专利名称：一种抗心肌肥大药物筛选模型及其构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物筛选模型，具体地说，涉及一种基于新基因MR-I的抗心肌肥大药物筛选模型及其构建和应用。
背景技术：
心血管系统疾病是当今世界的头号杀手之一，每年心血管系统疾病死亡率达到 1670万人。心肌肥厚是高血压、瓣膜病等临床常见心血管疾病的重要靶器官损害表现之一， 是心血管疾病的独立危险因素，且呈现多样性、复杂性和易致猝死性。某些成人可不出现明显的临床症状，但其寿命会明显缩短，因此人们对无症状及轻症病人亦日益重视，导致心肌肥厚成为基础和临床研究的重点领域。心肌肥厚的产生除与血流动力异常有关外，还与各种神经、体液因子，尤其是血管紧张素II(Ang II)、内皮素、儿茶酚胺等有关。Ang II是肾素-血管紧张素系统中最为重要的活性成分，可以在不增加血管阻力和心脏后负荷的情况下直接导致心肌肥厚。AngII的生物学作用是由位于组织细胞上的特异性受体介导的。根据不同的药理学特性，Ang II受体可分为两种亚型=ATl受体(ATl-R)和AT2受体(AT2-R)，这两种亚型都是G蛋白偶联受体家族成员。Ang II可通过ATl-R作用于G蛋白，促使与之结合的GTP(三磷酸鸟苷)释放， 激活PLC (磷脂酶C)，产生第二信使DAG ( 二酰基甘油)和IP3 (三磷酸肌醇)，其中IP3引起细胞内储存钙离子的释放，进而提高胞内钙离子水平，DAG可激活H(C(蛋白激酶C)，进而激活MAPK (丝裂原活化蛋白激酶)。ATl-R还可以活化二氢吡啶敏感的电压依赖性钙离子通道和激活受体酪氨酸激酶信号通路。相关资料表明，Ang II能刺激心肌细胞蛋白合成增加和纤维细胞增生，诱导心肌细胞β-MHC基因表达，引起心肌肥大。用ATl-R拮抗剂Losartan 可阻断上述作用，表明该效应是由ATl-R介导完成[Paradis P，Dali-Youcef N, Paradis Fff et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica，2000，97 (2)，931-936]。此外，研究还发现，Ang II通过ATl-R导致多种即刻早期反应基因(c-fos，c-jun，c-myc)和晚期心肌肥厚相关基因(actin-a，ANP)表达，最终导致心肌月巴厚[Li jnen P,Petrov V, Journal of molecular andcellular cardiology, 1999, 21(5)，949-970]。MR-I (Myofibrillogenesis regulator-1)是中国医学科学院医药生物技术研究所王以光课题组首次从人类骨骼肌cDNA文库中发现的与心肌肥大相关新基因。生物信息学分析表明，MR-I基因在人、大鼠、小鼠、牛和猪等高等哺乳动物中相当保守。该基因编码 142个氨基酸。Northern blot和SAGE表达谱分析表明，在人正常组织中，MR-I基因在骨骼肌、心脏、肝脏、肾、肺、结肠、胰腺中均有表达，尤其在骨骼肌及心肌中表达较高，而在乳腺、皮肤、血液中表达很低。其中，在21-M岁人骨骼肌中，MR-I的转录水平比66-77岁人高约50倍。此外，MR-I还与肌球蛋白轻链调节蛋白(myosin regulatory light chain)、肌动蛋白素(myomesin), β -烯醇化酶(β-enolase)等蛋白有相互作用[Li TBet al, Acta biochimica et biophysica Sinica,2004,36 (6),412—418]。
体外研究发现，原代培养的新生大鼠心肌细胞经AngII诱导肥大反应后，MR-I蛋白表达上调；用ATl-R拮抗剂Losartan预处理则抑制肥大反应的发生，MR-I蛋白表达也未见上调，沉默MR-I基因则阻止AngII诱导心肌细胞肥大反应的发生[Liu X et al,American journal of physiology. Hear and circulatoryphysiology,2006,290(1), H279-285]。 此夕卜，在MR-I转基因小鼠中发现，MR-I过表达能加剧AngII诱导心肌肥厚，提示MR-I可能在AngII诱导的心肌肥大中起重要作用[Li HL et al，Hypertension，2007，49 (6)， 1399-1408]。所以，下调MR-I蛋白水平有望成为预防与治疗心肌肥大的的一种研究策略。 本发明提供的以新基因MR-I为靶点的抗心肌肥大药物筛选模型及其构建方法和应用，迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。本发明的目的是，提供一种以新基因MR-I为靶点的抗心肌肥大药物筛选模型及其应用。
