改造的血管内皮生长因子多肽片段及其应用的制作方法

专利名称：改造的血管内皮生长因子多肽片段及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种改造的血管内皮生长因子多肽 片段及其应用。
技术背景血管生成是正常机体活动所必需的，包括生殖、发育和伤口愈合。虽然 血管生成在正常条件下是一个高度调节的过程，但许多疾病是由持续失调的 血管生成所驱动的，这些疾病统称为血管生成性疾病。例如，眼的新血管化是失明的最常见原因；实体肺瘤的生长和转移有赖于新血管的形成，这包括 起始血管膜的溶解、内皮细胞增殖和迁移以及新血管的形成等多个步骤。血管内皮细胞生长因子(VEGF)为最主要的促血管生成因子，它通过 其受体(VEGFR)介导其活性，通过细胞内信号传导发挥生物学效应。VEGF 与受体VEGFR -2 (KDR)结合能引起内皮细胞的增殖和迁移，在血管生成 中起关键作用，故VEGF/KDR是抑制血管生成的重要靶点。VEGF,65外显子 6编码的短肽VEGF125-136 (氨基酸序列QKRKRKKSRYKS )虽能与VEGF 受体特异性结合，但不激活VEGF受体的酪氨酸激酶活性，从而可竟争拮抗 VEGF的促血管生成作用，所以该类短肽有望成为治疗血管生成性疾病如胂 瘤等的候选药物。放射性核素标记的多肽作为一类新型显像剂已越来越多地应用于肿瘤、 感染、血栓等的诊断和治疗。研究发现，用放射性核素l88Re对多肽 VEGF125-136进行标记，标记物188Re-VEGF125-136可明显聚集于荷瘤鼠的 肿瘤组织，用于肿瘤的SPECT显像及抑制肿瘤生长，但此方法存在以下不足 ①以S-acetyl-MAG3为双功能螯合剂，对VEGF 125-136进行放射性核素188Re标记，标记率只有80%左右，需用HPLC纯化后才能用于肿瘤的显^f象及治疗， 严重限制了其临床及科研应用前景；@188Re-VEGF125-136在肺瘤组织的滞 留时间较短(3h基本消退)，杀伤作用持续时间不长，原因可能是 VEGF125-136与VEGF受体间的亲和力不高。因此，对多肽VEGF125-136 的一级结构进行改造，提高其与VEGF受体的亲和力及放射性核素的标记率， 在制备肿瘤特异显像或治疗药物方面具有广阔的应用前景。 发明内容有鉴于此，为了克服VEGF125-136放射性核素标记物在胂瘤核素显像、 及放射性核素内照射治疗与VEGF125-136抗肿瘤血管生成的双效治疗领域 存在的不足，本发明的目的之一是对VEGF125-136的一级结构进行改造，合 成一种多肽，具有如下氨基酸序列AHKRKRKKRHYK。进一步，所述多肽片段具有与VEGF受体特异性结合并竟争拮抗VEGF 促血管生成的特性。本发明的目的之二在于提供一种改造的血管内皮生长因子多肽片段在制 备抗肿瘤血管生成药物中的应用。本发明的目的之三在于提供一种放射性核素标记物，由改造的血管内皮 生长因子多肽片段经放射性核素进行标记而得到。进一步，所述放射性核素为188&或99Tcm 。本发明的目的之四在于提供所述放射性核素标记物在制备肿瘤核素显像 药物中的应用。本发明的目的之五在于提供一种所述放射性核素标记物在制备放射性核 素内照射治疗的药物中的应用。本发明的目的之六在于提供所述放射性核素标记物的制备方法，包括以 下步骤a. SATA即S-乙酰基巯基乙酰-N-羟基丁二酰亚胺的合成按照摩尔比为1: 1.1的比例将巯基乙酸和乙酸酐在室温下反应4d，反应产物在温度为115-125°C、压力为2-3mmHg的条件下减压蒸馏纯化，制得高纯度 的乙酰化巯基乙酸；取75 mmol乙酰化巯基乙酸与75 mmol NHS即羟基琥珀酰 亚胺酯溶解于150ml二氧杂环乙烷中，与75mmolDCC即二环己基碳二亚胺于 4'C反应16h，过滤去除二环已脲，溶剂经真空冻干后用异丙醇2次重结晶，得 到SATA;b. MAGr多肽复合物的合成采用自动多肽合成仪常规固相法合成目标多肽AHKRKRKKRHYK,并在 多肽合成过程中直接在其N端连接3个甘氨酸，得到肽链 GGGAHKRKRKKRHYK;再在此肽链的N端进行乙酰化巯基乙S吏修饰，即 在最后一个甘氨酸接完后，去保护，加入1倍量的SATA、 7倍量的3mDIEA即 二异丙基乙胺、3倍量的HBTU即苯并三氮唑-N,N，N',N'-四曱基脲六氟磷酸酯及 3倍量的HOBT即1-羟基苯并三唑反应60 