专利名称：血管内皮生长因子时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及血管内皮生长因子的分析检测技术，特别涉及一种血管内皮生长因子时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒。
背景技术：
自1971年Folkman首次提出肿瘤生长依赖血管形成这一假说以来，血管形成的研究得到迅速的发展。现已证实肿瘤细胞能分泌多种血管生长因子，从而诱导局部的新生血管形成。血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)是最有效的血管形成因子之一，对内皮细胞具有特异性分裂能力；VEGF还可通过调节survivin和bcl-2等基因表达抑制肿瘤细胞凋亡，增加肿瘤细胞存活。近年VEGF表达情况的研究表明，肿瘤VEGF的高表达与肿瘤已达晚期或不良预后明显相关。在许多恶性肿瘤中VEGF表达水平已成为一种监测肿瘤复发或患者生存率的预后因素，是一个很有价值的肿瘤标记物(Karayiannakis AJ，Bolanaki H，Syrigos KN，et al.Serumvascular endothelial growth factor levels in pancreatic cancer patients correlatewith advanced and metastatic disease and poor prognosis.Cancer Lett.2003；194(1)119-124)，同时也成为肿瘤治疗重要靶标之一。
目前血清VEGF的检测主要有酶联免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于受示踪剂性状的限制，ELISA的灵敏度不高，检测范围有限，IRMA试剂盒受同位素半衰期的影响，有效期短，临床上只能手工操作，工作量大而且还易产生人为误差，此外还有一定的放射性污染。
而时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)利用具有独特荧光特性的镧系元素，如铕(Eu)、铽(Te)、钐(Sm)、镝(Dy)等及其螯合物为示踪剂，代替酶、同位素、荧光物质、化学发光物质等标记抗体、抗原、源素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，待反应体系完成后，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应物中的荧光强度，定量分析待测物质的含量。由于镧系元素荧光时间极长，为传统荧光的103～106倍。激发光与发射光之间的stokes位移大，可达290nm，而普通荧光素的stokes位移仅28nm，采用波长分辨和时间延迟的方法，可大大提高检测灵敏度和特异性，目前已应用于临床微量物质，如乙肝病毒标记、PSA、AFP等癌胚抗原的定量测定。然而由于TRFIA法是刚刚开发出来的方法，可检测项目不多，许多项目亟待研究开发；而且在研发过程中需解决本方法稳定性、可重复性的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题即是克服上述现有技术的缺陷，提供一种灵敏度和特异性高、且稳定性佳的血管内皮生长因子时间分辨荧光免疫分析方法。
为此，本发明首先进行了抗VEGF抗体的免疫活性测定与筛选。用，即现有的ELISA法进行测定，VEGF纯化抗原包被，HRP标记羊抗鼠二抗作为检测抗体，OPD作为显色剂，分别检测单克隆抗体的免疫活性，结果示JH121和5C3.F8两株单克隆抗体皆可抗原VEGF反应；并用常用的棋盘法，采用下列本发明TRFIA法对两株单克隆抗体JH121和5C3.F8分别交叉包被与标记，反应后取荧光值高且本底低的配对抗体，结果如下表所示
注A为“0”标准品，F为“400pg/ml”标准品。
TRFIA结果显示，用JH121作包被抗体，5C3.F8作为标记抗体效果较好。
因此，本发明一种血管内皮生长因子时间分辨荧光免疫分析方法的技术方案为其包括下列步骤①固相抗体制备将抗血管内皮生长因子单克隆抗体JH121用缓冲液稀释至1～10mg/L作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭；②镧系元素离子标记抗体制备选用抗血管内皮生长因子单克隆抗体5C3.F8用常规方法进行镧系元素离子标记；③测定方法在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔依次加入血管内皮生长因子标准品或待测样品，以及用反应缓冲液以体积比为1∶25～100稀释的步骤②制得的标记抗体，采用平衡法进行荧光检测；其中血管内皮生长因子标准品或待测样品、与稀释的标记抗体之间用量的体积比为1∶3～8。
为取得灵敏度和特异性高、且稳定性佳的更佳效果，本发明用上述棋盘法将不同稀释浓度的包被抗体与标记抗体进行交叉反应，以筛选较佳配对的包被抗体与标记抗体的稀释浓度；且摸索血管内皮生长因子标准品或待测样品、与稀释的标记抗体之间的用量比。其中，如包被液中单克隆抗体的浓度浓度太低，如＜1mg/L，则灵敏度不高，反之，浓度太高，不仅影响结果还增加成本；而标记抗体用反应缓冲液稀释比例，以及血管内皮生长因子标准品或待测样品、与稀释的标记抗体之间用量的体积比例太大太小也有类似结果。
