专利名称：L－丝氨酸在制备治疗脑缺血的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及L-丝氨酸的新医药用途。
背景技术：
脑血管病是由各种血管源性脑病变引起的脑功能障碍，脑卒中(又称中风)是急性脑循环障碍迅速导致局限性或弥漫性脑功能缺损的临床事件。脑卒中包括缺血性和出血性卒中，前者占70％。其主要特征是病变血管支配区局灶性神经功能缺损，如意识障碍、偏瘫、偏盲、偏身感觉障碍及失语等。据资料统计，我国脑卒中发病率为120～180/10万人，每年新发卒中大于150万人，脑卒中死亡率世界第二位(死亡率80～120/10万人)，由此，每年因脑卒中死亡人数约120万。如此高的脑卒中发病率、死亡率及其相当惊人的医疗费，给社会和家庭造成了沉重的负担。针对缺血性脑卒中，目前除溶栓治疗有肯定的疗效外，神经保护药物一直未能显示确定的临床效果。因此，缺血性卒中防治方面的研究极需创新性研究思路与研究方法。
研究表明，脑缺血后，在缺血缺氧性脑损伤发生发展的级联反应过程中，神经元和胶质细胞大量释放谷氨酸等兴奋性氨基酸，而重摄取减少，细胞外间隙谷氨酸堆积，兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸比例大大增加，激活兴奋性氨基酸受体，引起兴奋性神经毒性被认为是极其关键的机制，并且与其它机制如胞内钙超载、自由基及一氧化氮生成增加等相关联，最后引起急性或迟发性神经元死亡，损伤脑组织。脑缺血后治疗的成功与否，取决于能否及时建立再灌注和有效地保护神经元免受缺血缺氧损伤，神经保护剂和溶栓治疗的联合应用，被认为是一条较为合理的解决方法。神经保护剂能提高神经细胞对缺血缺氧的耐受性，延长溶栓治疗时间窗，为有效建立再灌注争取时间，还能阻止或减轻溶栓治疗带来的再灌注损伤。即使对于丧失溶栓治疗时机的病人，使用神经保护剂，还可保护缺血半影区内的神经元，抑制迟发性神经元死亡。拮抗或抑制谷氨酸的兴奋性神经毒性以保护脑组织成为这方面治疗的一个重要切入点。然而，目前兴奋性氨基酸受体阻断剂或释放抑制剂对缺血脑损伤的治疗效果并不理想，一是治疗时间窗窄，二是潜在的神经精神方面的副作用较大。我们从全新的角度入手，激动脑内抑制性氨基酸-甘氨酸受体，降低神经元的兴奋性，抑制谷氨酸对神经元的兴奋性毒性，从而起到保护大脑、抗缺血缺氧性脑损伤的作用，以治疗缺血性中风等引起缺血缺氧性脑损伤的一些疾病。有研究报道激动γ-氨基丁酸(GABA)受体，在整体动物模型上能抑制兴奋性神经毒性，并对缺血大脑有很好的保护作用。
中枢神经系统内存在γ-氨基丁酸能和甘氨酸(Gly)两类抑制性神经递质系统。通常认为GABA递质系统在脑内发挥主要作用，而Gly能递质系统主要在脊髓内发挥作用(徐天乐。中枢甘氨酸受体分子特性的研究。生理科学进展，2000，31(4)373-380)。然而，近年来的研究表明，脑内不仅存在一些Gly能神经元，Gly受体的分布更是非常广泛。现有的研究资料显示从脑干到大脑皮质多处(如中脑腹侧被盖区、下丘脑、海马、纹状体、伏核、杏仁核、大脑皮质)有功能性Gly受体的分布。因此，Gly能抑制性神经递质系统、Gly受体及配体在脑内的作用越来越受到人们的关注。研究表明，在脑内成熟的神经元，使用Gly可引起神经元膜的超极化。这样即会降低神经元的兴奋性，并且阻止NMDA受体通道中Mg2+的移出，抑制其通道的开放，抑制谷氨酸对神经元的兴奋作用。脑缺血时使用，可望抑制谷氨酸等兴奋性氨基酸对神经元的兴奋性毒性，起到脑神经保护作用。
根据这一设想，我们研究比较了甘氨酸(Glycine)、牛磺酸(Taurine)、β-丙氨酸(β-alanine)、L-丝氨酸(L-serine)、L-α-丙氨酸(L-α-alanine)等五种甘氨酸受体激动剂对大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。在五种甘氨酸受体激动剂中，L-serine的抗缺血脑损伤效果最佳；其对实验性脑缺血再灌注损伤的保护作用具有剂量依赖性；L-serine的作用可能与激活脑内的甘氨酸受体，抑制缺血损伤后神经元的兴奋性毒性，阻止神经元的凋亡及坏死有关。
