专利名称：藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及藤黄酸的新用途，具体涉及藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用。
背景技术：
血管生成(angiogenesis)是指源于已经存在的毛细血管和毛细血管后静脉的新生毛细血管生成。血管是输送氧、营养物质和代谢产物的重要途径，没有血管支持的组织或器官难以生存，因此与机体内器官和组织形成过程相伴随会发生血管形成。由于组织或器官对氧与营养物质的需要及对代谢产物清除的依赖，心脏和血管系统是胚胎发育过程中最早形成的器官。生理性的血管生成只存在于生殖系统和伤口愈合的过程，是短暂并且受到严格控制的。
血管生成是一复杂过程，主要由连续的10个步骤组成1、对缺氧做出反应，损伤或疾病组织合成释放血管生成因子；2、血管生成因子与内皮细胞上各自的受体结合；3、受体结合使内皮细胞激活；4、蛋白酶释放，溶解基质膜；5、内皮细胞移动、增值；6、黏附分子帮助出芽的血管向前延伸；7、产生基质金属水解蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)来溶解细胞外基质；8、血管生成素与Tie-2相互作用调节小管生成；9、EphB-ephrinB系统调节管状结构连接成环；10、周细胞参与新生血管的稳定性调节。
血管生成是一个及其复杂的过程，不仅有内皮细胞、平滑肌纤维等许多成分参加其中，它还涉及到多种起重要作用的酶和蛋白质。
肿瘤血管生成，是肿瘤研究中一个较新的领域。一百多年前人们就已发现肿瘤组织较正常组织富含血管。1945年，Algire首先提出了“肿瘤血管生成”的概念。1971年，Folkman最早提出肿瘤生长是血管依赖性的，但当时这种观点并未为人所接受，而在这8年后毛细血管内皮细胞培养技术的建立，11年后第一个血管生成抑制剂的发现，13年后第一个血管生成活性蛋白的纯化等一系列工作的完成，则使这一观点为越来越多的证据所支持，并使这一领域成为肿瘤研究的热点及肿瘤治疗的新策略。
肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变成有血管的快速增殖阶段，血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1-2mm3。
关节炎(如类风湿性关节炎)、视网膜病(如糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞、早熟性视网膜病)、血管瘤、银屑病等疾病均需要对病变组织血管生成进行控制。
藤黄酸(gambogic acid，GA，C38H44O8)是中药藤黄中有效成分之一。藤黄是藤黄科植物藤黄所分泌的干燥树脂。实验结果表明藤黄酸可以抑制动物移植瘤的肿瘤生长，在体外可以抑制肿瘤细胞的生长。目前没有藤黄酸作为抑制血管生成药的报道。
发明内容
本发明的目的是提供藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用。
本发明的技术方案是藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用，尤其是藤黄酸在制备抑制肿瘤、关节炎(如类风湿性关节炎)、视网膜病(如糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞、早熟性视网膜病)、血管瘤、银屑病等疾病的血管生成药物中的应用。
根据本发明可以将治疗有效量的藤黄酸和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以添加其他与藤黄酸没有拮抗作用的其他抗血管生成的药物。其制剂可以是药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂、脂质体等。藤黄酸的用量可根据用药途径、患者年龄、体重、体表面积、所治疗的疾病类型和严重程度等变化，其日剂量可以在1～5mg/Kg体重范围，可以一次或多次施用。
本发明的有益结果本发明公开了藤黄酸新的用途，即藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用。实验表明，藤黄酸对鸡胚尿囊膜血管生成、大鼠动脉环血管生成、血管内皮细胞迁移、血管内皮细胞小管生成、肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子等均有显著的抑制作用，可用于制备抑制血管生成的药物。
图1藤黄酸抑制鸡胚尿囊膜血管生成照片。其中A，对照；B，0.9ng GA；C，4.5ngGA；D，22.5ng GA。
图2藤黄酸抑制大鼠动脉环血管生成的显微镜图。其中A，对照；B，10-6mol/LGA；C，5×10-6mol/L GA；D，2.5×10-5mol/L GA。
图3藤黄酸抑制内皮细胞迁移的显微镜图。其中A，对照；B，0.5×10-6mol/L GA；C，1×10-6mol/L GA；D，2×10-5mol/L GA。
图4藤黄酸抑制内皮细胞小管生成的相差显微镜图。其中A，对照；B，0.5×10-6mol/L GA；C，1×10-6mol/L GA；D，2×10-5mol/L GA。
图5藤黄酸抑制肺癌细胞A549分泌VEGF的ELISA检测结果图。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1藤黄酸抑制鸡胚尿囊膜血管生成。
目的和原理在鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成早期，机体免疫系统尚未完全建立，对各种异物几乎不发生排斥反应，将含药物载体置于其表面，可观察到药物对血管生成的影响。由于其对抗血管生成药物敏感，目前仍被认为是一种较理想的药物筛选模型。
方法受精鸡胚置于孵化箱中孵化9天(气室端向上)。然后将鸡胚用酒精擦拭后静置15分钟，在鸡胚的上方划一个2×2cm大小的开窗位置，用剪刀磨切开窗，吹去蛋壳上磨切的粉尘，揭去开窗处的蛋壳，再用虹膜剪刀剪破壳膜，暴露出绒毛尿囊膜。按分组将不同量的藤黄酸(A对照组，不加藤黄酸；B藤黄酸低剂量组，0.9ng GA；C藤黄酸中剂量组，4.5ng GA；D藤黄酸高剂量组，22.5ng GA)加在经高压灭过菌的0.5×0.5cm大小的Whatman滤纸上，然后将滤纸放在绒毛尿囊膜两条大血管间的无血管部位，用灭菌透明胶带封窗。