min，产物经茚三酮反应4企测为黄色 即可；上述产物用NMP即N-曱基吡咯烷酮、DCM即二氯曱烷交替抽洗6次； 将由lml乙二硫醇，lml苯曱硫醚，0.5g苯酚，0.4mlH2O， O.lml三异丙基硅 烷混合组成的切割液倒入WANG树脂中反应6-9 h，将肽链从树脂上裂解下来 后，抽滤，用乙醚沉淀、离心4次，晾干，纯化得S-acetyl-MAG3-AHKRKRKKRHYK, HPLC鉴定纯度后备用；c. S-acetyl-MAGr多肽的》文射性核素标记将S-acetyl-MAG3-AHKRKRKKRHYK 20吗，放射性核素188Re或99Tcm* 洗液的放射性活度37 MBq，浓度为0.25 mol/L、 pH值为5.2的醋酸铵緩冲液 30 pi, 55jig/fil酒石酸钟钠溶液10 pi, 5吗/jxl SnCl2溶液(临用前用20 mmol/L HC1新鲜配制，含1抗坏血酸)20 pl混合，双蒸水补充总体积至110 调溶液的pH值为4.6,充氮密封，100。C水浴反应60 min，即得188Re或"Tcm 标记的多肽。本发明的有益效果在于本发明对VEGF125-136进行改造得到的多肽，其 与血管内皮细胞(HUVEC)的VEGF受体的亲和力明显高于VEGF125-136,有望发展成为新型有效的抗肿瘤血管生成药物；本发明以S-acetyl-MAG3为双功 能螯合剂，对所述多肽进行放射性核素标记，标记率达95%以上(明显高于 VEGF125-136的80%左右)，且标记物稳定性好，可不需纯化，直接应用，在制 备特异肿瘤显^f象或治疗药物中具有^f艮大的潜力。本发明的其他优点、目标，和特征在某种程度上将在随后的说明书中进 行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言 将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其 他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。


图1为多肽VEGF125-136的188Re标记率的纸层析鉴定图； 图2为多肽AHKRKRKKRHYK的188Re标记率的纸层析鉴定图； 图3为S画acetyl画MAGrVEGF 125-136对125I-VEGF165与HUVEC细胞结合 率的影响；图4为S-acetyl-MAG3-AHKRKRKKRHYK对125I-VEGF165与HUVEC细 胞结合率的影响。
具体实施方式
以下将参照图1、图2、图3、图4，对本发明的优选实施例进行详细的 描述。实施例1(一)多肽的合成与标记 a. SATA即S-乙酰基疏基乙酰-N-羟基丁二酰亚胺的合成 巯基乙酸和乙酸酐(二者摩尔比为1: 1.1 )在室温下反应4d,反应产物在 温度为115-125°C、压力为2-3mmHg的条件下减压蒸馏纯化，制得高纯度的乙 酰化巯基乙酸；取75 mmol乙酰化巯基乙酸与75 mmol NHS即羟基琥珀酰亚胺 酯溶解于150 ml 二氧杂环乙烷中，与75 mmol DCC即二环己基碳二亚胺于4°C 反应16 h，过滤去除二环已脲，溶剂经真空冻干后用异丙醇2次重结晶，得到SATAjb. MAGr多肽复合物的合成采用自动多肽合成仪常规固相法合成目标多肽AHKRKRKKRHYK，并在 多肽合成过程中直接在其N端连接3个甘氨酸，得到肽链 GGGAHKRKRKKRHYK;再在此肽链的N端进行乙酰化巯基乙酸修饰，即 在最后一个甘氨酸接完后，去保护，加入1倍量的SATA、 7倍量的3mDIEA即 二异丙基乙胺、3倍量的HBTU即苯并三氮唑-N，N，N',N'-四曱基脲六氟磷酸酯及 3倍量的HOBT即1-羟基苯并三唑反应60 min，产物经茚三酮反应^r测为黄色 即可；上述产物用NMP即N-曱基吡咯烷酮、DCM即二氯曱烷交替抽洗6次； 将由lml乙二硫醇，lml苯曱硫醚，0.5g苯酚，0.4mlH2O, O.lml三异丙基硅 烷混合组成的切割液倒入WANG树脂中反应6-9 h,将肽链从树脂上裂解下来 后，抽滤，用乙醚沉淀、离心4次，晾干，纯化得S-acetyl-MAG3-AHKRKRKKRHYK,经HPLC鉴定纯度为98%;c. S-acetyl-MAG3-多肽的放射性核素标记将S-acetyl-MAG3-AHKRKRKKRHYK 20昭，放射性核素188Re淋洗液的放 射性活度37 MBq, 0.25 mol/L醋酸铵緩冲液(pH 5.2 ) 30 pl， 55pg/j^酒石酸 钾钠溶液10 [xl， 5 |ag/W SnCl2溶液(临用前用20 mmol/L HC1新鲜配制，含1吗4d 抗坏血酸)20(1l混合，双蒸水补充总体积至llOpl,调pH值为4.6，充氮密封， 100。