在急性缺血性脑卒中的治疗中，采用药物或干预措施干扰缺血瀑布反应的各个环节、延长神经元存活称为神经保护。急性缺血导致细胞能量代谢障碍，并导致一系列缺血瀑布反应，包括神经细胞膜去极化，兴奋性氨基酸释放增加，钙离子通过NMDA/AMPA受体、代谢性谷氨酸受体和电压依赖性钙通道等大量进入细胞内，激活蛋白酶、脂酶、各种激酶、核酸酶和一氧化氮(NO)合酶，自由基生成增加，破坏细胞的正常结构和功能。同时，再灌注伴随的炎症反应、白细胞的粘附和浸入、细胞因子作用等将进一步加剧缺血后的脑组织损害。上述过程不仅引起神经元的急性变性坏死，还启动细胞凋亡过程，引起迟发性神经元死亡。正因为其病理生理机制极为复杂，因此治疗难度极大。迄今报道已有50多种神经保护药物在缺血性卒中患者中进行了临床试验，但却没有一种药物取得令人满意的疗效。神经保护剂临床试验失败的原因众多，目前认为主要原因有不良反应重；研究类型、样本大小和观察指标不恰当；治疗剂量和疗程不合适；药代动力学和药效动力学不佳；治疗时间窗狭窄等。
与大量的外源性药物相比，近年来一些内源性化合物如白蛋白、胞二磷胆碱，促红细胞生成素等在预试验中取得了一定的效果，引起研究者广泛关注和深层次的思考。一方面这些内源性物质，机体在正常情况下就可产生，外源性使用一般不至于产生严重的不良反应；另一方面，在急性缺血损伤的情况下，这些物质会反应性释放增加，这可能是机体缺血应激状态下被迫进行的一种自我保护机制。
L-丝氨酸虽属于非必需氨基酸，但具有许多重要的生理功能和作用，因此，在医药、食品、化妆品中均有较为广泛的应用。但迄今为止没有在针对脑缺血方面应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种L-丝氨酸的新医药用途，是L-丝氨酸在制备治疗脑缺血的药物中的应用L-丝氨酸的制剂类型包括特别注射剂或输液制剂、包括缓释或控释药物制剂，包括肠腔给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂。
我们进行了后述有关L-丝氨酸抗脑缺血/再灌注损伤和神经组织损伤的实验研究，证实了L-丝氨酸具有明确的抗脑缺血损伤和神经组织损伤的作用，为其作为一种新型抗中枢神经系统损伤药物及其临床应用提供了较完整的实验依据。
对于L-丝氨酸抗脑缺血作用，通过大鼠局灶性脑缺血模型，得到以下结论I.五种甘氨酸受体激动剂中，除牛磺酸外，L-丝氨酸可明显改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤引起的神经行为障碍，减少脑梗死体积。
II.MRI动态观察L-丝氨酸对缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响，表明L-丝氨酸可持续发挥脑缺血保护作用。
III.L-丝氨酸降低缺血引起的脑组织水肿和血脑屏障(BBB)的破坏L-丝氨酸可明显降低缺血半球的脑水含量，同时L-丝氨酸可明显降低皮质、皮质下结构和半球的BBB的破坏。
IV.L-丝氨酸的作用随剂量增加而增强，168mg.kg-1.12h-1时效果接近饱和。
V.L-丝氨酸可减少脑缺血再灌注后海马CA1区锥体细胞的变性坏死与丢失；免疫组化、Western-blot提示L-丝氨酸可抑制脑缺血损伤后凋亡相关基因(Caspase-3)的表达。
本发明的优点通过实验证明，L-丝氨酸抗缺血脑损伤效果最佳；其对实验性脑缺血再灌注损伤的保护作用具有剂量依赖性；L-丝氨酸的作用可能与激活脑内的甘氨酸受体，抑制缺血损伤后神经元的兴奋性毒性，阻止神经元的凋亡及坏死有关。至此L-丝氨酸适用于制成药物制剂，可制成缓释或控释药物制剂；可制成腔肠给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂；可制成注射制剂或输液制剂；也可与其它药物组成复方药物制剂。以上药物制剂有明确的神经保护作用，可用于制成治疗各种神经退化或损伤性疾病的药物制剂，例如用于中风性脑损伤、老年痴呆和多种硬化症等的治疗。