在本发明一最佳实施例中，步骤①的包被液中单克隆抗体的浓度为5mg/L，步骤③中标记抗体用反应缓冲液以体积比为1∶50稀释，该血管内皮生长因子标准品或待测样品、与稀释的标记抗体之间用量的体积比为50∶150。
其中步骤①中的缓冲液选用常规的包被稀释液，即50mmol/L、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液；封闭液选择牛血清白蛋白(BSA)，本发明选用含3g/L牛血清白蛋白的上述缓冲液。
步骤②中的镧系元素离子选用相对常用的Eu3+，其标记常规方法可参照标记试剂盒说明书。
而步骤③中的反应缓冲液为内含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3，pH7.8的50mmol/L Tris-HCl缓冲液。
按常规，步骤③的平衡法包括在加完所用试剂和样品后，将反应板25℃振荡孵育2小时后，用洗涤液洗涤6次。如为Eu3+标记，再加增强液200μl，25℃振荡反应5分钟，进行荧光检测。较佳地，上述步骤③在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成，本发明选用Auto DELFIA1235型全自动TRFIA检测仪。
本发明要解决的另一问题是提供一种相应的血管内皮生长因子时间分辨荧光免疫分析试剂盒。
本发明的试剂盒包括稀释包被抗体的缓冲液、封闭液、稀释标记抗体的反应缓冲液、洗涤液，以及作为包被抗体的抗血管内皮生长因子单克隆抗体JH121、镧系元素离子标记的抗血管内皮生长因子单克隆抗体5C3.F8、和血管内皮生长因子标准品。
血管内皮生长因子标准品为用含0.2％BSA、0.1％NaN3，50mmol/L、pH7.8的Tris-Hcl缓冲液将重组人VEGF蛋白配制成0、1、10、100、200、400pg/ml的系列标准液，可以予以每瓶1ml分装冻干，-20℃干燥保存；其中，该重组人VEGF蛋白按照文献(盛世乐，韩源，黄钢.人血管内皮生长因子的克隆表达及免疫学检测工作标准品的制备.放射免疫学杂志，2004，17(5)395-398.)自制，当然其中的重组人VEGF蛋白也可采用市售产品。
当然，所述镧系元素离子标记的抗血管内皮生长因子单克隆抗体5C3.F8由抗血管内皮生长因子单克隆抗体5C3.F8参照镧系元素离子标记试剂盒说明书制得，故在本发明试剂盒中可包括单独的单克隆抗体5C3.F8和镧系元素离子标记试剂盒，在需要时进行标记。
所述镧系元素离子选用常用的Eu3+，同时还需专用的Eu3+发光增强液。当然，如使用Te等，则可免用增强液。
同样，按照常规，该稀释包被抗体的缓冲液选用50mmol/L、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液；封闭液为含3g/L牛血清白蛋白的上述缓冲液；该稀释标记抗体的反应缓冲液为内含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3，pH7.8的50mmol/L Tris-HCl缓冲液；洗涤液为0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN3，内含14.5mmol/L NaCl的缓冲溶液。
本发明方法适于测量血清VEGF的含量，Eu3+-5C3.F8单抗经标准曲线比较鉴定，免疫反应性基本无损失；10孔重复6组参考标准点的CV均＜10％，批内及批间重复性研究亦证明本方法是可靠的，稳定性佳；试剂盒的线性范围为1pg/ml～1000pg/ml，灵敏度为0.21～0.55pg/ml，准确度高，且与CA19-9，CA125，AFP和CEA等无交叉反应；VEGF-TRFIA的分析时间仅为2小时，且分析系统高度自动化，这样可提高临床检验结果的速度，又可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。
图1为本发明VEGF-TRFIA典型标准曲线及精密度图。
图2为TRFIA Kit和ELISA Kit检测结果比较图。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
其中，下列实施例中的抗VEGF单克隆抗体(克隆号分别为JH121和5C3.F8)及VEGF酶联试剂盒购自晶美生物公司有限公司；96孔微孔板(8×12)为labsystem公司产品；CA199、CA125、CEA、AFP和白蛋白参考标准品购自北京北方生物技术研究所；Eu3+标记盒PE公司产品，PD-10和Sephadex G-50，Amersham产品；Eu3+发光增强液购自上海新波生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯；全自动TRFIA检测仪(Auto DELFIA1235)为Wallac产品。
