专利名称：壳六糖在制备预防血管生成的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗肿瘤的药物，具体地说是壳六糖在制备预防血管生成的药物中的
应用，进一步说是壳六糖在制备治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的药物或保健食品中的应用。
背景技术：
随着人类社会的发展，环境污染的加剧、生活方式的改变，肿瘤尤其是恶性肿瘤-癌症，已经成为威胁人类生命的主要疾病之一。据统计恶性肿瘤已经成为人类死亡的第一位或第二位原因，每年全世界约有700万人死于癌症。尽管与一些发达国家相比，如美国、英国、法国、俄国、日本等，我国恶性肿瘤死亡率及占总死亡的比例相对较低，但在全国范围内恶性肿瘤在各种死因中也排到第二位，在大城市则已排在首位。 肿瘤不管是良性还是恶性，本质上都表现为细胞失去控制的异常增殖，这种异常生长的能力除了表现为肿瘤本身的持续生长之外，在恶性肿瘤中还表现为对邻近正常组织的侵犯及经血管、淋巴管和体腔转移到身体其它部位，即肿瘤转移。肿瘤转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，是临床上绝大多数患者的致死因素。原发肿瘤可进行手术切除或放射治疗，但已播散的癌症却往往难以用上述手段治疗而不损伤正常组织。因此，肿瘤转移对癌症治疗是一种严重的挑战。 在原发肿瘤生长早期，肿瘤细胞生长所需的养料是通过临近组织器官微循环渗透提供，这足以使原发肿瘤生长和扩散。当肿瘤直径达到或超过l-2mm3时，依靠环境渗透提供的营养物质已不能保证肿瘤细胞的生长。此时，向肿瘤提供养料的血管逐步形成。肿瘤诱导形成的毛细血管网不仅与原发肿瘤有关，而且也为侵入基质的游离肿瘤细胞进入循环系统提供了基本条件。新生毛细血管基底膜本身存在缺损，薄壁小静脉的壁也有缝隙，加上微小淋巴管道等脉管结构为肿瘤细胞提供进入循环系统的便利条件。因此，新生毛细血管的形成对原发肿瘤细胞本身的增殖和生长是必不可少的，同时也是肿瘤侵袭转移的必须条件。多数研究结果表明肿瘤血管形成参数可作为判断多种肿瘤复发、转移和预后的较好指标。 文献1阐述了肿瘤血管生成的分子机制(文献1. Patrick A， Sylvie L，Fr' ederic li，Andreas B. Molecular mechanisms of tumor vascularization. CriticalReviews in Oncology/Hematology 2005;54:53-61.)。血管生成需要血管内皮细胞的迁移、增殖和形成管状结构。肿瘤细胞能够产生大量的生长因子，包括VEGF、FGF、TGF等。这些生长因子能够通过一系列的信号传导促进血管内皮细胞的迁移、增殖和形成管状结构，最终形成新的血管。可见，血管内皮细胞的迁移、增殖和形成管状结构是形成心血管的必要条件。
发明内容
本发明的目的在于提供壳六糖在制备预防血管生成的药物中的应用，进一步壳六糖可在制备治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的药物中的应用；壳六糖能够抑制肿瘤血管生成通过作用于人脐静脉内皮细胞，抑制肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，从而抑制肿瘤的血管生成。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
壳六糖在制备预防血管生成的药物中的应用。 所述壳六糖能够通过抑制血管内皮细胞的迁移而抑制肿瘤的血管生成，即壳六糖可进一步用于制备治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的药物中；所述治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的药物为治疗实体瘤和抑制实体瘤转移的药物。 所述壳六糖为纯度^ 80wt^的壳六糖；所述壳六糖在细胞生存环境或培养体系中的有效作用浓度为50-100 g/mL，如实验应用时，壳六糖于患处体液中的有效作用浓度为50-100 ii g/mL。 所述壳六糖与药物学上可接受的药物辅料混合形成各种形式的散剂、膏剂，粉剂，针剂、水剂或注射剂；所述药物辅料为聚乙烯吡咯烷酮、微硅胶粉等。 在使用时可以采取皮下、静脉注射或肛肠给药；注射液的使用可以任意选用生理盐水、葡萄糖、稳定剂、防腐剂、悬浮剂或乳化剂等。