根据这一设想，我们研究比较了甘氨酸(Glycine)、牛磺酸(Taurine)、β-丙氨酸(β-alanine)、L-丝氨酸(L-serine)、L-α-丙氨酸(L-α-alanine)等五种甘氨酸受体激动剂对大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。在五种甘氨酸受体激动剂中，L-serine的抗缺血脑损伤效果最佳；其对实验性脑缺血再灌注损伤的保护作用具有剂量依赖性；L-serine的作用可能与激活脑内的甘氨酸受体，抑制缺血损伤后神经元的兴奋性毒性，阻止神经元的凋亡及坏死有关。
研究证明，激动甘氨酸受体的五种抑制性氨基酸具有不同程度的抗缺血脑损伤作用，其中以L-serine的作用最佳。局灶性脑缺血再灌注后，使用L-serine治疗，可以明显缩小大鼠的脑梗死体积，改善神经行为学症状，抑制脑水肿的形成，阻止缺血损伤后神经元的变性、坏死及神经元凋亡。L-serine的这种神经保护作用可被甘氨酸受体阻断剂士的宁所抑制，说明L-serine的作用确实是通过激动脑内甘氨酸受体而实现的。
L-serine抗脑缺血再灌注损伤的可能机制是提高脑内抑制性氨基酸浓度，逆转脑缺血时兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸比例失调，激动甘氨酸受体，降低神经元的兴奋性，抑制谷氨酸对神经元的兴奋性毒性，减少缺血半暗区Caspase-3的表达，减少神经元的急性坏死和迟发性死亡，从而减轻缺血再灌注带来的损伤，保护脑组织。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是验正本发明的实验中缺血2h再灌注24h各组大鼠脑片TTC染色例图。
注梗死区坏死组织呈苍白色，而正常脑组织呈红色，梗死区域与大脑中动脉支配的脑区基本一致，主要位于皮质及纹状体区。L-丝氨酸组、牛磺酸组各层面脑片较其它处理组相比，梗死区域显得较小。a假手术组；b牛磺酸组；cL-丝氨酸组；d甘氨酸组；eL-α-丙氨酸组；fβ-丙氨酸组；g脑缺血对照组。
图2是缺血脑梗死典型MRI改变示图注在MCAO(大脑中动脉栓塞)后2小时，DWI(Diffusionweightedimaging，弥散加权像)上就可以反映出缺血部位高密度信号，此时L-丝氨酸组(L-ser)与对照组(Vehicle)的脑梗死体积并没有明显差别；但在MCAO后5小时，可观测到L-丝氨酸组脑梗死体积较对照组相比明显减少。在MCAO后2小时，T2WI(T2Weighted imaging，T2加权像)上并没有明显的信号改变；5小时，可见缺血部位的高密度信号，此时L-丝氨酸组脑梗死体积明显较对照组缩小；在MCAO后24、48小时，对照组脑梗死体积持续增加，而L-丝氨酸组可持续发挥脑缺血保护作用，脑梗死体积维持不变。
图3是缺血2h再灌注24h各组大鼠尼氏染色图注A对照组双侧海马，图片右侧为缺血区；BL-丝氨酸组双侧区海马，图片右侧为缺血区，；C假手术组(sham-operated)双侧区海马；D对照组缺血侧海马CA1区；EL-丝氨酸组缺血侧海马CA1区；F假手术组缺血侧海马CA1区；G对照组缺血侧皮质；HL-丝氨酸组组缺血侧皮质；I假手术组缺血侧皮质。除假手术组外，尼氏染色显示对照组、L-丝氨酸组大鼠缺血侧大脑半球不同程度的着色变淡，纹状体、海马及大脑皮层部神经元缩小变形，可见核溶解、核碎裂、核固缩，缺血周边区受损神经元呈现细胞肿胀，尼氏体消失等神经元变性的特征(图3)。