发明内容
本发明旨在建立一种从基因转录水平抑制由Ang II诱导MR-I表达的模型，所述模型采用可传代培养的分裂型心肌细胞，构建含MR-I基因启动子-荧光素酶报告基因并稳定表达的心肌细胞株。根据荧光素酶的表达，筛选MR-I启动子抑制剂，为高通量化合物库筛选奠定基础，以期发现能有效下调MR-I基因表达的化合物，寻找预防/治疗心肌肥大疾病药物或其先导化合物。本发明的主要技术方案包括以下方面1、在可分裂的心肌细胞如H9c2中，检测Ang II诱导MR-I蛋白表达的上调，结果表明，1 μ M的Ang II能较显著地提高MR-I在H9c2细胞中的表达；2、扩增MR-I基因启动子不同区域，克隆于含报告基因的表达质粒载体，如含荧光素酶报告基因的表达质粒载体PGL4. 17，获得四种重组质粒pGL4. 17-MR-1/2. 5k、 pGL4. 17-MR-l/l. 5k、pGL4. 17-MR-1/0. 8k、pGL4. 17-MR-1/0. 4k ；3、重组质粒瞬时转染H9c2细胞后，通过荧光素酶表达活性及对Ang II反应性检测，确定最适MR-I启动子反应区域位于pGL4. 17-MR-1/0. 8k重组质粒内；4、在G418(氨基糖苷类抗生素)筛选压力下，构建含pGL4. 17-MR-l/0Jk重组质粒转染稳定细胞株；5、所构建的稳定细胞株在筛选抑制Ang II诱导MR-I基因表达化合物中的应用。发明优点本发明以新基因MR-I为靶点，建立了一种抑制心肌肥大的高通量化合物筛选模型，该模型有利于研发新的预防和治疗心肌肥大疾病药物或其先导化合物。
图IAng II诱导H9c2细胞MR-1蛋白表达上调其中1.MR1，2.肌动蛋白(对照)；A.不加Ang II (对照)，B. Ang II 0. 1 μ M, C. Ang II ΙμΜ图2MR-1启动子不同区域PCR产物电泳检测图其ψ :1.-2392-+144(2536bp) ；2.-1375-+144(1519bp) ；3.-709-+144(853bp)； 4. -284-+144 (428bp) ；5. DNA Marker Trans5k(北京全式金生物技术有限公司)
图3阳性克隆质粒Kpnl/Bglll双酶切鉴定电泳图其中1.pGL4. 17-MR-1/2. 5k2. pGL4. 17-MR-l/l. 5k3. pGL4. 17-MR-1/0. 8k4. pGL4. 17-MR-1/0. 4k5. DNA Marker Trans5k图4MR-1基因启动子不同区域克隆于pGL4. 17载体荧光素酶报告基因上游得到的四种重组质粒图谱图5四种重组质粒瞬时转染H9c2细胞后荧光素酶的表达及Ang II处理对其荧光素酶表达的影响其中EI·空载体对照，Ang II 1 μ M处理纵坐标相对荧光量；横坐标1.载体对照，2. pGL4. 17-MR-1/2. 5k， 3. pGL4. 17-MR-l/l. 5k, 4. pGL4. 17-MR-1/0. 8k, 5. pGL4. 17-MR-1/0. 4k ；*P<0. 05,***P<0. 001(与空载体对照相比)，#P < 0. 05(同一表达质粒Ang II处理与不加药相比)。图6阳性药物对稳定转染H9c2-MR-l/0. 8k细胞株荧光素酶表达活性的影响。其中1.+Ang II 1 μ M处理或-不加Ang II ；2. +阳性药物或-不加阳性药物；纵坐标相对荧光量，横坐标A. H9c2细胞含空载体对照，B. H9c2细胞含pGL4. 17-MR-1/0. 8k 表达质粒。*〃？<0.001(与空载体对照相比)，flP < 0.05(同一表达质粒Ang II处理与不加药相比)。