本发明的优点为 1.根据实施例1 :实验证明壳六糖能够明显抑制由肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞的增殖，抑制率在壳六糖浓度在50-100 ii g/mL时达到33. 3% 。因此，壳六糖具有抑制肿瘤血管生成的潜在作用，有望开发成抗肿瘤和抑制肿瘤转移的药物及与抗肿瘤有关的保健食品及食品添加剂等。 2.根据实施例2 :实验证明壳六糖能够明显抑制由肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞的迁移，抑制率在壳六糖浓度在50ii g/mL时达到78%。根据本发明实验结论，可进一步探讨壳六糖抑制肿瘤血管生成的确切成分。从而研制开发更高效的抗肿瘤和抑制肿瘤转移的药物。 3.根据实施例3 :实验证明壳六糖在50ii g/mL浓度下对抑制由肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞的迁移效果明显好于壳寡糖或者其他聚合度的壳寡糖单体。根据本发明实验结论，可对壳六糖抑制血管生成的机理进行进一步的研究，确定其作用机理，可开发成治疗与血管生成相关的疾病的药物等。
图1不同浓度壳六糖对脐静脉内皮细胞生长的作用。A为不同浓度壳六糖对正常的脐静脉内皮细胞的作用(24小时)；B为不同浓度壳六糖对肿瘤细胞培养液诱导的脐静脉内皮细胞的作用(24小时)。 图2不同浓度壳六糖对抑制肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞迁移的作用。其中al-a6均为10% (v/v)的MCF-7人乳腺癌细胞培养液诱导；
图350ii g/mL的壳寡糖和五种壳寡糖单体对抑制肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞迁移的作用。其中al-a6均为10% (v/v)的MCF-7人乳腺癌细胞培养液诱导；
具体实施例方式
肿瘤的血管生成是一个复杂的过程，乏氧、炎症以及外界的机械剌激等都是肿瘤血管生成的诱因。而参与肿瘤血管生成的生长因子、细胞因子也很多。目前抑制肿瘤血管
生成是抗肿瘤研究中的热点问题，具有很好的生物相容性和生物可降解性，有望开发为一
种有效的、安全的抑制肿瘤生长和转移的药物、保健食品或食品添加剂。 本发明采用质量含量>80%的壳六糖(其他含量为壳五糖和壳七糖)，通过细胞
生物学方法发现壳六糖能够明显抑制肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞的增殖和
迁移。说明壳六糖能够通过抑制血管内皮细胞的迁移而抑制肿瘤的血管生成。 参照文献(Anti-angiogenic activities of chitooligosaccharides，Haige Wu，
Ziang Yao， Xuefang Bai， Yuguang Du， Bingcheng Lin， CarbohydratePolymers， Volume
73， Issue 1，4July 2008， Pages 105-110)，人脐静脉内皮细胞的培养条件为在完全培养
基RPMI1640培养液中添加10X小牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素；37。C，通入C02
体积含量为5%的空气培养。 用人结肠癌细胞、肝癌细胞、卵巢癌、乳腺癌细胞等培养液作为诱导因子；人结肠癌细胞、肝癌细胞、卵巢癌、乳腺癌细胞的培养条件为在完全培养基RPMI1640培养液中添加10X小牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素；37。C，通入C02体积含量为5%的空气培养。 实施例1 参照文献(Anti-angiogenic activities ofchitooligosaccharides，Haige Wu，Ziang Yao，Xuefang Bai，Yugimng Du，Bingcheng Lin，CarbohydratePolymers,Volume 73，Issue 1，4July 2008，Pages 105-11CI)，将人脐静脉内皮细胞按0. 1-10X 106个/mL(本例采用l-2Xl(f个/mL)的密度接种于96孔板中，培养10_24h后加药，同时用肿瘤细胞培养液为诱导因子，继续培养10-24h(本例采用24h)后加入20 ii L MTT(5mg/mL)试剂和200 y L匿S0，l-5h(本例采用3h)后用酶标仪检测药物对细胞增殖的抑制作用。
