发生了核转位的细胞也共表达了TUNEL染色。而SN50组大鼠黑质内TUNEL染色相对减弱，大部分细胞未发现核转位的p65，这些细胞中未发生TUNEL染色。(图2.9)。图2.1黑质内注射6-OHDA12h后IkBa的表达.(I)A:假手术组，B:模型组，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.蓝色箭头指向黑质神经元.(X400)(n)黑质内IkBci阳性细胞数.注统计结果采用学生t检验.结果以均数士标准差表示.##表示P<0.01，与假手术组比较.*和**分别表示P<0.05、P<0.01，与模型组比较.11=6图2.2黑质损伤后不同时间点白果内酯对IkBa表达的影响.(I)假手术组A，模型组B、D、F、H、J，M國BB:C、E、G、I、K.6—OHDA注射后3h:B和C，6—OHDA注射后6h:D和E，6—OHDA注射后12h:F和G，6—OHDA注射后3h:H和I，6—OHDA注射后60h:J和K.蓝色箭头指向黑质神经元.(X400)(II)黑质内注射6-OHDA后IkBa阳性细胞数的变化.统计结果采用学生t检验.结果以均数土标准差表示.##表示P<0.01，与假手术比较.**表示P<0.01，与模型组比较.11=6图2.3黑质内注射6-OHDA12h后白果内酯对TH阳性细胞内NF-kBp65核转位的影响.在6-OHDA损伤的黑质内TH阳性细胞内发现核内有p65存在.这种核转位可被白果内酯加强其中M-BB效果最强.绿色和红色荧光分别代表TH和NF-kBp65，.标尺20jim.图2.4黑质损伤3h后TH阳性细胞内发祥p65发生了核转位.这种核转位可被M-BB加剧.绿色和红色荧光分别代表TH和NF-KBp65，.标尺20fim.图2.5黑质内注射6-OHDA6h后白果内酯对TH阳性细胞内NF-kBp65核转位的影响.在6-OHDA损伤的黑质内TH阳性细胞内发现核内有p65存在.这种核转位可被M-BB加剧.绿色和红色荧光分别代表TH和NF-kBp65，.标尺20(im.图2.6黑质内注射6-OHDA12h后白果内酯对TH阳性细胞内NF-kBp65核转位的影响.在6-OHDA损伤的黑质内TH阳性细胞内发现核内有p65存在.这种核转位可被M-BB加强.绿色和红色荧光分别代表TH和NF誦kBp65，.标尺20fim.图2.7黑质内注射6-OHDA24h后白果内酯对TH阳性细胞内NF-kBp65核转位的影响.在6-OHDA损伤的黑质内TH阳性细胞内发现核内有p65存在.这种核转位可被M-BB减轻.绿色和红色荧光分别代表TH和NF陽kBp65，.标尺20拜.图2.8黑质内注射6-OHDA60h后白果内酯对TH阳性细胞内NF-kBp65核转位的影响.在6-OHDA损伤的黑质内TH阳性细胞内发现核内有p65存在.这种核转位可被M-BB减轻.绿色和红色荧光分别代表TH和NF-kBp65，.标尺20拜.图2.9黑质内注射6-OHDA48h后，p65核转位抑制剂SN50对6-OHDA诱导的细胞凋亡的影响.在6-OHDA损伤黑质内发现核内p65核TUNEL染色共表达于同一细胞中.但在使用SN50后，未发生p65核转位的神经元TUNEL染色减少，TUNEL阳性细胞明显减少.p65和TUNEL染色共表达由激光共聚焦显微镜检测所得.标尺40fim.二、白果内酯对6-OHDA损伤大鼠黑质促凋亡蛋白p53、iNOS表达的影响PD患者黑质区可见小胶质细胞和巨噬细胞剧增，iNOS的表达和活性大为提高，且伴随黑质区DA神经元的丧失，提示iNOS可能在PD的发生和发展中具有重要作用。病理条件下，iNOS的表达和活性增高可诱导产生过多的NO，过多的NO可以介导细胞损伤。iNOS蛋白是NF-kB核转录因子的下游调控蛋白，我们在这部分观察了白果内酯对6-OHDA损伤大鼠SN内iNOS蛋白的影响。p53蛋白是一种肿瘤抑制物也是一种重要的凋亡促进蛋白，当细胞的DNA受到辐射等因素损伤时，p53的N-末端会因磷酸化而影响其和DNA结合的能力，从而被激活，诱导细胞生长停滞、衰老、分化、凋亡及介导DNA修复。