专利名称：人血管内皮生长因子抗原表位及其表位疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种人血管内皮生长因子的抗原表位，以及利用该抗原表位设计的人血管内皮生长因子表位疫苗，该表位疫苗可用于肝癌等实体瘤的治疗。
背景技术：
血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)及其受体所介导的肿瘤新生血管生成在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。抗肿瘤新生血管生成是目前抗肿瘤药物研发的重要方向之一。迄今最成功的抗肿瘤血管生成药物是罗氏公司生产的Avastin。Avastin是一种抗体药物,其所识别的抗原分子就是人VEGF。目前，Avastin已被美国FDA批准用于治疗晚期大肠癌、复发性神经胶质瘤和肾肿瘤等。
Avastin是通过哺乳动物细胞生产的，其生产成本高，作为一种抗体药物，其临床用量又较大，所以，用Avastin治疗肿瘤的成本很高，一般人难以承受，因此，寻找、设计以人VEGF为靶标的价格低廉的新型抗肿瘤药物具有现实意义。Avastin是一种人源化抗体,其人源程度约为95%,用Avastin抑制肿瘤生长是一种被动免疫治疗方法。如果能够设计一种人VEGF疫苗，诱导机体自身产生针对人VEGF的中和性抗体，则可以实现对肿瘤的主动免疫治疗。但是，人VEGF由于是人体自身的分子，人体对其具有免疫耐受性，不能有效诱导人体产生抗体，因此，不能直接将人VEGF作为疫苗在人体内使用。合成肽疫苗(synthetical peptide vaccine)是用化学合成法人工合成的类似于抗原表位的小肽(约20 40个氨基酸)。合成肽疫苗一般由多个B细胞表位和T细胞表位共同组成。目前，合成肽疫苗的效果一般不理想，主要原因包括，难以准确模拟抗原分子中相应部位的三维结构，T、B细胞表位不能有效发挥协同作用，以及合成肽疫苗分子小、免疫原性差等。因此，分析人VEGF的抗原表位，设计、合成人VEGF多肽疫苗很难达到理想的免疫效果。若可以设计一种新型人VEGF重组表位疫苗，打破机体的免疫耐受性，让机体能够有效产生针对人VEGF的中和性抗体，就可以实现对肿瘤的主动免疫治疗。给人体免疫人VEGF表位疫苗在体内诱导产生的具有中和活性的抗体将是完全人源抗体，与肿瘤患者自身具有完全的生物相容性。而重组表位疫苗一般可以通过大肠杆菌等原核表达系统进行生产，其制造成本较低，而且其临床用药次数少，用量低，所以，用重组的表位疫苗进行的主动免疫治疗成本也较低。1989年，Ward等(Nature 1989，341 :544-546)首次制备了仅由抗体重链可变区(VH)结构域组成的基因工程抗体,并命名为单域抗体。1993年，Hamers-Casterman等(Nature 1993，363 :446-448)报道了在骆驼血清中大量存在一种天然缺失轻链的抗体，即重链抗体。重链抗体在骆驼的体液免疫中发挥着重要的作用。与一般抗体相比，重链抗体除了缺少轻链之外，重链抗体的重链可变区(variable domain of heavy chain of heavyantibody, VHH)还具有不同于一般抗体VH区的特征，骆驼的VHH基因通过在几个重要功能位点的选择性进化维持了重链抗体的正常功能，也就是说重链抗体的重链可变区(VHH)能够单独折叠形成稳定且完整的抗原结合位点。基于骆驼等动物重链抗体的重链可变区构建的单域抗体具有较好的结构稳定性，而将人源或鼠源抗体的重链可变区进行骆驼化改造后，也可以构建结构较稳定的单域抗体。单域抗体分子虽小，但结构相对稳定，特别是构建自骆驼、鲨鱼等重链抗体的单域抗体。在单域抗体的三个抗原互补决定区(complementarity-determining region, Q)R)中，抗原互补决定区3(CDR3区)在与抗原的结合中发挥主要作用，CDR3的长度变化范围较大，能够形成丰富的构象以参与结合抗原，换一种角度看，也就是说CDR3区能够展示不同长度的肽段，形成各种不同的构象，因此，单域抗体的CDR3应该是一种理想的抗原表位展示部位。基于以上思路，本发明首先预测了人VEGF的抗原表位，然后，利用单域抗体骨架的CDR3区展示该抗原表位，从而构建了一种人VEGF表位疫苗，该疫苗能够诱导机体产生针对人VEGF的抗体，在体内能够抑制肿瘤的生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有潜在医学或药学价值的新型人VEGF表位疫苗，从而实现对肿瘤的主动免疫治疗，解决目前临床上使用的抗人VEGF抗体药物对肿瘤治疗存在的抗体异源性、治疗成本高等不足。为实现上述目的，本发明实施了以下技术方案。本发明提供了一种人VEGF的抗原表位，包含SEQ ID NO : I所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种人VEGF的抗原表位，包含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种人VEGF的抗原表位，包含SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。