由图1可以看出，壳六糖在50-100 ii g/mL的浓度范围内可以抑制肿瘤细胞培养液对脐静脉内皮细胞生长的促进，并与浓度呈正相关，但是浓度超过200yg/mL后这种抑制作用不明显。
实施例2 迁移实验将人脐静脉内皮细胞按O. l-10Xl(f个/mL(本例采用l-2Xl(f个/mL)的密度接种于6孔板中，培养10-24h (本例采用24h)，人脐静脉内皮细胞在6孔培养板中长成单层后，用细胞刮棒划痕，用PBS(pH 7.4)冲洗3遍，然后将壳六糖加入到培养液中，终浓度分另U为6. 25 ii g/mL， 12. 5 ii g/mL， 25 ii g/mL， 50 ii g/mL， 100 ii g/mL禾口 200 ii g/mL，同时用肿瘤细胞培养液为诱导因子，继续培养10-24h(本例采用24h)后在倒置光学显微镜下观察结果。 由图2可以看出，肿瘤细胞培养液能够明显促进人脐静脉内皮细胞的迁移。
由图2可以看出，50 ii g/mL和100 y g/mL的壳六糖均能够显著抑制或拮抗肿瘤细
胞培养液对人脐静脉内皮细胞迁移的促进作用。
实施例3 迁移实验将人脐静脉内皮细胞按O. l-10Xl(f个/mL(本例采用l-2Xl(f个/mL)的密度接种于6孔板中，培养10-24h (本例采用24h)，人脐静脉内皮细胞在6孔培养板中长成单层后，用细胞刮棒划痕，用PBS(pH 7.4)冲洗3遍，然后将壳寡糖和不同聚合度的壳寡糖单体加入到培养液中，终浓度为50ii g/mL，同时用肿瘤细胞培养液为诱导因子，继续培养 10-24h(本例采用24h)后在倒置光学显微镜下观察结果。 由图3可以看出，肿瘤细胞培养液能够明显促进人脐静脉内皮细胞的迁移。
由图3可以看出，50y g/mL的壳六糖较壳寡糖或者其他聚合度的壳寡糖单体对肿 瘤细胞培养液对人脐静脉内皮细胞迁移的抑制作用更明显。
权利要求
壳六糖在制备预防血管生成的药物中的应用。
2. 按照权利要求1所述的应用，其特征在于所述壳六糖能够通过抑制血管内皮细胞 的迁移而抑制肿瘤的血管生成，即壳六糖可进一步用于制备治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的药 物中。
3. 按照权利要求2所述的应用，其特征在于所述治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的药物为 治疗实体瘤和抑制实体瘤转移的药物。
4. 按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述壳六糖为纯度^ 80wt^的壳六糖。
5. 按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述壳六糖在细胞生存环境或培养体系中的有效作用浓度为50-100 ii g/mL。
6. 按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述壳六糖与药物学上可接受的药物辅料混合形成各种形式的散剂、膏剂，粉剂，针 剂、水剂或注射剂。
7. 按照权利要求6所述的应用，其特征在于所述药物辅料为聚乙烯吡咯烷酮或微硅 胶粉。
全文摘要
本发明涉及生物医药，具体地说是壳六糖在制备预防血管生成的药物中的应用；所述壳六糖能够通过抑制血管内皮细胞的迁移而抑制肿瘤的血管生成，即壳六糖可进一步用于制备治疗肿瘤和抑制肿瘤转移的药物中。本发明通过用肿瘤细胞培养液作为诱导因子，以人脐静脉内皮细胞为研究对象发现，壳六糖能够显著抑制肿瘤细胞培养液诱导的人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。
文档编号A61P35/00GK101732338SQ20081022906
公开日2010年6月16日 申请日期2008年11月26日 优先权日2008年11月26日
发明者吴海歌, 杜昱光, 熊川男, 白雪芳, 魏鹏 申请人:中国科学院大连化学物理研究所