p53基因又是NF-kB下游调控基因，我们的前文的实验发现白果内酯对NF-kB有调控作用，本节观察白果内酯对6-OHDA损伤大鼠黑质p53蛋白表达是否有调控作用。材料与方法1.实验动物SD大鼠，雄性，体重270士5g，由苏州大学医学院实验动物中心提供(生产许可证XCYK(苏)No2002—0008，使用许可证SYXK(苏)No2002—0037)。2.主要试剂2.1白果内酯。2.26-羟基多巴，批号为043K4622,购自SIGMA公司2.3兔抗iNOS多克隆抗体，批号为12004，购自中杉金桥生物公司2.4CYTM3驴抗兔IgG，购自JacksonImmunoresearchLaboratories，InC公司2.5鼠抗p53单克隆抗体，批号为#1018,购自SantaCruz公司2.6免疫组化超敏SP试剂盒，批号为Kit—9706/9707/9708，购自福州迈新生物技术开发有限公司2.7苏木精，购自上海化学试剂公司3.主要仪器同上节34.实验方法4.1不同剂量的白果内酯对大鼠黑质iNOS蛋白的影响4.1.1实验分组和给药方案方法同本部分第一节4.1.14.1.2免疫组化脑片制备脑片是本部分第一节4.1.2保存的脑片。4.1.3免疫组化观察黑质iNOS蛋白的变化方法同本部分第一节4.1.3，兔抗iNOS多克隆抗体的稀释度为1:40。4.2不同时间点白果内酯对大鼠黑质iNOS蛋白的影响4.2.1实验分组和给药方案方法同本部分第一节4.2.14.2.2免疫组化脑片制备脑片是方法同本部分第一节4.2.2保存的脑片。4.2.3免疫组化观察大鼠黑质iNOS蛋白的变化免疫组化方法同本部分第一节4.2.3，兔抗iNOS多克隆抗体的稀释度为4.3不同剂量的白果内酯对大鼠黑质p53蛋白的影响4.3.1实验分组和给药方案方法同本部分第一节4.1.14.3.2免疫组化脑片制备损伤24h时，大鼠4%水合氯醛(0.4g*kg—"麻醉，打开胸腔，暴露心脏，于左心室开一小口并剪破右心耳，用0.1mol.I/1的PBS左心室灌流至流出液澄清后，以含0.1mol丄"PBS的4。/。多聚甲醛灌流固定，断头取脑，保存在含0.1mol'L—1的PBS的4%多聚甲醛中固定6天，脱水，石蜡包埋，冠状面石蜡切片，片厚2fiM。4.3.3免疫组化观察黑质p53蛋白的变化免疫组化根据SP超敏试剂盒说明操作(鼠抗p53单克隆抗体的稀释度为1:40)，最后苏木精复染。显微镜IO倍物镜下计数黑质p53阳性细胞数，40倍物镜下摄影。实验结果1.不同剂量的白果内酯对大鼠黑质iNOS蛋白的影响结果发现，与假手术组比较，黑质损伤12h时模型组大鼠黑质细胞大量表达iNOS。白果内酯使6-OHDA损伤大鼠黑质内iNOS阳性细胞数减少(P<0.01)。其中10mg-kg-、d—1的白果内酯大鼠黑质最为显著(图2.10—i.n)。2.不同时间点白果内酯对大鼠黑质iNOS蛋白的影响在黑质损伤后3h、6h、12h和24h的时间点发现模型组的大鼠黑质iNOS表达比正常对照组明显升高(P<0.01)，在12h时表达到高峰。10mg'kg-^d-1的白果内酯在3h、6h、12h、24h时间点都能明显降低iNOS的表达(P<0.01)(图2.10—I.11)。不同剂量的白果内酯对大鼠黑质p53蛋白的影响结果发现，与正常对照组相比，24h时模型组大鼠黑质p53的表达显著增加"<0.01)。5mrkg《cT1的白果内酯与模型组比较无差异性，但10、20mg.kg—、d-i的白果内酯组大鼠黑质内p53的表达明显降低(P〈0.05)(图2.12—III)。图2.10黑质内注射6-OHDA12h后iNOS的表达.(I)A:假手术组，B:模型组，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.(X400)(II)大鼠黑质内iNOS阳性细胞数.统计结果采用学生t检验.结果以均数土标准差表示.##表示P<0.01，与假手术组比较.