对照组缺血侧海马组织有明显损伤，主要表现在CA1、CA2区大量锥体细胞缺失，残留的锥体细胞排列松散不规则，多数细胞胞核固缩，核仁欠清晰，尼氏小体减少或消失(图3A、D)；缺血侧皮质部着色明显变淡，神经元缩小变形，可见核溶解、核碎裂、核固缩，尼氏体消失等神经元变性的特征(图3G)。L-丝氨酸组缺血侧海马锥体细胞排列比较整齐致密，胞核饱满，核仁较清晰，仅有少量散在的CA1区锥体细胞缺失或胞核固缩(图3B、E)；缺血侧皮质部神经元形态基本完整，胞核较饱满，核仁清晰，尼氏小体丰富(图3H)。假手术组海马组织无明显损伤，CA1区锥体细胞核大而圆，核仁明显，可见浅染的突起，锥体细胞2-3层，排列整齐致密，形态完整，尼氏小体丰富(图3C、F)；皮质部神经元形态无明显异常，排列较紧密，胞核饱满，核仁清晰(图3I)。
图4是大鼠Caspase-3免疫组化图注A顶叶皮层缺血半暗带区，方框区域为选择计数Caspase-3阳性细胞区域；BL-丝氨酸组，有少量的Caspase-3阳性细胞位于正常神经元之间；C对照组，可见大量的Caspase-3阳性细胞，有少量的正常神经元；D假手术组，多见正常神经元，偶见Caspase-3阳性细胞。黑色箭头所指为正常神经元，红色箭头所指为Caspase-3阳性细胞。
图5是大鼠Caspase-3 Western-bolt分析图注β-actin作为内参，在各组中有较均一的表达。各实验处理组Caspase-3条带深浅不一，对照组中Caspase-3的表达明显；L-丝氨酸组中则表达明显下调；假手术组(sham)中，Caspase-3基本未见表达。
具体实施例方式一种L-丝氨酸在制备治疗脑缺血的药物中的应用。
具体验正实验一、实验材料和方法1材料1.1实验动物健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清洁级，体重240-260g，南通大学实验动物中心提供。
1.2主要试剂与溶液牛磺酸(Taurine)粉剂购自Sigma-Aldrich；甘氨酸国药集团化学试剂有限公司；L-丝氨酸中国医药(集团)上海化学试剂公司；β-丙氨酸Sigma公司(美国)；L-α-丙氨酸中国医药(集团)上海化学试剂公司；红四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium，TTC)粉剂购自上海灵锦精细化工有限公司；抗β-actin单克隆抗体购自Sigma公司；Cleaved Caspase-3(Asp175)兔抗鼠单克隆抗体购自CellSignaling公司；二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司SP免疫组化染色试剂盒。
2方法2.1模型制备参照Longa EZ方法并稍作改良的大脑中动脉线栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。尼龙线插入深度平均为18.5±0.5mm(从ECA分叉处算起)。结扎固定尼龙线，缝合皮肤，栓线外留1cm线头。2h后再灌注，勿需再次麻醉和切开颈部，提拉栓线至有阻力时表明尼龙线头端已达到ICA分叉切口处，血流再通。假手术组栓线只插入10cm，其余步骤同模型组。动物苏醒后出现血管栓塞的同侧Hornor征和对侧肢体运动障碍即为模型成功。
2.2神经行为学评分参考Zea Longa 6分制评分。评分标淮0分无神经损伤症状；1分不能完全伸展对侧前爪；2分向外侧转圈；3分向对侧倾倒；4分不能自发行走，意识丧失；5分死亡。
2.3脑梗死灶测量大鼠迅速取脑，去除嗅脑、小脑和低位脑干，冰冻10min，从额极到枕极作2mm厚度的连续额状切片，切片置0.5％TTC溶液中，于37℃避光孵育30分钟，间隔5分钟摇动切片。再将切片置于4％多聚甲醛缓冲液中固定。24h后拍照并输入计算机，用Image J&Scion Image图像处理软件计算梗死面积(粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区)，梗死面积＝非缺血侧半球面积-缺血侧半球未梗死区面积，各脑片梗死面积之和乘以厚度(2mm)为总的梗死体积，脑梗死灶体积与全脑体积比为脑梗死体积百分比。
