0(以上为重量比）。通气量0.4(体积比，通气量/发酵体积），转速120 rpm;将种子 培养液接入发酵培养基，于室温28°C发酵72 h，获得发酵液浸膏制备:将发酵液经纱布过滤 和离心去除菌体得到菌液，菌体利用甲醇浸泡，将菌体分离后菌液利用大孔树脂吸附，然后 利用100%乙醇洗脱得到洗脱液，洗脱液浓缩得到浸膏； 分离和纯化:浸膏利用多次硅胶柱层析，以硅胶为固定相，以30-50%石油醚/乙酸乙酯 为流动相进行洗脱;然后利用Sephadex LH-20为固定相，以石油醚/二氯甲烷/甲醇=1:1:1) 为流动相进行洗脱，重结晶，得到1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)-2,3_二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3_( 4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋喃。
[0015] 实施例3:用途实施例。
[0016] 抑制血管生成活性:利用正常斑马鱼或者转基因斑马鱼，其胚胎经过链酶蛋白酶E 溶液脱去卵膜，并利用该化合物处理，生长24-36小时后计算节间血管生成数，并观察胚胎 死亡或者畸形情况。
[0017]罕济专基因斑马鱼分开喂养，照明14h/黑暗10h交替进行，定时喂以人工颗粒状饵 料和刚孵出的卤虫无节幼体(Artemia naup 1 ii )。采卵时取健康性成熟的斑马鱼按罕o7! : 1 的比例放入交配缸内，次日9-10时获得受精卵。对受精卵进行消毒和洗涤后移入转基因斑 马鱼胚胎培养用水(含5.0毫摩尔NaCl, 0.17毫摩尔KC1, 0.4毫摩尔CaCl2, 0.16毫摩尔 MgS〇4)中，28 °C下控光培养。
[0018]受精卵发育24 hpf(hours post fertilization)时，使用1 ·0 mg/mL链酶蛋白酶E 溶液脱去卵膜。在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，每孔8枚。设定 天然产物受试药1，1〇，1〇〇 μg/ml三个浓度组，PTK787阳性药组(0.5 μg/ml)和空白对照组 (胚胎培养用水，含0.5%二甲亚砜）。每次每组两个重复孔。每孔用培养水加至总体积为 2ml。保证DMS0的终浓度不高于0.5%。然后加盖，置于光照培养箱（28 °C)让胚胎继续发 育。药物处理24 h后，荧光显微镜观察，计算节间血管生成数，并观察胚胎死亡或畸形情况。
[0019] 1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)-2,3_二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯 酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋喃在100μg/ml时，体间血管数为14.60 ± 3.71，抑制率为 43.4%;在10 μg/ml时，体间血管数为19.20 ± 2.58,抑制率为25.6%;在1 yg/ ml时，体间 血管数为22.80 ± 1.79,抑制率为11.6%，抑制血管生成活性显著且具有显著性差异。
[0020] 表1:抑制血管生成活性。表中1代表1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)-2,3-二羟基苯 并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋喃。
[0021] 瓦他拉尼碱(PTK787)为阳性对照，P为显著性差异。因此1-氧-2-(2-(2-羟基异丙 醇)-2，3-二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋喃 具有显著抑制血管生成的活性，且在测定浓度范围内该化合物显示出较好的量效的关系。
【主权项】