**表示P〈0.01，与模型组比较.n=6图2.11黑质损伤后不同时间点白果内酯对iNOS表达的影响.(I)假手术组A，模型组B、D、F、H，M-BB:C、E、G、I.6-OHDA注射后3h:B和C，6-OHDA注射后6h:D和E，6-OHDA注射后12h:F和G，6-OHDA注射后24h:H和I.(X400)(II)黑质内注射6-OHDA后iNOS阳性细胞数的变化.统计结果采用学生t检验.结果以均数士标准差表示.##表示P<0.01，与假手术比较.**表示PO.01，与模型组比较.n=6图2.12黑质内注射6-OHDA24h后p53的表达.(I)A:假手术组，B:模型组，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.红色箭头指向黑质内神经元(X400)(II)大鼠黑质内p53阳性细胞数.统计结果采用学生t检验.结果以均数士标准差表示.##表示P<0.01，与假手术组比较.*表示P〈0.05，与模型组比较.n=6三、白果内酯对6-OHDA损伤大鼠黑质抗凋亡蛋白Bcl-2、HSP60表达的影响Bcl-2蛋白是一种重要的凋亡抑制蛋白，增加Bcl-2蛋白的表达在PD的治疗中具有重要的意义。目前，基因水平治疗PD主要是转基因治疗，但还处于实验阶段，Bcl-2基因是PD的治疗基因之一。白果内酯以前未见报道有调控Bcl-2的作用，因此我们通过6-OHDA诱导Bcl-2表达降低，在此基础上观察白果内酯对Bcl-2表达的影响。HSP60属于热激蛋白，主要存在与线粒体内，在胞浆内也有少量表达，在维护细胞稳定和保护细胞免受应激及其它损伤中具有重要作用。HSP60在6-OHDA诱导的大鼠黑质DA细胞损伤中的作用未见报道，前文我们发现白果内酯对Bcl-2表达有升高作用，而HSP60可升高Bcl-2的表达，为了探讨白果内酯升高Bcl-2表达是否与HSP60有关，本研究通过观察6-OHDA注射大鼠黑质后HSP60的表达情况，白果内酯对HSP60的干预作用，探讨BB神经保护作用是否与HSP60相关。材料与方法1.实验动物SD大鼠，雄性，体重270士5g，由苏州大学医学院实验动物中心提供(生产许可证XCYK(苏)No2002—0008，使用许可证SYXK(苏)No2002—0037)c2.主要试剂2.1兔抗Bcl-2多克隆抗体，批号为弁G1403，购自SantaCruz公司2.2兔抗HSP60多克隆抗体，购自SantaCruz公司3.主要仪器3.1立体定位仪，美国Stoelting公司3.2微量注射泵，PO隱2213，美国PicoPlusHarvardApparatus公司3.3振动切片机，VTIOOOS，德国Leica公司3.4荧光显微镜，Te2000U,日本Nikon公司4.实验方法4.1不同剂量的白果内酯对大鼠黑质Bcl-2蛋白的影响方法同本部分第二节4.3.1，其中大鼠在6-OHDA注射12h后进行免疫组化实验。不同时间点白果内酯对大鼠黑质Bcl-2蛋白的影响4.2.1实验分组和给药方案方法同本部分第一节4.2.1。4.2.2免疫组化脑片制备脑片是本部分第一节4.2.2保存的脑片。4.2.3免疫组化观察大鼠黑质Bcl-2蛋白的变化方法同本部分第一节4.1.3。不同剂量的白果内酯对大鼠黑质HSP60蛋白的影响4.3.1实验分组和给药方案方法同本部分第一节4.1.1。4.3.2免疫组化脑片制备脑片是本部分第一节4.1.2保存的脑片。4.3.3免疫组化观察大鼠黑质HSP60蛋白的变化方法同本部分第一节4.1.3。实验结果1.不同剂量的白果内酯对大鼠黑质Bcl-2蛋白的影响与正常对照组比，模型组黑质神经元内Bcl-2的表达减少(P〈0.01)，各剂量的白果内酯可不同程度地增加bcl-2的表达，其中10mg'kg—、d—1的白果内酯作用最强(P〈0.01)(图2.13-I.11)。2.不同时间点白果内酯对大鼠黑质Bcl-2蛋白的影响不同时间点的免疫组化观察发现，在3h时模型组大鼠黑质内Bcl-2表达就显著降低(PO.Ol)，相应的此时IOmg'kg人d"的白果内酯组大鼠Bcl-2表达升高(P〈0.01)。