实施例1试剂盒中包括稀释包被抗体的缓冲液50mmol/L、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液；封闭液含3g/L BSA的上述缓冲液；稀释标记抗体的反应缓冲液pH7.8、50mmol/L的Tris-HCl，内含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3；洗涤液0.2ml/LTween-80和0.2％NaN3，内含14.5mmol/L NaCl的缓冲溶液；以及抗血管内皮生长因子单克隆抗体JH121、5C3.F8；Eu3+标记试剂盒；和血管内皮生长因子标准品。
①固相抗体制备将包被单克隆抗体JH121用稀释包被抗体的缓冲液稀释至5mg/L的包被液，96孔微孔板各孔加200μl，4℃放置过夜；弃去包被液，冲洗三次，加200μl封闭，4℃放置过夜；弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。
②Eu3+标记抗体制备参照Eu3+标记试剂盒说明书操作。具体为取标记抗体5C3.F8 0.4ml，加入Millipore公司的带有滤膜的离心管中用标记缓冲液(pH9.0 50mmol/L Na2CO3-NaHCO3)洗涤数次。收集残留液200μl标记抗体和0.1mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)充分混匀，4℃反应24小时。反应液用Sephadex G-50柱(1×20cm)层析，A280监测收集蛋白峰，合并峰管，定出蛋白含量，同时用PerkinElmer公司Eu3+标准液测定合并峰的Eu3+浓度。所得的标记率(Eu3+mol/IgG mol)是9.24，蛋白回收率为87％。
③测定方法先在包被有单克隆抗体的96孔微孔板上，每孔依次加入50μl VEGF参考标准或待测血清，150μl用反应缓冲液以体积比1∶50稀释的Eu3+标记抗体，25℃振荡孵育2小时后，洗涤6次。再加增强液200μl，25℃振荡反应5分钟，荧光检测。全部过程均在Auto DELFIA1235上自动完成，软件中的参数根据实施例中的条件进行相应设置。
数据分析VEGF-TRFIA标准曲线由origin 7.5软件处理，两组均数比较用t检验。
VEGF-TRFIA性能指标考核VEGF-TRFIA典型标准曲线和各浓度值的变异系数(n＝6)见图1。
1.灵敏度和线性范围以零参考标准品当作样品测量20次，计算其荧光均值及标准差。以该点荧光测定值减减去2倍标准差所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出的浓度值为其灵敏度，经测定本试验灵敏度为0.21pg/ml。将标准品抗原稀释成不同浓度进行测定，测得标准曲线线性范围为1～1000pg/ml。两项指标都优于VEGF-ELISA kit。
2.方法的特异性将CA199、CA125、CEA、AFP、白蛋白当作样品稀释至一定浓度当作样品用本方法进行测定，结果见表2。
表2 VEGF-TrFIA检测特异性
3.精密度将经VEGF ELISA精确定量的三份低、中、高血清，采用本试剂方法进行测定，各设10个复孔。本方法的批内变异系数和批间变异系数均小于10％(见表3)，符合试剂盒规定要求。
表3批内批间变异系数测定结果
4.准确度(回收试验)在测定样品中(19.92pg/ml，SD 0.76)加入已知浓度的高、中、低纯化标准品，通过本实验方法测定在可测范围内其平均回收率为97.0％。
表4 回收试验结果(3×10)
5.健全性把高含量的VEGF血清样品经1∶2～32稀释后用本方法测定，换算后的VEGF含量非常接近；用该系列稀释血清代替VEGF参考标准作标准曲线，其斜率与VEGF的标准曲线斜率基本一致，表明VEGF-TrFIA有良好的健全性。
实施例2将包被单克隆抗体JH121用稀释包被抗体的缓冲液稀释至1mg/L后包被96孔微孔板，然后每孔依次加入25μl VEGF参考标准或待测血清，200μl用反应缓冲液以体积比1∶25稀释的Eu3+标记抗体，余同实施例1。
测定本方法的灵敏度为0.55pg/ml，10孔重复6组参考标准点的CV均＜10％。
实施例3将包被单克隆抗体JH121用稀释包被抗体的缓冲液稀释至10mg/L后包被96孔微孔板，然后每孔依次加入25μl VEGF参考标准或待测血清，150μl用反应缓冲液以体积比1∶100稀释的Eu3+标记抗体，余同实施例1。
测定本方法的灵敏度为0.29pg/ml，10孔重复6组参考标准点的CV均＜10％。
应用实施例1 临床应用采用本发明VEGF-TrFIA检测37例健康体检人员和30直结肠例癌患者的血清样品，其中30例直结肠癌血清标本取自本院普外科手术确诊病人，37例正常对照为近期来本院体检的健康体检者(其中男性20人，年龄20-60岁；女性17人，年龄18-58岁)。结果示健康体检人员为71.5pg/ml±9.1pg/ml，直结肠癌患者为257.3pg/ml±22.1pg/ml，经t检验分析，p＜0.001(见表5)。以100pg/ml为临界值，诊断有效率为74％。上述67例血清用ELISA Kit检测，TrFIA Kit和ELISA Kit检测结果基本相符，相关系数为0.999，p＜0.0001(见图2)。
表5直结肠癌患者血清VEGF测定结果
现有研究表明，结直肠癌、卵巢癌、肾癌、鼻咽癌、肺癌等多种肿瘤患者血清VEGF明显高于健康对照组，血清VEGF水平及阳性率与肿瘤分期、肿瘤组织微血管密度、肿瘤组织VEGF表达水平相关，血清VEGF检测日益受到临床重视。本发明试剂盒的研制成功，为血清VEGF定量分析提供了可靠的保障，必将对临床诊断和治疗产生深远的影响。