1. 一种抑制血管生成活性的化合物，其特征是:它的结构式如下：2. 根据权利要求1所述的抑制血管生成活性的化合物，其特征是1-氧-2-(2-(2-羟基异 丙醇)-2，3-二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋 喃的物理性状及核磁氢谱和碳谱以及高分辨质谱的物化参数是：白色胶状； 核磁氢谱Gh 匪R)(CDC13): δΗ 3.36(2H, s, H-6), 3.63(3H, s, CH30-5), 6.62 (1Η, br s, Η-2'）， 6·46(1Η, d, 8·1Ηz, Η-5'）， 6·57(1Η, br d, 8·3Ηζ, Η-6'）， 2.98 (1Η， dd， J=15.9， 8.2 Hz, H-7，a)， 2·88(1Η， dd， 16.2， 9.4 Hz, H-7，b)， 4·43(1Η， t， 8·9Ηζ， H-8'）， 1·23(3Η， s， H-10'）， 1·06(3Η， s， H-ll'）， 7·74(2Η， d， 8.4Hz， H-2' '/H-5' '）· 核磁碳谱（13C NMR)(CDC13): δ。171.8(01)，138.2(02)，128.1(03)，84.6(04)， 171.8(05)，38.7(06)，52.8(CH3〇-5), 125.8(C-1'），129.7(C-2'），126.9(C-3'）， 158.5(C-4'）， 107.7(C-5'）， 126.6(C-6'）， 29.9(C-7'）， 89.0(C-8'）， 70.0(C-9'）， 26.0(CH3, C-10), 25.0 (CH3, C-ll'）， 121.2(C-1''）， 129.6 (C-2''/C-6''）， 115.2 (C-3''/C-5''）， 158.6 (C-4''）· 高分辨质谱(HRES 頂 S):[M + H]+ 441.1505。3. 根据权利要求1所述的抑制血管生成活性的化合物的制备方法，其特征是它包括如 下步骤： 1) 制作种子培养液:将土曲霉Aspergillus terreus菌株斜面接种于葡萄糖、蛋白胨、 酵母浸膏培养基中：pH: 6.5-7.5，在温度25-30 °C、转速150rpm、培养120h，获得种子培养液； 2) 发酵罐发酵生产：发酵培养基：葡萄糖0.5-2，酵母提取物，0.05-0.2，蛋白胨0 . ΙΟ · 4 ， 氯化钠 3-6 ， 海水100 ， 以上为重量比； 通气量 0· 3-0.5 ， 体积比 ，，转速100-140 rpm; 将种 子培养液接入发酵培养基，于室温25-30°C发酵72-96h，获得发酵液； 将发酵液经纱布过滤和离心去除菌体，将菌体利用甲醇浸泡，发酵液利用大孔树脂吸 附，然后利用100%乙醇洗脱得到洗脱液，洗脱液浓缩得到浸膏，浸膏利用以硅胶为固定相， 以30-50%石油醚/乙酸乙酯为流动相进行洗脱;然后利用Sephadex LH-20为固定相，以石油 醚/二氯甲烷/甲醇=1:1:1为流动相进行洗脱，得到1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)-2,3_二羟 基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2，5-二氢呋喃。4. 一种抑制血管生成活性的化合物的应用，其特征是1-氧-2-(2-(2-羟基异丙醇)-2， 3-二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-(4-羟基苯酚)-4-羟基-5-羰基-2,5-二氢呋喃在制备 抑制血管生成生物活性方面的药物中的应用。
【专利摘要】一种抑制血管生成的化合物及其制备方法，它包括如下步骤：将种子培养液接入发酵培养基，于室温25-30℃发酵72-96h；将发酵培养物用甲醇浸泡萃取，发酵液用大孔树脂吸附，然后利用乙醇洗脱，浓缩后得到浸膏。浸膏利用硅胶以及凝胶柱层析色谱进行分离，以石油醚/乙酸乙酯以及石油醚/氯仿/甲醇流动体系进行洗脱,得到1-氧-2-（2-（2-羟基异丙醇）-2,3-二羟基苯并呋喃-)-2-甲酸甲酯-3-（4-羟基苯酚）-4-羟基-5-羰基-2,5-二氢呋喃。在100？μg/mL时，体间血管数为14.60？±？3.71，抑制率为43.4%；在10μg/mL时，体间血管数为19.20±2.58，抑制率为25.6%；在1？μg/mL时，体间血管数为22.80？±1.79，抑制率为11.6%，具有显著性差异。化合物具有显著抑制血管生成活性，具有用于抗肿瘤药物制备的前景。CGMCC No.1154520151109
【IPC分类】C07D307/80, C12R1/66, A61P35/00, C12P17/16
【公开号】CN105601596
【申请号】CN201510912759
【发明人】夏雪奎, 张立新, 刘昌衡, 齐君, 贾爱荣, 刘新, 张永刚, 张绵松, 史亚萍, 袁文鹏
【申请人】山东省科学院生物研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年12月11日