同样，在6h、12h和24h时间点，模型组大鼠黑质内Bcl-2表达逐渐、持续降低，其中在3h-6h时间段降低幅度较大，到24h时，其表达几乎消失。与模型组相比，10mgAg^(T1的白果内酯组大鼠黑质在各吋间点都能明显升高Bcl-2的表达(P〈0.01)，在6h达到高峰(图2.14—I.11)。3.免疫组化检测大鼠黑质HSP60的表达结果发现，与正常对照组相比，12h时模型组大鼠黑质HSP60的表达明显减少(P<0.01)。5mg.kg-hd-l的白果内酯大鼠黑质与模型组比较无差异性，但10、20mg*kg-l'd-l的白果内酯可显著增加HSP60的表达(P<0.05，P<0.01)(图2.15—I.11)0图2.13黑质内注射6-OHDA12h后Bcl-2的表达.(I)A:假手术组，B:模型组，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.红色箭头指向黑质神经元.(X400)。(II)黑质内Bcl-2阳性细胞数.注统计结果采用学生t检验.结果以均数±标准差表示.##表示P<0.01，与假手术组比较.*和**分别表示P<0.05和P<0.01，与模型组比较.n-6图2.14黑质损伤后不同时间点白果内酯对Bcl-2表达的影响.(I)假手术组A，模型组B、D、F、H，M-BB:C、E、G、I.6-OHDA注射后3h:B和C，6-OHDA注射后6h:D和E，6-OHDA注射后12h:F和G，6-OHDA注射后24h:H和I.蓝色箭头指向黑质神经元.(X400)(II)黑质内注射6-OHDA后Bcl-2阳性细胞数的变化.统计结果采用学生t检验.结果以均数土标准差表示.##表示P<0.01，与假手术组比较."表示P〈0.01，与模型组比较.n=6图2.15黑质内注射6-OHDA12h后HSP60的表达.(I)A:假手术组，B:模型组，C:L-BB.D:M-BB.E:H-BB.蓝色箭头指向黑质神经元.(X400)(II)大鼠黑质HSP60阳性细胞数.统计结果采用学生t检验.结果以均数土标准差表示.##表示P<0.01，与假手术组比较.*和**分别表示P<0.05和P<0.01，与模型组比较.n-6小结在本实验条件下，白果内酯对实验性帕金森病大鼠的治疗作用与下列机制有关一.白果内酯对6-OHDA损伤大鼠黑质NF-KB通路激活的影响l.大鼠黑质内注射6-OHDA诱导NF-kB的抑制蛋白lKBa的降解在3h、6h、12h、24h、60h呈逐渐增强趋势，24h开始加快，60h时表达几乎消失；白果内酯在3h、6h、12h和24h时间点可加剧lKBa的降解，而在60h时抑制其降解。2.大鼠黑质内注射6-OHDA诱导黑质TH阳性细胞内的p65发生核转位，12h后逐渐增强，在24h时达到髙峰，之后持续激活。白果内酯在3h、6h和12h时能促进p65发生核转位，而到24h和60h时又能抑制NF-kBp65的核转位。3.大鼠黑质内注射6-OHDA诱导的TUNEL阳性染色与p65核转位平行，共表达于同一神经元中。而NF-kB转位抑制剂SN50可减轻p65核转位，TUNEL染色明显减少，提示NF-kB的激活对6-OHDA诱导的细胞凋亡有促进作用。二.白果内酯对6-OHDA损伤大鼠黑质促凋亡蛋白p53、iNOS表达的影响1.大鼠黑质内注射6-OHDA后3h、6h、12h、24h，黑质细胞表达iNOS逐渐增强，在12h达到高峰，白果内酯可降低各个时间点iNOS的表达。2.大鼠黑质内注射6-OHDA后24h，可明显增加黑质p53的表达，白果内酯可抑制其表达。三.白果内酯对6-OHDA损伤大鼠黑质抗凋亡蛋白Bc卜2、HSP60表达的影响1.6-OHDA损伤大鼠黑质后6h、12h，Bcl-2的表达逐渐降低，24h时几乎消失，白果内酯可恢复其表达，其作用在6h达到高峰，之后逐渐减弱。2.大鼠黑质内注射6-OHDA12h后，可使黑质HSP60表达下降，白果内酯可恢复其表达量。