具体实施例方式以下实施例是为进一步说明本发明提供的基于新基因MR-I的抗心肌肥大药物筛选模型及其构建方法和应用，但不以任何方式限制本发明。《实施例一》AngII处理H9c2细胞对MR-I蛋白表达的影响MR-I蛋白在人心肌细胞中具有较高表达水平，而人源心肌细胞不易获取，大鼠与人基因同源性很高，因而本发明选用但不限于大鼠可传代心肌细胞H9c2(购自美国ATCC， 编号CRL-1446)，该细胞来源于BDlX胚胎大鼠的心肌组织，是永生化细胞，可无限传代，从而克服了原代培养的心肌细胞传代次数有限的局限性。H9c2用含有10%胎牛血清(美国 Invitrogen公司)的DMEM-高糖培养基(美国Hyclone公司)在饱和湿度、37°C、5% CO2 通用培养条件下培养，每2 3天即用胰酶(0. 25%，美国^witrogen公司)消化传代一次。取处于对数生长期的H9c2细胞接种于ΦΙΟΟπιπι培养皿中，待其贴壁生长24h后，分别用0. 1 μ M、1 μ M的AngII诱导处理Mh，收集细胞并提取细胞总蛋白，用Brandford法测定蛋白浓度。取20μ g蛋白上样，经15% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，以hMR_l_T蛋白多克隆抗体[李天伯等，中国医学科学院学报，2005年2月，第27卷第1期，42-47页]1 1000 倍稀释作为一抗进行Astern blot检测MR-I蛋白的表达水平。结果表明，ΙμΜ的Ang II 能较为显著地提高MR-I在H9c2细胞中的表达(图1)。《实施例二》MR-I启动子-荧光素酶报告基因表达质粒的构建和鉴定1. MR-I启动子-荧光素酶报告基因表达质粒的构建
人源MR-I基因在GenBank中对应编号为AF417001，通过NCBI的BLAST程序获得了大鼠MR-I基因启动子区的部分序列，并选择转录起始位点(Transcriptional Starting Site,TSS)上/下游一系列片段，作为参考序列设计、合成4对引物，并在正向引物5’端加入Kpn I酶切位点，反向引物5’端加入Bgl II酶切位点(表1)。禾U用设计的引物，以大鼠H9c2心肌细胞中提取的基因组DNA为模板，扩增大鼠MR-I基因启动子区各片段，并用琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物的大小(图2)，回收大小正确的目的产物。MR-I启动子扩增产物与含报告基因的表达载体，选用合适的酶切位点，酶切连接。本发明采用含荧光素酶报告基因的PGL4. 17质粒(由本所司书毅研究员馈赠)，但不限于该质粒载体。本发明将 MR-I启动子扩增产物和pGL4. 17质粒分别进行Kpn I、Bgl II双酶切并回收酶切片段，按照1 3摩尔比进行连接和转化，挑选克隆，分别通过菌落PCR和阳性克隆质粒以Kpn I、 Bgl II双酶切方法进行鉴定(图3)。经测序(委托中美泰和生物技术有限公司完成)分析证明，所插入的四个片段准确性为100%，最终获得四种重组质粒pGL4. 17-MR-1/2. 5k、 pGL4. 17-MR-l/l. 5k、pGL4. 17—MR-1/0. 8k、pGL4. 17—MR-1/0. 4k (图 4)。表一扩增大鼠MR-I基因启动子区各片段的引物序列
名称正丨M引物反句引物MR-1 /2.5K (-2392-+144)cggggtaccCTGCAAAGAGAAGTAGGCAGgaagatctTGTTCGGGTCCCACCCCCCTTMR-1 /1.5K (-1375-+144)cggggtaccATTGGTAATGCTTCTTTTCGgaagatctTGTTCGGGTCCCACCCCCCTTMR-1/0.8K(-709-+144)cggggtaccTAGGTCTGAAGACCCGGTGTgaagatctTGTTCGGGTCCCACCCCCCTTMR-1/0.4K(-284-+144)cggggtaccACTTCTCTGGGCCCAAACGCgaagatctTGTTCGGGTCCCACCCCCCTT注ggtaCC为Kpn I识别的酶切序列，agatct为Bgl II识别的酶切序列2.四种表达质粒瞬时转染H9c2细胞后，荧光素酶表达活性及对Ang II反应性检测pGL4. 17质粒对照和构建的四种表达质粒分别瞬时转染H9c2细胞，转染在96孔板进行，按照10 μ 1/孔无血清DMEM培养基稀释IOOng DNA, 10 μ 1/孔无血清DMEM培养基 ## 0. 3μ 1 TurboFectin Transfection Reagent ( OriGene ^w] ), ^iUMW 5min 后与稀释的DNA合并混勻，室温孵育20min。取处于对数生长期的H9c2细胞用胰酶消化后，加入含10 % FBS的DMEM培养基适量，轻轻吹打制成单细胞悬液，并调整细胞浓度为 IO5个/ml。在合并后的DNA-脂质体复合物溶液中按照每孔100 μ 1加入单细胞悬液，吹吸均勻，使细胞与DNA-脂质体复合物充分混勻。将混合后的细胞-DNA-脂质体复合物溶液加到96孔板中，每孔120 μ 1。将96孔板置于二氧化碳培养箱内37°C培养。转染他后换液，一组不加药，另一组加ΙμΜ Ang II，继续培养Mh，检测荧光素酶的表达情况。结果发现:pGL4. 17-MR-1/2. 5k、pGL4. 17-MR-l/l. 5k、pGL4. 17-MR-1/0. 8k、pGL4. 17-MR-1/0. 4k 质粒转染组比PGL4. 17质粒对照转染组的荧光素酶活性分别高18、27、43和123倍Γ P