C水浴反应60 min,即得188Re标记的多肽。 (二)标记物的标记率与稳定性鉴定1、标记率鉴定方法采用纸层析法测定多肽AHKRKRKKRHYK的188Re标记率，同时 作多肽VEGF125-136的188Re标记率的对比实验。纸层析固定相为Whatmann 3MM滤纸；展开剂分别为生理盐水、乙醇-氨水-水(体积比为2: 1: 5)、丙 酮；用SPECT显^象。结果见图1、图2及表1。图1、图2中条带A的展开剂为生理盐水，条带B的展开剂为乙醇-氨水-水(体积比为2: 1: 5)，条带C的展开剂为丙酮。 表1 、标记各组分在Whatmann 3MM纸层析中的Rf值展开剂生理盐水乙醇-氨水-水 (2: 1: 5)丙酮188Re040.8-0.90.81.0^Re-酒石酸1.00.90.0188Re画多肽0.00.80.0188Re -胶体0.00.00.0结论VEGF125-136的188Re标记率约为80%，而AHKRKRKKRHYK的 188Re标记率可达95%以上。 2、稳定性鉴定方法将多肽AHKRKRKKRHYK的188Re标记物于室温中放置，分别于 1、 6、 24h采用纸层析法测定其放化纯度，以鉴定其体外稳定性。同时取多肽 VEGF125-136的188Re标记物作对比实-睑。结果见表2。表2、多肽的188Re标记物稳定性鉴定结果放化纯度(％) 多肽 -lh 6h 24hVEGF125-136 75.0 74.5 73.6AHKRKRKKRHYK 96.8 95.6 95.1结论AHKRKRKKRHYK的188Re标记物与VEGF125-136的188Re标记物 的稳定性无明显差异，在室温下放置24h其放射化学纯度均无明显降低，说明 体外稳定性好。(三)多肽的亲和力测定方法取人永生化的内皮细胞抹EA.hy926，接种于24孔细胞培养板中，104 个/孔，置含5% ( r/r)胎牛血清的DMEM培养基(Hyclone公司提供)，37°C, 5% ( r/PO C02条件下培养12h;于每孔中分别加入0， 0.125， 0.25, 0.5， 1， 2， 10， 20, 40， 80， 160, 320吗多肽(S-acetyl-MAG3-VEGF125-136或S-acetyl-MAG3-AHKRKRKKRHYK )， 4。C静置30 min后分别加入0.1 nmol/L 125I-VEGF165继续 4。C孵育2h,多头细胞分帛器迅速将细胞抽滤至玻璃纤维滤纸上，并迅速用PBS 溶液冲洗3次，每次3ml。 y免疫计数器测量玻璃纤维滤纸的cpm,以多肽质量 的对数为横坐标，1251-VEGF!65的特异结合百分数为纵坐标(以多肽质量为0时， ^I-VEGF,65的特异结合数作为基准，即100%)，分别绘制竟争结合曲线，并计 算IC50。结果见图3、图4，计算得到S-acetyl-MAG3-VEGF125-136与S-acetyl-MAG3-AHKRKRKKRHYK的ICso分别为33.50吗、16.79吗。结论多肽VEGF125-136与AHKRKRKKRHYK均能竟争性抑制VEGF165 与VEGF受体的结合，但多肽AHKRKRKKRHYK与VEGF受体间的亲和力明 显高于VEGF125-136。实施例2本实施例与实施例1的不同之处在于S-acetyl-MAG3-多肽的放射性核素标记步骤中，放射性核素淋洗液为99Tcm 淋洗液，其放射性活度37MBq,经同样方法制得"Tc^标记的多肽，同样可以 达到发明目的。尽管通过参照本发明的某些优选实施例，已经对本发明进行了描述，但 本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样 的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。序 列 表<110>中国人民解;^丈军第三军医大学第一附属医院<120>改造的血管内皮生长因子多肽片段及其应用<160> 1<210> 1<211> 12<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述多肽 <400〉 1Ala His Lys Arg Lys Arg Lys Lys Arg His Tyr Lys 1 5 10