以上结果提示1.NF-kB通路激活参与6-OHDA诱导的黑质神经元死亡，白果内酯的神经保护作用与其调控NF-kb激活有关。2.白果内酯通过降低NF-kB的下游靶蛋白p53、iNOS的表达发挥抗凋亡作用3.白果内酯通过升高抗凋亡蛋白Bcl-2、HSP60的表达发挥抗凋亡作用讨论一.白果内酯对帕金森病大鼠的治疗作用给大鼠单侧黑质内注射6-OHDA制备6-OHDA单侧损伤大鼠PD模型，因单侧纹状体内DA耗竭，表现为自发运动和身体姿势不对称，比如自发旋转。由于单侧DA耗竭和DA受体超敏，某些DA受体激动剂可诱导单侧黑质一纹状体通路损伤大鼠对侧旋转，这种药物诱导的旋转与大鼠DA耗竭及不对称的DA受体激动相平行，DA耗竭越严重旋转越厉害，DA受体激动的程度越高，旋转也越严重。因此DA受体激动剂诱导的大鼠旋转行为可反应大鼠黑质一纹状体通路的损伤程度。目前常用于诱导单侧损伤模型大鼠旋转的药物有阿朴吗啡(健侧旋转)、L-dopa(健侧旋转)。我们的实验发现，6-OHDA损伤后L-dopa诱导大鼠健侧旋转(IOr.miiT1以上)，这时的纹状体内TH染色几乎消失，说明黑质纹状体通路已经被严重损伤，在给予白果内酯治疗后能够明显减少L-dopa诱导大鼠对侧旋转次数，提示白果内酯能够减轻损伤侧纹状体内DA受体的超敏和DA耗竭，改善PD大鼠的行为缺陷。免疫组化观察发现，6-OHDA单侧损伤大鼠模型中，TH阳性细胞明显减少，白果内酯能够保护大鼠黑质多巴胺能细胞，提示白果内酯对实验性PD大鼠具有治疗作用。为了进一步证实白果内酯保护黑质纹状体通路免受6-OHDA的神经毒性，我们用TH免疫组化法观察了黑质DA阳性细胞投射在纹状体的神经末梢状况，实验发现6-OHDA可使纹状体TH染色消失，由此提示黑质DA阳性细胞投射在纹状体的神经末梢发生了根本性的退变；而白果内酯能够增加纹状体内的TH阳性密度，也就是保护了黑质DA神经元投射在纹状体的神经末梢。为了证实6-OHDA诱导的黑质神经元死亡，我们进一步的Nissl染色实验观察了黑质神经元胞体的存活情况。实验发现，6-OHDA诱导黑质神经元死亡，并伴有大量的胶质细胞增生，而在使用白果内酯干预后，6-OHDA损伤大鼠黑质神经元数目明显增多，胶质细胞增生减少。提示白果内酯可保护黑质神经元抵抗6-OHDA的神经毒性。由上可知，白果内酯通过保护黑质DA神经元，抑制6-OHDA损伤所致黑质DA神经元投射在纹状体上的神经末梢退变，减轻纹状体DA的耗竭和DA受体超敏，从而保护大鼠黑质一纹状体通路，由此减少6-OHDA损伤所致L-dopa诱导大鼠健侧旋转次数，改善PD大鼠的行为缺陷，提示白果内酯对实验性帕金森病大鼠有一定的治疗作用。1.白果内酯调控6-OHDA损伤大鼠黑质NF-kB通路激活NF-KB是一种能与免疫球蛋白K轻链基因的增强子KB序列特异结合的蛋白因子，在细胞受到氧化应激、炎症介质、病毒感染等多种刺激后，NF-kB可被激活，从而启动相关基因的转录，在机体的器官发育、炎症反应、感染和组织损伤中发挥重要作用。目前，国内外许多文章报道了NF-kB和细胞凋亡的关系，有些学者认为NF-kB抗细胞凋亡，而有些则认为NF-kB可以诱导细胞凋亡。多数研究结果认为NF-kB在細胞凋亡中具有双向作用，既能保护细胞免于凋亡又能促进凋亡，其不同作用可能与活化时间、部位、诱导因子、调控不同的靶基因DNA序列而转录不同蛋白质进而影响凋亡的进程、与其同时激活的其它信号转导途径的影响等密切相关。我们的实验发现，在6-OHDA损伤后3hNF-KB未被激活，而在6h时开始激活并进入核内，随着时间的后推，其激活程度逐渐增强，在24h时达到高峰，60h时持续高表达，与此相对应的，其胞浆内抑制蛋白lKBa在6-OHDA损伤后逐渐降解，3h-6h时变化相对较小，在12h时显著，表现为胞浆内表达减少，核内表达增加，而在24h、60h时其表达几乎消失。提示NF-kB信号通路的激活参与了6-OHDA诱导的黑质神经细胞凋亡。