权利要求
1.一种血管内皮生长因子时间分辨荧光免疫分析方法，其包括下列步骤①固相抗体制备将抗血管内皮生长因子单克隆抗体JH121用缓冲液稀释至1～10mg/L作为包被液，包被反应板，并用封闭液封闭；②镧系元素离子标记抗体制备选用抗血管内皮生长因子单克隆抗体5C3.F8用常规方法进行镧系元素离子标记；③测定方法在步骤①制得的具有固相抗体的反应板上，每孔依次加入血管内皮生长因子标准品或待测样品，以及用反应缓冲液以体积比为1∶25～100稀释的步骤②制得的标记抗体，采用平衡法进行荧光检测；其中血管内皮生长因子标准品或待测样品，与稀释的标记抗体之间用量的体积比为1∶3～8。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤①中包被液中单克隆抗体的浓度为5mg/L，步骤③中标记抗体用反应缓冲液以体积比为1∶50稀释，该血管内皮生长因子标准品或待测样品与稀释的标记抗体之间用量的体积比为1∶3。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤①中的缓冲液为50mmol/L、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液，封闭液为含3g/L牛血清白蛋白的上述缓冲液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤②中的镧系元素离子为Eu3+。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤③中的反应缓冲液为内含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3，pH7.8的50mmol/L Tris-HCl缓冲液；且该步骤③在时间分辨荧光免疫分析仪器上自动完成。
6.一种血管内皮生长因子时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其包括稀释包被抗体的缓冲液、封闭液、稀释标记抗体的反应缓冲液、洗涤液，以及作为包被抗体的抗血管内皮生长因子单克隆抗体JH121、镧系元素离子标记的抗血管内皮生长因子单克隆抗体5C3.F8、和血管内皮生长因子标准品。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于该血管内皮生长因子标准品为用含0.2％BSA、0.1％NaN3，50mmol/L、pH7.8的Tris-Hcl缓冲液将重组人VEGF蛋白配制成0、1、10、100、200、400pg/ml的系列标准液。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述镧系元素离子标记的抗血管内皮生长因子单克隆抗体5C3.F8由抗血管内皮生长因子单克隆抗体5C3.F8参照镧系元素离子标记试剂盒说明书制得。
9.如权利要求6～8任一项所述的试剂盒，其特征在于所述镧系元素离子为Eu3+，本发明试剂盒还包括Eu3+发光增强液。
10.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于该稀释包被抗体的缓冲液为50mmol/L、pH9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液；封闭液为含3g/L牛血清白蛋白的上述缓冲液；该稀释标记抗体的反应缓冲液为内含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L DTPA、0.1ml/L Tween-80和0.1％NaN3，pH7.8的50mmol/L Tris-HCl缓冲液；洗涤液为0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN3，内含14.5mmol/L NaCl的缓冲溶液。
全文摘要
本发明公开了一种血管内皮生长因子时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒，其选用抗血管内皮生长因子单克隆抗体JH121作为包被抗体，用缓冲液稀释至1～10mg/L作为包被液；选用镧系元素离子标记的抗血管内皮生长因子单克隆抗体5C3.F8作为标记抗体，用反应缓冲液以体积比为1∶25～100稀释；在包被抗体的反应板上，每孔依次加入体积比为1∶3～8的血管内皮生长因子标准品或待测样品、以及稀释的标记抗体，采用平衡法进行荧光检测。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明具有较高的灵敏度、特异度及稳定性；且分析系统高度自动化，可提高临床检验结果的速度，又可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。
文档编号G01N21/64GK1987468SQ200510111900
公开日2007年6月27日 申请日期2005年12月23日 优先权日2005年12月23日
发明者黄钢, 盛世乐, 韩源, 张晨鹏 申请人:上海交通大学医学院附属仁济医院