2.4脑含水量测定缺血2h再灌注24h后，将大鼠迅速断头取脑，用干湿法测脑组织含水率，在冰块上迅速取脑，将取出的脑组织放在一个内有生理盐水湿润的定性滤纸的培养皿中，以防水分蒸发，同时快速去掉脑皮质表面的软脑膜和凝血块。用分析天秤准确称取两个半球的重量，然后置于100℃烤箱24小时后，再次称重，以〔(湿重-干重)/湿重〕×100％即为相对含水量。
2.5血脑屏障通透率缺血2h再灌注22h，经大鼠尾静脉注射2％伊文氏蓝(evans blue，EB)生理盐水液(3ml/Kg)，循环2h后，将大鼠过度麻醉后，经心脏快速灌注生理盐水直至右心房流出的液体无色为止，迅速断头取脑。从额极到枕极作2mm厚度的连续横断面切片，并将脑组织分为损伤侧皮质、皮质下和健侧皮质、皮质下4部分，在分析天平上称重后置入50％三氯乙酸溶液中。匀浆和离心(10000r/min，20min)，取上清液按1∶2的比例用乙醇稀释后，采用岛津UV-2450型紫外分光光度仪在λ＝620nm处比色，根据标准曲线得出脑组织中EB的含量，以每克湿重脑组织内所含EB的量(μg)表示。
2.6 MRI检查采用美国GE Healthcare 3.0T核磁共振机和肩关节正交线圈行MRI检查。大鼠麻醉后，俯卧位，头置于线圈中央，自主呼吸。除假手术组外，各组随机抽取4只大鼠连续测定缺血再灌注后2h、5h(DWI，T2WI)；24h、48h(T2WI)的缺血梗死灶的动态变化。T2WI和DWI上的梗死体积测定方法参照采用Heiland等描述，使用Image-Pro Plus 5.1图像分析软件，梗死体积＝梗死面积×(层厚+间距)。
2.7数据处理及统计分析所有数据用均数±标准误表示(x±SE)，采用Stata 8.0统计软件处理数据。两组间比较采用t检验，组间差异采用成组设计的方差分析，两两比较用Scheffé法。
二、结果1五种甘氨酸受体激动剂抗局灶性脑缺血再灌注损伤的疗效评价(药物筛选)1.1神经行为学评分假手术组(Sham)动物无神经功能缺损，其它各组均有不同程度的神经功能缺损分值。缺血2h再灌注24h后，Taurine(牛磺酸)组(Tau)、L-serine组(L-ser)与对照组(Veh)神经行为学评分具有显著性差异(p＜0.01)；Glycine组(Gly)与对照组差异亦有统计学意义(p＜0.05)；而L-α-alanine组(L-α-Ala)、β-alanine组(β-Ala)与对照组间无显著性差异(p＞0.05)。说明Taurine、L-serine和Glycine能明显改善大鼠的神经功能，似以L-serine的作用最佳。而L-α-alanine、β-alanine不能改善大鼠神经功能(参见表1)。
表1五种甘氨酸受体激动剂对神经功能学评分的影响。
注与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
1.2脑梗死体积的测定缺血2h再灌注24h后，行TTC染色，梗死区内坏死组织呈苍白色，未坏死组织呈红色。观测发现梗死区域与MCA支配的脑区基本一致，与对照组相比，各药物组脑梗死体积及梗死百分体积均有所缩小，以L-serine作用最显著，其次为Taurine(p＜0.05)；其它治疗组与对照组的差别无显著性意义(p＞0.05，表2、图1)。
表2 五种甘氨酸受体激动剂对脑梗死体积的影响
注与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
2对L-serine药效与药理作用的深入研究2.1对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织含水量的影响表3显示，与对照组相比，L-serine治疗组脑含水量明显降低，差别具有统计学意义(p＜0.05)，表明L-serine能抑制脑缺血再灌注损伤后脑水肿的形成。