Tunel与p65双标记实验发现，6-OHDA损伤后60h时，在黑质处，NF-kB激活的神经元Tunel染色阳性，但在使用NF-kB核转位抑制剂SN50后，黑质凋亡的神经细胞明显减少，NF-kB未激活的神经元Tunel染色较少，提示NF-kB在6-OHDA注射后60h可促进黑质神经元的凋亡。而大鼠在预先给予白果内酯后，发现在6-OHDA损伤早期的3h-12h时，白果内酯可诱导NF-kB的核转位及其抑制蛋白lKBa的降解，而在黑质损伤后24h、60h时可明显抑制NF-kB的激活，且增加其抑制蛋白lKBa表达，故我们推测白果内酯抑制6-OHDA诱导的多巴胺能细胞凋亡与其调控NF-kB的激活有关。其损伤早期观察到的白果内酯促进NF-kB激活，可能原因有两个在黑质损伤早期，白果内酯确实能促进NF-kB激活；另外一个原因可能是模型组大鼠黑质在6-OHDA的损伤下黑质神经元已经大量死亡，而白果内酯组大鼠因为给予了神经保护剂白果内酯，使得大部分的黑质神经元免于凋亡，这时观察到的白果内酯促进NF-kB激活可能与白果内酯组大鼠黑质细胞数较多有关。有趣的是，在大鼠黑质损伤6h时，白果内酯上调Bcl-2表达的作用最强，而这时其又能促进NF-kB的激活，有文献报道Bcl-2通过激活NF-kB保护细胞免受凋亡，同样的也有文献报道了NF-kB保护细胞是通过上调Bcl-2的表达，因此我们推测在黑质损伤早期这两者之间相互促进，共同发挥抗细胞凋亡作用。但在6-OHDA损伤后24h、60h,NF-kB的持续激活可能与细胞凋亡密切相关，我们的Tunel与p65双标记实验证实了这点，相反地，这个时间段内发现白果内酯可明显抑制NF-kB的激活及增加IkB(x的表达，提示白果内酯保护受6-OHDA损伤的黑质多巴胺能细胞的机制之一可能是在损伤早期先激活NF-kb发挥抗凋亡作用，而后在NF-kB发挥促凋亡作用时抑制其活化。2.白果内酯下调6-OHDA损伤大鼠黑质促凋亡蛋白p53、iNOS的表达前文我们探讨了白果内酯调控6-OHDA损伤大鼠黑质NF-kB的作用，而受其调控的下游靶蛋白iNOS和p53在细胞凋亡中具有重要作用，因此我们研究了白果内酯对它们表达的影响。自从1987年Palmer等发现血管内皮细胞可以合成一氧化氮以来(NO)，其在生理、病理、药理等的广泛作用已越来越引起人们的重视。目前的研究业已证明NO有第二信使和神经递质的性能，在一定的条件下NO又能对神经细胞产生毒性作用。NO在体内是由L-精氨酸和分子氧在三种不同的一氧化氮合酶(NOS)催化下生成的。根据NOS的细胞或组织来源不同，将NOS分为三型nNOS(神经元型)、eNOS(内皮细胞型)和iNOS(诱导型)，前二者是原生型，具有钙离子依赖性表达，后者在生理条件下不被表达，当神经元损伤或免疫机制参与时以非钙离子依赖性表达，并介导迟发性神经元损伤。Youdim等研究揭示，PD患者黑质区可见小胶质细胞和巨噬细胞剧增，iNOS的表达和活性大为提高，且伴随黑质区DA神经元的丧失，提示iNOS可能在PD的发生和发展中起了重要作用。iNOS的表达和活性增高后可诱导产生过多的NO，过多的NO可以介导细胞损伤。我们的实验发现6-OHDA损伤大鼠黑质后，黑质区大量表达iNOS，根据不同时间点的免疫组化发现，iNOS的表达在注射6-OHDA后逐渐增加，在12h时达到高峰，间接提示有大量的NO的产生。NO在介导6-OHDA的神经毒性中具有重要作用，我们的实验发现白果内酯可明显抑制黑质受6—OHDA损伤后各时间点表达iNOS，间接地降低黑质NO的产生，减轻6-OHDA的神经毒性，从而保护受6-OHDA损伤的神经元。iNOS基因是NF-KB转录调控的下游基因之一，所以随着NF-kb在黑质受损后逐渐激活，iNOS蛋白的表达水平也逐渐升高，在12h达到髙峰，但随后的下降可能与黑质神经元大量死亡有关。由于iNOS基因转录激活过程中NF-KB信号通路不是唯一的途径，这可能是白果内酯在大鼠黑质损伤早期促进NF-KB激活，但又抑制iNOS表达的原因。p53蛋白是一种肿瘤抑制物，它可控制蠕虫、果蝇及人类等大多数动物的细胞数。当细胞的DNA受到辐射等因素损伤时，p53的N-末端会因磷酸化而影响其和DNA结合的能力，从而被激活，诱导细胞生长停滞、衰老、分化、凋亡及介导DNA修复。