结果与评价鸡胚放入孵化箱中孵化两天，揭去封窗的透明胶带，拍照，结果见图1。与对照组比较，给予藤黄酸后，血管生成受到抑制，大的血管较少，说明藤黄酸可以抑制鸡胚尿囊膜血管生成，并呈剂量依赖性。
实施例2藤黄酸抑制体外培养的大鼠动脉环血管生成。
目的和原理将大鼠主动脉环包埋于凝胶基质中，观察内皮细胞从血管内膜出芽并形成毛细血管样结构。
方法体重100～120g的雄性Wistar大鼠一只，脱臼法处死，取胸主动脉，去除外围结缔组织和脂肪组织，剪成长约1mm的动脉环，用M199无血清培养液漂洗。将大鼠主动脉段包埋于24孔板中的纤维蛋白胶中，用M199培养液(对照组，不含藤黄酸)及含有不同浓度的藤黄酸的培养液进行体外培养，每2至3天换液1次。
结果与评价内皮细胞从动脉段切口处向外生长，形成具有分枝的微血管样结构。7天后于倒置显微镜下观察动脉环附近内皮细胞和新生血管的生成情况并拍照。结果见图2(其中A为对照组；B为10-6mol/L GA组；C为5×10-6mol/L GA组；D为2.5×10-5mol/LGA组)。与对照组比较，给予藤黄酸后，动脉环的毛细血管样结构生成减少，说明藤黄酸抑制大鼠动脉环血管生成，并呈剂量依赖性。
实施例3藤黄酸抑制内皮细胞迁移。
目的和原理内皮细胞迁移实验采用transwell细胞培养小室进行。孔径为8μm的多聚碳酸盐滤膜将小室分隔成上下两层。在生长因子刺激下，内皮细胞通过阿米巴运动穿过8μm的滤孔，附着在滤膜的背面。利用该模型可评价药物对内皮细胞迁移能力的影响。
方法将内皮细胞给予含有不同浓度藤黄酸的1640培养基作用30分钟，然后将2.5×105个/ml HUVEC的细胞悬液400μl，加入到上室，下室加入600μl含刺激因子及不同浓度的1640培养液，于5％CO2孵箱37℃中培养4小时。
结果与评价取出滤膜，刮去膜上未迁移细胞，用100％甲醇固定滤膜，并以苏木精—伊红染色，甘油封片，最后利用显微镜观察并拍照，结果见图3(其中A为对照组；B为0.5×10-6mol/L GA组；C为1×10-6mol/L GA组；D为2×10-5mol/L GA组)。与对照组相比，给予藤黄酸后，内皮细胞的迁移能力受到抑制，说明藤黄酸可以抑制内皮细胞的运动，并呈剂量依赖性。
实施例4藤黄酸抑制内皮细胞小管生成。
目的和原理matrigel为大鼠ESH肉瘤细胞外基质提取物，富含IV型胶原，其成分与基底膜十分相似，可代替天然基底膜。可利用内皮细胞在matrigel上爬行、融合形成小管来观察研究药物对血管生成的影响。
方法将matrigel铺到96孔板上，80μl/孔，37℃，放置30min使其凝固。将内皮细胞分别给予含有不同浓度藤黄酸的培养基作用30分钟，然后每孔加入1×105个/ml内皮细胞悬液100μl。于5％CO2孵箱37℃培养8小时后在相差显微镜(×400)下观察小管生成情况并拍照，每孔选择五个不同部位，计数小管生成量并进行统计学分析。
结果与评价内皮细胞在matrigel中生长8小时后，细胞会由原来的多角形变成长梭形，并向凝胶基质中延伸生长，呈线形排列而形成管状结构，多个小管相互连接形成三维网状结构。结果见图4(其中A为对照组；B为0.5×10-6mol/L GA组；C为1×10-6mol/LGA组；D为2×10-5mol/L GA组)。与对照组相比，给予藤黄酸后内皮细胞网络状结构受到破坏，说明藤黄酸可以抑制内皮细胞小管生成，并呈剂量依赖性。
实施例5藤黄酸抑制肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)。
目的和原理通过酶联免疫原理，检测药物对细胞分泌VEGF的影响。
方法肺癌细胞A549(3×105/孔)接到六孔培养板，待细胞贴壁后，给予不同浓度藤黄酸(分别为0，0.5μM，1μM，2μM)，12h后收集细胞上清，使用ELISA试剂盒，测定VEGF蛋白的含量。
结果与评价将测得的VEGF的浓度/细胞数作为评价药物对VEGF分泌影响的指标，结果见图5。与对照组(即GA为0)相比，藤黄酸可以抑制肿瘤细胞分泌VEGF，并呈剂量依赖性。
权利要求
1.藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管生成药物为抑制肿瘤血管生成的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管生成药物为抑制关节炎病变组织的血管生成的药物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于关节炎是类风湿性关节炎。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管生成药物为抑制视网膜病病变组织的血管生成的药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于视网膜病是糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞或者早熟性视网膜病。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管生成药物为抑制血管瘤病变组织的血管生成的药物。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管生成药物为抑制银屑病病变组织的血管生成的药物。
全文摘要
本发明公开了藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用。本发明提供了藤黄酸在制备抑制血管生成药物中的应用，特别是在制备抑制肿瘤、关节炎、视网膜病、血管瘤、银屑病等疾病的病变组织血管生成的药物中的应用。根据本发明提供的应用，可将藤黄酸制备成抑制血管生成的药物，扩大了藤黄酸的应用领域。
文档编号A61P17/00GK101049327SQ200710022230
公开日2007年10月10日 申请日期2007年5月10日 优先权日2007年5月10日
发明者郭青龙, 杨岚, 尤启冬, 卢娜, 顾红燕, 齐琦 申请人:中国药科大学