表3 L-serine对大鼠脑含水量的影响
注与对照组比较，*p＜0.05；**p＜0.01。
2.2 L-serine对血脑屏障破坏的影响结果见表4。从结果看，缺血后应用L-serine可降低缺血所引起的血脑屏障破坏，尤以减少皮质区血脑屏障破坏为主(L-serine组皮质区EB含量较缺血对照组相比明显减少，差别具有统计学意义)；L-serine组皮质下区EB含量虽也所减少，但与对照组相比，尚无统计学意义。
表4 L-serine对缺血引起的血脑屏障破坏的影响
注与对照组比较，**p＜0.01；△p＞0.05。
2.3 MRI(核磁共振)动态观察L-serine对缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响在MCAO后2小时，DWI上就可以反映出缺血部位高密度信号，此时测得L-serine组与对照组的脑梗死体积并没有明显差别；但在MCAO后5小时，可观测到L-serine组脑梗死体积较对照组相比明显减少(p＜0.05)。在MCAO后2小时，T2WI上并没有明显的信号改变；5小时，可见缺血部位的高密度信号，此时L-serine组脑梗死体积较之前有所减少，较对照组相比，差别有统计学意义(p＜0.05)；在MCAO后24、48小时，对照组脑梗死体积持续增加，而L-serine组可持续发挥脑缺血保护作用，与对照组相比差别均有显著性统计学意义(p＜0.01)(图2，表5)。
表5 L-serine对缺血后脑梗死体积的影响
注与对照组比较，*p＜0.05；**p＜0.01。
2.4 L-serine抗局灶性脑缺血再灌注损伤的有效剂量范围2.4.1神经行为学评分缺血2h再灌注24h后，L-serine 56mg.kg-1.12h-1剂量组神经行为学评分较对照组有所降低，但无显著性意义(p＞0.05)；168mg.kg-1.12h-1组、504mg.kg-1.12h-1组与对照组相比，神经行为学评分显著降低，差别都具有统计学意义(p＜0.01)，但这两个剂量组之间无明显差异。说明168、504mg.kg-1.12h-1剂量的L-serine能明显改善大鼠的神经功能，并且这种作用具有剂量依赖关系，即低于56mg将不产生明显作用，而高于504mg则作用趋于饱和(参见表6)。
表6不同剂量L-ser对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经功能学评分影响。
注与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
2.4.2脑梗死体积缺血2h再灌注24h后，56mg.kg-1.12h-1剂量组TTC法测得的脑梗死体积较对照组有所降低，但差别无统计学意义(p＞0.05)，这与神经行为学评分结果一致；168mg.kg-1.12h-1组、504mg.kg-1.12h-1组与对照组相比，脑梗死体积显著降低，差异具有统计学意义(p＜0.05)，但这两个剂量组之间无明显差异。说明L-serine 168、504mg.kg-1.12h-1两个剂量能明显减少局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑梗死体积，且效果相似；但剂量在56mg.kg-1.12h-1时，还未显示出显著减少脑梗死体积的能力。提示L-serine减少大鼠脑缺血后梗死体积形成的作用存在着剂量依赖关系，至504mg.kg-1.12h-1剂量时效应已达饱和程度(参见表7)。
表7不同剂量L-ser对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积百分比的影响。
注与对照组相比，*p＜0.05。