若损伤的细胞处于G1期，p53触发细胞周期限制点。如果损伤的细胞已进入S期，那么p53触发细胞凋亡。P53蛋白通过靶基因P21WAF1/eiP1抑制周期依赖性激酶诱导Gl/S阻滞，还能通过14-3-3sigma抑制Cdc25c参与G2/M关卡的调控。Qin等发现781海人藻酸诱导的大鼠纹状体细胞凋亡是通过激活NF-kB，从而增强p53的表达，使用NF-kB抑制剂SN50能够减少p53的表达，因为p53基因是NF-kB下游调控基因，从而抑制细胞凋亡的发生，证实了p53在细胞凋亡中具有十分重要的作用。p53诱导细胞凋亡的机制可能是(1)降低细胞内源性Bcl—2蛋白的表达并抑制其功能；(2)提高细胞内Bax蛋白的表达，使Bcl-2/Bax蛋白比例失调而促进细胞凋亡。我们的实验发现，6-OHDA损伤后24h,NF-kB的激活达到高峰，相应的，其下游调控蛋白p53的表达升高，提示p53在6-OHDA诱导的多巴胺能细胞凋亡中发挥了重要作用，然而，当大鼠预先给予白果内酯后，可明显抑制6-OHDA诱导的黑质细胞内p53表达的升高，这与白果内酯在大鼠黑质损伤24h时抑制NF-kB的转位相呼应，提示白果内酯保护受6-OHDA损伤的多巴胺能细胞与其降低胞内p53的蛋白水平有关，而下调p53蛋白可能原因是抑制NF-kB的激活。3.白果内酯上调6-OHDA损伤大鼠黑质抗凋亡蛋白Bcl-2、HSP60的表达Bcl-2蛋白是一种重要的凋亡抑制蛋白，转基因动物和基因转染实验表明，Bcl-2基因及其表达蛋白可以抑制多种组织细胞凋亡，延长细胞寿命，并且它能抑制多种因素如脂质过氧化、电离辐射、血清及生长因子缺乏等引起的细胞凋亡，故也称"存活基因"。其主要通过自身二聚或与Bax蛋白形成异二聚体来发挥其调控细胞凋亡的功能，Bax-Bcl-2异二聚体可以抵消Bcl-2-Bcl-2同二聚体的抑凋亡作用，而发挥促凋亡的功能。线粒体膜上的Bcl-2在调控细胞凋亡过程中发挥及其重要的作用，至少在三个水平发挥抑制凋亡的功能。我们的实验结果表明，经典的多巴胺能神经元毒物6-OHDA可显著减少黑质神经元表达Bcl-2蛋白，在黑质损伤后3h时，其表达已经很低，随着时间的延长，表达逐渐消失。有文献报道Bcl-2蛋白可通过调节核转录因子kb来发挥其抗氧化作用或抑制氧化自由基的产生，抑制细胞凋亡，因此我们推测模型组大鼠黑质早期NF-kB未能激活可能与早期Bcl-2表达减少有关。近来SiRNA研究表明，Bcl-2基因的沉默可以诱导p53依赖的凋亡途径活化。同样活化和稳定状态的p53可以改变Bcl-2的表达率，从而诱导凋亡的发生，推测模型组大鼠黑质p53的激活与损伤早期Bcl-2表达降低有关。但是在使用白果内酯后Bcl-2表达明显升高，在6-OHDA注射6h后这种抑制Bcl-2表达减少的作用达到高峰，其表达升高可能与促进NF-kB激活、降低p53的表达有关。提示白果内酯保护受6-OHDA损伤的多巴胺能神经元的机制可能与上调Bcl-2的表达有关。热休克蛋白(HSPs)是一类广泛存在于所有原核和真核细胞内，具有高度保守性的蛋白家族，当生物细胞受到某些应激剌激和其它损伤因素作用而发生应激反应时，就会大量合成，对细胞起一定的保护作用。HSP60是热休克蛋白家族成员，在大鼠早期发育及成年时脑中都有HSP60的基础表达，其主要存在于线粒体中，在胞浆中也有少量表达。在细胞受到应激或损伤时，有些文献报道HSP60表达升高，而有些则报道其表达降低，这可能与细胞所在环境和触发条件有关。HSP60保护细胞免于凋亡的机制主要是通过调控Bcl-2家族和稳定线粒体膜电位。过表达HSP60可增加抗凋亡蛋白Bcl-xl和Bcl-2的表达，降低促凋亡蛋白Bax和Bad的表达，升高Bcl-xl的表达是通过抑制其泛素化之后的蛋白水解，也可与Bcl-xl、Bax结合形成复合物，这可能也是HSP60行使抗凋亡的机制之一。