本发明还提供了一种人VEGF的抗原表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。本发明还提供了一种包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述蛋白利用单域抗体为分子骨架，并将SEQ ID NO :1-3任一所述的人VEGF的抗原表位序列展示于所述单域抗体的CDR3 区。进一步，本发明还提供一种包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述蛋白利用单域抗体为分子骨架，并用SEQ ID NO :1-3任一所述的人VEGF的抗原表位序列替换所述单域抗体的CDR3区。所述的蛋白中所述单域抗体的FR2区的第9、10和12位的氨基酸分别被替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸。本发明还提供一种包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述单域抗体构建自人抗体、骆驼重链抗体或鼠抗体。本发明还提供一种包含有人VEGF抗原表位的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO 5 或 SEQ ID NO 7 或 SEQ ID NO 10 所示的序列。本发明还提供了制备上述蛋白的方法，当单域抗体来源于重链抗体的重链可变区时，所述制备表位疫苗的基本步骤包括(I)确定一种重链抗体的重链可变区的完整的氨基酸序列，以此序列作为单域抗体的氨基酸序列，并分析出其CDR3区的序列；(2)用SEQ ID NO :1_3任一人血管内皮生长因子的抗原表位序列替换所述单域抗体的CDR3区氨基酸序列，并将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将该全长基因序列克隆到表达载体中，得到重组质粒；(3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白即为人VEGF表位疫苗蛋白；当所述单域抗体来源于含轻链抗体和重链抗体的常规抗体的重链可变区时，所述制备表位疫苗的基本步骤包括(I,)确定含轻链和重链的常规抗体的重链可变区的完整氨基酸序列，此序列即为单域抗体的基础氨基酸序列，分析出其框架区2 (FR2)和CDR3区的序列，并将FR2区的第
9、10和12位的氨基酸分别替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸；·(2)用SEQ ID NO :1_3任一人血管内皮生长因子的抗原表位序列替换所述单域抗体的CDR3区氨基酸序列，并将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将该全长基因序列克隆到表达载体中，得到重组质粒；(3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白即为人VEGF表位疫苗蛋白；本发明还提供了一种人VEGF表位疫苗，所述表位疫苗包含上述的蛋白。本发明还提供了上述蛋白在制备用于治疗或预防实体瘤的药物中的用途。尤其是作为疫苗药物的用途。本发明还提供了上述的人VEGF表位疫苗在实体瘤治疗领域的应用。本发明的人VEGF表位疫苗表现出了较好的免疫原性，较好地抑制了肝癌肿瘤的生长，可发展成为一种治疗肝癌等实体瘤的一种主动免疫治疗药物。本发明提供的上述人VEGF表位疫苗克服了合成多肽疫苗免疫原性差的缺点，表现出了较好的免疫原性，避免了目前抗人VEGF抗体类肿瘤治疗药物的异源性和治疗成本高的不足。本发明的人VEGF表位疫苗在肿瘤患者体内诱导产生的抗体是完全人源抗体，与患者本身具有100%生物相容性，并且本发明的人VEGF表位疫苗是可以在大肠杆菌中实现高表达的，生产成本较低，其临床使用量也低，所以，临床治疗成本将较低，这将会克服现有的在CHO等真核细胞中表达的抗体药物生产成本很高、使用量大导致的临床治疗成本居高不下的问题。
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中图I 一种小鼠抗体重链可变区氨基酸序列；* :双划线部分为FR2区，斜体部分为⑶R3区；图2用源于小鼠抗体重链可变区的单域抗体骨架展示“PHQGQ”抗原表位；* :单下划线部分为FR2区，斜体部分为改造后的氨基酸残基；双下划线部分为替换后的包含“PHQGQ”表位的序列；图3展示“PHQGQ”抗原表位的小鼠单域抗体骨架重组蛋白编码基因；* :单下划线部分为酶切位点；