2.5组织形态学观察(尼氏染色)2.5.1对神经元数目的影响对照组海马CA1区锥体细胞稀疏，有片状缺失，有的细胞旁有空染区，可见核固缩，胞质浓染，胞体变小的细胞；细胞层次不清楚，神经元密度明显降低。L-serine组海马组织学特征与假手术组相似，神经元密度较对照组相比显著增加，差别具有统计学意义(p＜0.01)，表明L-serine组可部分阻止大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤造成的神经元缺失(结果见表8，图3)。
表8海马CA1区锥体层细胞密度
注与其它两组比较，**p＜0.012.5.2对神经元形态的影响大鼠右侧MCAO2h、再灌注24h后，行尼氏染色。除假手术组外，尼氏染色显示对照组、牛磺酸治疗组大鼠缺血侧大脑半球不同程度的着色变淡，纹状体、海马及大脑皮层部神经元缩小变形，可见核溶解、核碎裂、核固缩，缺血周边区受损神经元呈现细胞肿胀，尼氏体消失等神经元变性的特征。对照组缺血侧海马组织有明显损伤，主要表现在CA1、CA2区大量锥体细胞缺失，残留的锥体细胞排列松散不规则，多数细胞胞核固缩，核仁欠清晰，尼氏小体减少或消失；缺血侧皮质部着色明显变淡，神经元缩小变形，可见核溶解、核碎裂、核固缩，尼氏体消失等神经元变性的特征。L-serine组缺血侧海马锥体细胞排列比较整齐致密，胞核饱满，核仁较清晰，仅有少量散在的CA1区锥体细胞缺失或胞核固缩；缺血侧皮质部神经元形态基本完整，胞核较饱满，核仁清晰，尼氏小体丰富。假手术组海马组织无明显损伤，CA1区锥体细胞核大而圆，核仁明显，可见浅染的突起，锥体细胞2-3层，排列整齐致密，形态完整，尼氏小体丰富；皮质部神经元形态无明显异常，排列较紧密，胞核饱满，核仁清晰(如图3所示)。
2.6凋亡相关基因Caspase-3(活化型)的表达2.6.1免疫组化检测每例动物取连续的6张切片，在10×40倍光镜下记数顶叶皮层缺血半暗带区Caspase-3阳性细胞数，取其平均值为每只的阳性细胞数。对照组Caspase-3阳性细胞数较多，仅有少量的正常神经元；L-serine治疗组阳性细胞数较对照组明显减少(p＜0.01，表9，图4)，较少量的阳性细胞位于正常神经元之间。本实验提示L-serine可使凋亡相关基因Caspase-3表达明显下调，说明L-serine可以部分抑制脑缺血半暗带区神经元凋亡，减少神经元迟发性死亡，从而发挥脑缺血保护作用。
表9高倍镜下皮层缺血半暗带区Caspase-3阳性细胞数
注与其它两组比较，**p＜0.012.6.2 Western-blot分析β-actin作为内参，在各组中有较均一的表达。各实验处理组Caspase-3条带深浅不一，对照组中Caspase-3的表达明显；L-serine组中则表达明显下调；假手术组中，Caspase-3(半胱氨酸天冬氨酸酶)基本未见表达。经凝胶图像分析系统扫描，用四星图像处理系统测定各组Caspase-3表达量与内参表达量(β-actin)的比值，数据以x±SE表示。L-serine组与对照组相比，差别具有显著性统计学意义(p＜0.01，表10，图5)。进一步说明L-serine可抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤所诱导的凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。
表10Caspase-3表达量化图
注与对照组比较，**p＜0.0权利要求
1.一种L-丝氨酸在制备治疗脑缺血的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种L－丝氨酸在制备治疗脑缺血的药物中的应用。L－丝氨酸治疗脑缺血效果佳，适用于制成药物制剂，可制成缓释或控释药物制剂；可制成腔肠给药、喷雾给药、透皮吸收或口服的药物制剂；可制成注射制剂或输液制剂；也可与其它药物组成复方药物制剂。
文档编号A61P9/10GK101049295SQ20071002205
公开日2007年10月10日 申请日期2007年4月28日 优先权日2007年4月28日
发明者姜正林, 王国华 申请人:南通大学