抑制血管生成活性的化合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及海参共附生真菌发酵制备具有抑制血管生成作用的代谢产物1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)-2,3-二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰 基-2，5-二氢呋喃的制备及其在抑制血管生成活性的应用。
【背景技术】
[0002]海参作为重要的药食同源海洋生物，含有丰富的活性物质，如海参皂苷、海参多 糖、海参多肽、神经节苷脂等，具有非常高的营养价值。海参共附生微生物和海参长期共存， 共同进化，抵御海里恶劣的环境，可能进行基因交换，进而能够产生结构新颖、药理活性强 的化合物。海参共附生真菌种类丰富，已经报道的代谢产物有苯并呋喃类化合物，生物碱类 化合物、聚酮类化合物和萜类化合物，生物活性主要有抗肿瘤活性、抑制乙酰胆碱酶活性和 α_糖苷酶等活性，引起了化学家和药物研究者的高度重视。但是海参共附生真菌来源的抑 制血管生成活性的化合物除了本课题组之前报道的苯并呋喃类化合物外，还未见报道。本 专利申请的化合物，1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)-2,3_二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯Ια-羟基苯酚 )-4-羟基-5-羰基-2 ， 5-二氢呋喃， 且该菌代谢该化合物的量大 （ 100 yg/L) ， 利 用斑马鱼模型发现具有较强的抑制血管生成活性，在抑制血管生成为机理的抗肿瘤领域具 有广阔的前景。
[0003]肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病。肿瘤血管生成与肿瘤生长、侵袭和转 移等特性密切相关。由于肿瘤血管内皮细胞处于高度生长状态，药物选择性高;其细胞基因 组稳定，不容易产生多药耐药性；以及各种肿瘤血管基因内皮细胞差异较小，同一药物可能 对不同肿瘤有疗效，因此理想的肿瘤血管生成抑制剂具有高效、低毒、无耐药性并且具有抗 广谱瘤等特点。通过抑制血管新生血管生成治疗肿瘤已经成为一种广泛而被深入研究的新 兴治疗手段。
【发明内容】
[0004] 本发明涉及一种利用海参共附生真菌发酵制备代谢产物：1_氧-2-(2-(2-羟基异 丙醇)-2，3-二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋 喃的制备工艺、结构以及抑制血管生成的药理活性。
[0005] 本发明从海参的共附生真菌的发酵培养物中提取分离得到抑制血管生成的化合 物，它的结构式是：
白色胶状，核磁和高分辨质谱的物化参数是： Mffi(CDCl3): δΗ 3.36(2H，s，H-6)，3.63 (3H，s，CH30-5)，6.62 (1H，br s， H-2'）， 6·46(1Η， d， 8·1Ηz， H-5'）， 6.57 (1H， br d， 8·3Ηζ， H-6'）， 2·98(1Η， dd， J =15.9， 8.2 Hz, H-7，a)， 2.88(1H， dd， 16.2， 9.4 Hz, H-7，b)， 4.43(1H， t， 8.9Hz, H-8'），1.23(3H, s, H-10'），1.06(3H, s, Η-1Γ), 7.74(2H, d, 8.4Hz, H-2''/H-5，，）· 13CNMR(CDC13):Sc171.8(C-1)，138.2(C-2)，128.1(C-3)，84.6(C-4)，171.8(C-5)，38.7(C-6)，52.8(CH3〇-5)，125.8(C-l'），129.7(C-2'），126.9(C-3'），158.5(C-4'）， 107.7(C-5'）， 126.6(C-6'）， 29.9(C-7'）， 89.0(C-8'）， 70.0(C-9'）， 26.0(CH3， C-10)，25.0(CH3，C-ir)，121.2(C-l，，），129.6(C-2，，/C-6，，），115.2(C-3，，/C-5''）， 158.6 (C-4''）· HRES 頂S:[M + H]+ 441.1505。
[0006] -种抑制血管生成活性的化合物的制备方法，其特征是它包括如下步骤： 1) 制作种子培养液:将土曲霉Aspergillus terreus菌株斜面接种于葡萄糖、蛋白胨、 酵母浸膏培养基中：pH: 6.5-7.5，在温度25-30 °C、转速150rpm、培养120h，获得种子培养液； 2) 发酵罐发酵生产:将500-1000毫升种子培养液转入发酵培养基，利用30升发酵罐在 25-30 °C条件下发酵72-96小时;发酵培养基:葡萄糖0.5-2，酵母提取物，0.05-0.2，蛋白 胨0.1-0.4，氯化钠3-6，海水100(以上为重量比）。通气量0.3-0.5(体积比，通气量/发酵体 积），转速100-140 rpm;将种子培养液接入发酵培养基，于室温25-30°C发酵72-96h，得到发 酵液。