权利要求
1、改造的血管内皮生长因子多肽片段，其特征在于具有如下氨基酸序列AHKRKRKKRHYK。
2、 根据权利要求1所述的改造的血管内皮生长因子多肽片段，其特征在于 所述多肽片段具有与VEGF受体特异性结合并竟争拮抗VEGF促血管生成的特 性。
3、 权利要求1或2所述的改造的血管内皮生长因子多肽片段在制备抗肿瘤 血管生成药物中的应用。
4、 放射性核素标记物，由权利要求1所述的改造的血管内皮生长因子多肽 片段经放射性核素进行标记而得到。
5、 根据权利要求4所述的放射性核素标记物，其特征在于所述放射性核 素为哪Re或"Tc"1。
6、 权利要求4所述的放射性核素标记物在制备肿瘤核素显像药物中的应用。
7、 权利要求4所述的放射性核素标记物在制备放射性核素内照射治疗的药 物中的应用。
8、 权利要求4所述放射性核素标记物的制备方法，包括以下步骤a. SATA即S-乙酰基巯基乙酰-N-羟基丁二酰亚胺的合成 按照摩尔比为1: 1.1的巯基乙酸和乙酸肝在室温下反应4d，反应产物在温度为115-125°C、压力为2-3mmHg的条件下减压蒸馏纯化，制得高纯度的乙酰 化巯基乙酸；取75 mmol乙酰化巯基乙酸与75 mmol NHS即羟基琥珀酰亚胺酯 溶解于150 ml 二氧杂环乙烷中，与75 mmol DCC即二环己基碳二亚胺于4。C反 应16 h,过滤去除二环已脲，溶剂经真空冻干后用异丙醇2次重结晶，得到SATA;b. S-acetyl-MAG3-多肽复合物的合成采用自动多肽合成4义常规固相法合成目标多肽AHKRKRKKRHYK ，并在 多肽合成过程中直接在其N端连接3个甘氨酸，得到肽链GGGAHKRKRKKRHYK;再在此肽链的N端进行乙酰化巯基乙酸修饰，即 在最后一个甘氨酸接完后，去保护，加入1倍量的SATA、 7倍量的3mDIEA即 二异丙基乙胺、3倍量的HBTU即苯并三氮唑-N,N，N'，N'-四曱基脲六氟磷酸酯及 3倍量的HOBT即1-羟基苯并三唑反应60 min，产物经茚三酮反应4企测为黄色 即可；上述产物用NMP即N-曱基吡咯烷酮、DCM即二氯曱烷交替抽洗6次； 将由lml乙二硫醇，lml苯曱硫醚，0.5g苯酚，0.4mlH2O， O.lml三异丙基硅 烷混合组成的切割液倒入WANG树脂中反应6-9 h，将肽链从树脂上裂解下来 后，抽滤，用乙醚沉淀、离心4次，晾千，纯化得S-acetyl-MAGr AHKRKRKKRHYK， HPLC鉴定纯度后备用； c. S-acetyl-MAGr多肽的》文射性核素标记将S-acetyl-MAG3-AHKRKRKKRHYK 20吗，放射性核素188Re或991^淋 洗液的放射性活度37 MBq，浓度为0.25 mol/L、 pH值为5.2的醋酸铵緩沖液 30 ul， 55昭4d酒石酸钾钠溶液10 fxl， 5吗/pl SnCl2溶液(临用前用20 mmol/L HC1新鲜配制，含1 [ig/^il抗坏血酸)20 pl混合，双蒸水补充总体积至110 pl， 调溶液的pH值为4.6，充氮密封，100。C水浴反应60 min，即得188Re或"Tcm 标记的多肽。
全文摘要
本发明公开了一种改造的血管内皮生长因子多肽片段及其应用，该多肽氨基酸序列为AHKRKRKKRHYK，通过与VEGF受体特异结合而竞争拮抗VEGF的促血管生成作用，用于制备抗肿瘤血管生成药物；并可进一步制得放射性核素标记物，用于制备肿瘤核素显像药物、放射性核素内照射治疗药物；本发明多肽与VEGF受体的亲和力明显高于VEGF125-136；以S-acetyl-MAG₃为双功能螯合剂，对多肽进行放射性核素标记，标记率达95％以上，标记物稳定性好，可不需纯化，直接应用。
文档编号C07K7/00GK101260147SQ200810069448
公开日2008年9月10日 申请日期2008年3月10日 优先权日2008年3月10日
发明者刘广元, 秦浙学, 黄定德 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院