线粒体凋亡途径的激活主要是由Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比率，而HSP60能够的上调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达，下调促凋亡蛋白Bax和Bad的表达，从而抑制细胞凋亡。我们的实验发现，6-OHDA可诱导大鼠黑质内神经元HSP60减少，而使用白果内酯后可明显减轻其表达减少，此点可能是前文提到白果内酯能维持Bcl-2表达的原因之一，提示白果内酯保护黑质神经元与其减轻HSP60表达减少有关。结论本发明首次证实了植物提取物白果内酯对实验性帕金森病大鼠的治疗作用及其机制研究。1.白果内酯可减少L-dopa诱导的PD大鼠对侧旋转次数，改善PD大鼠的行为缺陷，保护黑质TH阳性细胞抵抗6-OHDA的毒性，保护黑质一纹状体通路，提示白果内酯对实验性帕金森病大鼠具有一定的治疗作用。2.本实验研究显示NF-kb信号通路激活参与6-OHDA诱导的细胞凋亡，并发现白果内酯在黑质损伤早期促进NF-kB激活，而在损伤后期抑制其持续激活，因此，白果内酯通过双向调控黑质NF-kB激活，从而保护黑质多巴胺能细胞。3.白果内酯对6-OHDA所致黑质内细胞促凋亡蛋白p53和iNOS的高表达具有抑制作用。4.白果内酯可增加6-OHDA所致损伤的黑质抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60表达。综上所述，白果内酯对实验性大鼠帕金森病具有一定的治疗作用，其机制与双向调控NF-kB的激活、降低细胞内促凋亡蛋白p53和iNOS的表达、增加抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60的表达有关。基于以上实验证据，我们得出结论白果内酯对帕金森病具有一定的治疗作用。图1.1损伤黑质内TH阳性细胞数；图1.2TH免疫组化显示白果内酯对损伤黑质内TH阳性细胞的保护作用；图1.3免疫荧光显示白果内酯对同側纹状体TH荧光强度的影响；图1.4白果内酯对6—OHDA损伤黑质神经元的保护作用图2.1黑质内注射6-OHDA12h后IkBa的表达；图2.2黑质损伤后不同时间点白果内酯对IkBa表达的影响；图2.3黑质内注射6-OHDA12h后白果内酯对TH阳性细胞内NF-kBp65核转位的影响；图2.4黑质损伤3h后TH阳性细胞内发祥p65发生了核转位；图2.5黑质内注射6-OHDA6h后白果内酯对TH阳性细胞内NF-kBp65核转位的影响；图2，6黑质内注射6-OHDA12h后白果内酯对TH阳性细胞内NF-kBp65核转位的影响；图2.7黑质内注射6-OHDA24h后白果内酯对TH阳性细胞内NF-kBp65核转位的影响；图2.8黑质内注射6-OHDA60h后白果内酯对TH阳性细胞内NF-kBp65核转位的影响；图2.9黑质内注射6-OHDA48h后，p65核转位抑制剂SN50对6-OHDA诱导的细胞凋亡的影响；图2.10黑质内注射6-OHDA12h后iNOS的表达；图2.11黑质损伤后不同时间点白果内酯对iNOS表达的影响；图2.12黑质内注射6-OHDA24h后p53的表达；图2.13黑质内注射6-OHDA12h后Bcl-2的表达；图2.14黑质损伤后不同时间点白果内酯对Bcl-2表达的影响；图2.15黑质内注射6-OHDA12h后HSP60的表达。权利要求1.一种白果内酯，其特征在于制备治疗帕金森病药物中的用途。全文摘要本发明公开一种白果内酯在制备治疗帕金森病药物中的用途，白果内酯对帕金森病大鼠具有治疗作用，其作用机制与双向调控NF-κB的激活、降低细胞内促凋亡蛋白p53和iNOS的表达、增加抗凋亡蛋白Bcl-2和HSP60的表达有关，据此说明白果内酯对帕金森病具有一定的治疗作用。文档编号A61P25/00GK101095674SQ200710022139公开日2008年1月2日申请日期2007年4月30日优先权日2007年4月30日发明者劳安娜,周文轩,梁中琴,殷梦龙,秦正红,赵喜林,郭次仪,陈仲良,顾振纶申请人:苏州中药研究所