[0007] 将发酵液经纱布过滤和离心去除菌体，将菌体利用甲醇浸泡，发酵液利用大孔树 脂吸附，然后利用100%乙醇洗脱得到洗脱液，洗脱液浓缩得到浸膏;浸膏利用以硅胶为固定 相，以30-50%石油醚/乙酸乙酯为流动相进行洗脱;然后利用Sephadex LH-20为固定相，以 石油醚/二氯甲烷/甲醇=1:1:1为流动相进行洗脱，得到1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)-2,3_ 二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋喃。
[0008] -种抑制血管生成活性的化合物的应用，其特征是1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)_ 2，3-二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋喃在制 备抑制血管生成生物活性方面的药物中的应用。
[0009]结构确定:利用高分辨核磁波谱数据结合高分辨质谱，确定了 1-氧-2-(2-(2-羟基 异丙醇)_2，3-二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢 呋喃的结构。
[0010] 本发明具有以下有益效果，实验证明1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)-2,3_二羟基苯 并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋喃在100 yg/mL时，体 间血管数为14.60 ± 3.71，抑制率为43.4%;在10 yg/mL时，体间血管数为19.20 ± 2.58， 抑制率为25.6%;在1 yg/mL时，体间血管数为22.80 ± 1.79,抑制率为11.6%，具有显著性 差异，因此1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)-2,3_二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯 酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋喃具有显著抑制血管生成的活性，且在测定浓度范围内该 化合物显示出较好的量效的关系，发酵工艺简单，可以大规模制备，具有用于抗肿瘤药物的 前景。
【具体实施方式】
[0011]实施例1:菌株的获得:将威海成山头海域仿刺参表皮切成lcm X 1cm的小块，利用 TOA培养基添加硫酸链霉素和氨苄青霉素，25-30 °C培养7-14天，挑选纯的菌株，并利用分子 生物学手段结合形态鉴定确定土曲霉(Aspergillus terreus)。
[0012] 所述海参来源的土曲霉Aspergillus terreus，菌落培养初期浅土黄色，渐变为深 土黄色，菌落反面呈暗黄色至棕褐色;分生孢子头初为球形，继而成为致密的直柱形。
[0013] 土曲霉菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保 藏编号为:CGMCC No. 11545。地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所;邮编100101。保藏日期:2015年11月9日，该生物材料的分类命名及拉丁文名称：土曲 霉（Aspergillus terreus)。
[0014] 实施例2: -种抑制血管生成活性的化合物的制备方法，其特征是它包括如下步 骤： 1) 制作种子培养液:将土曲霉Aspergillus terreus CGMCC No. 11545菌株斜面接种 于葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏培养基中：pH:6.5-7.5,在温度25-30°C、转速150rpm、培养 120h，获得种子培养液； 2) 发酵罐发酵生产:将500-1000毫升种子培养液转入发酵培养基，利用30升发酵罐在 25-30 °C条件下发酵72-96小时;发酵培养基:葡萄糖1，酵母提取物，0.1，蛋白胨0.2,氯化 钠4，水10