图4展示“PHQGQ”表位的小鼠单域抗体骨架重组蛋白对小鼠的免疫效果；图5用骆驼单域抗体骨架展示“PHQGQHI ”抗原表位；* :双划线部分为展示的抗原表位序列及两侧的附加序列；图6展示“PHQGQHI ”抗原表位的骆驼单域抗体骨架的编码基因；* :下划线部分分别为BamHI和Xho I酶切位点；图7用骆驼单域抗体骨架展示的“PHQGQHI”抗原表位在小鼠体内诱导产生抗人VEGF抗体；图8骆驼化改造的人单域抗体的氨基酸序列；* :双划线部分为框架区2 (FR2)；加框部分为骆驼化改造后的氨基酸；单下划线部分为⑶R3区； 图9人VEGF表位疫苗氨基酸序列；* :双划线部分为人VEGF抗原表位的氨基酸序列；图10人VEGF表位疫苗编码基因序列；* :双下划线部分分别为BamHI和Xho I酶切位点；图IIELISA法检测人VEGF表位疫苗的免疫效果；图12人VEGF表位疫苗免疫血清的中和活性分析；图13人VEGF表位疫苗免疫组和对照组肿瘤重量比较。
具体实施例方式实施例I人VEGF抗原表位的分析、验证蛋白质的抗原表位分析方法一般有合成肽验证法、计算机辅助的程序预测法和基于蛋白质三维结构的分析法，但任何一种方法都存在局限性，其中基于蛋白质三维结构的抗原表位预测准确度最高。目前，一般是联合运用两种或两种以上的分析方法来预测蛋白质的抗原表位，并且最终确定一个抗原表位是否是真正的抗原表位还必须通过实验进行验证。本发明采用计算机辅助的程序预测法和基于蛋白质三维结构的分析法预测最可能的人VEGF抗原表位，然后，通过实验验证该表位是否是真正的抗原表位。首先，用BepiPred(http://www. cbs. dtu. dk/services/BepiPred/)抗原表位预测程序初步分析人VEGF可能的抗原表位，预测候选抗原表位如下表I人VEGF表位预测
1 1起始位置终止位置表位肽段肽段长度~
~ ΠAPMAEGGGQNHΠ
3842EYPDE5
36675LECVPTEESN10
权利要求
1.一种人血管内皮生长因子的抗原表位，其特征在于包含SEQ ID NO=USEQ ID NO:2或SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
2.一种人血管内皮生长因子的抗原表位，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
3.一种包含有人血管内皮生长因子抗原表位的蛋白，其特征在于，所述蛋白利用单域抗体为分子骨架，并将权利要求I或2所述的人血管内皮生长因子的抗原表位展示于所述单域抗体的⑶R3区。
4.根据权利要求3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白利用单域抗体为分子骨架，并用权利要求I或2所述的人血管内皮生长因子的抗原表位替换所述单域抗体的CDR3区。
5.根据权利要求3所述的蛋白，其中所述单域抗体的FR2区的第9、10和12位的氨基酸分别被替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸。
6.根据权利要求3或4或5所述的蛋白，其特征在于所述单域抗体构建自人抗体、骆驼重链抗体或鼠抗体。
7.根据权利要求6所述的蛋白，其特征在于所述蛋白的氨基酸序列包含SEQID NO5或SEQ ID NO :7或SEQ ID NO 10所示的序列。
8.一种制备权利要求3-7任一所述的蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)确定一种重链抗体的重链可变区的完整的氨基酸序列，以此序列作为单域抗体的氨基酸序列，并分析出其CDR3区的序列； 或 (I,)确定含轻链和重链的常规抗体的重链可变区的完整氨基酸序列，此序列即为单域抗体的基础氨基酸序列，分析出其框架区2 (FR2)和CDR3区的序列，并将FR2区的第9、10和12位的氨基酸分别替换为谷氨酸、精氨酸和甘氨酸； (2)用权利要求I或2所述的人血管内皮生长因子的抗原表位序列替换所述单域抗体的CDR3区氨基酸序列，并将替换后的全长氨基酸序列转换为其基因编码序列，合成全长基因序列，并将该全长基因序列克隆到表达载体中，得到重组质粒； (3)将得到的重组质粒转化至相应的宿主细胞内，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白即为权利要求3-7任一所述的包含有人血管内皮生长因子抗原表位的蛋白。
9.一种人血管内皮生长因子表位疫苗,其特征在于,所述表位疫苗包含权利要求3-7任一所述的蛋白。
10.权利要求3-7任一所述的蛋白在制备用于治疗或预防实体瘤的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述的药物为疫苗。
全文摘要
本发明为一种人血管内皮生长因子抗原表位及其表位疫苗，属于生物技术领域。本发明公开了一种人血管内皮生长因子的抗原表位，还公开了一种基于单域抗体骨架构建的人血管内皮生长因子表位疫苗，该表位疫苗能够有效诱导动物产生针对人血管内皮生长因子的抗体，该表位疫苗在动物体内表现出较好的抗肿瘤生长效应，可用于肿瘤等实体瘤药物之用。
文档编号C07K7/08GK102936277SQ201110452570
公开日2013年2月20日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者高建恩, 罗时伟, 钱军 申请人:北京五康新兴科技有限公司