<0. 05,***Ρ< 0. 001与空载体对照相比)(图5)。说明MR-I启动子已经准确插入到了荧光素酶基因上游，并在细胞内启动了荧光素酶基因的表达。其中，Ang II可以较为显著上调pGL4. 17-MR-1/0. 8K质粒转染组的荧光素酶表达，相对于未加药组上调了 23倍(#P
<0. 05)，因而选择pGL4. 17-MR-1/0. 8K质粒构建稳定转染细胞株。《实施例三》稳定转染细胞株的构建
1.确定最适G418筛选浓度将处于对数生长期的H9c2细胞以5000/孔接种于M孔板，待细胞贴壁加G418 (美国 Amersco 公司)筛选，其中 G418 终浓度分别为 0，100，200，300，400，500，600，700，800， 900，1000，1100 μ g/ml共12组；持续培养10-14天，每2-3天更换含对应G418浓度的培养基，观察细胞生长状态。14天后，G418为700 μ g/ml组细胞全部死亡，从而确定本实验所用的H9c2细胞抗G418的筛选浓度为800 μ g/ml，培养维持浓度为600 μ g/ml。2.稳定转染细胞株的筛选将质粒pGL4. 17-MR-1/0. 8k转染大鼠心肌细胞H9c2，在G418筛选压力下制备稳定表达的细胞克隆。经800 μ g/ml G418处理30天后，以转染pGL4. 17的H9c2细胞作为阴性对照，检测其荧光素酶活性。统计学分析表明，pGL4-MR-l/0Jk质粒转染的H9c2细胞株较pGL4. 17空载体转染的H9c2细胞对照株荧光素酶表达有显著性差异(图6) P < 0. 001)，表明质粒pGL4. 17-MR-1/0. 8k已经成功转入了 H9c2细胞。继续传代培养10次， 荧光素酶的表达活性无明显降低，即确定为稳定转染细胞株。《实施例四》稳定细胞株在筛选抑制AngII诱导MR-I基因表达化合物中的应用稳定转染细胞株H9c2-MR-l/0. 8k按照每孔1 X IO4个数量接种于96孔细胞培养板，每孔150 μ L，37°C、5% CO2培养他后，吸弃培养液上清，更换无血清DMEM培养液，并加入待筛化合物(终浓度为10 μ g/mL)处理0. 5h，之后吸弃药液，加入1 μ M Ang II处理Mh。细胞荧光素酶表达活性的测定参照荧光素酶检测系统(!Iomega)说明进行，吸弃 96孔细胞培养板中的培养液上清，每孔加入PBS洗涤细胞2次后，加入20 μ L细胞裂解液 (美国Promega公司)，37°C静置15min以充分裂解，每孔加入60 μ L荧光素酶检测液，用多功能微孔板读板(Wallac Envision，美国PerkinElmer公司)读取荧光素酶活性值。采用Losartan (美国sigma公司)作为阳性药物，检测其抑制Ang II诱导MR-I 启动子-报告基因表达的情况。与未加药细胞相比，Ang II可以显著上调稳定转染细胞的荧光素酶报告基因表达Cp < 0. 05与不处理的相比)，Losartan能有效抑制Ang II诱导报告基因上调的表达，抑制率为18% (图6)，表明本发明所构建的稳定细胞株模型有望用于筛选抑制Ang II诱导MR-I基因表达上调的抗心肌肥大药物。
权利要求
1.一种抑制Ang II诱导MR-I基因表达上调的抗心肌肥大药物筛选模型，其特征是，所述模型系指转染了 MR-I启动子一报告基因表达质粒的稳定表达心肌细胞株。
2.如权利要求1所述的筛选模型，其特征是，所说基因表达质粒为MR-I启动子与含报告基因表达质粒载体的连接产物。
3.如权利要求1所述的筛选模型，其特征是，所说心肌细胞选自大鼠可传代心肌细胞。
4.构建权利要求1所述筛选模型的方法，其主要步骤包括1)扩增MR-I基因转录起始位点启动子区域片段，通过酶切和连接克隆于报告基因表达质粒，获得重组质粒；2)重组质粒的PCR、酶切和测序鉴定；3)将鉴定过的重组质粒转染大鼠可传代心肌细胞，经加压筛选，获得稳定的转染细胞株。
5.权利要求1所述模型在筛选抗心肌肥大药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征是，培养稳定转染细胞株，在培养液中加入待筛选化合物，部分细胞培养液中再加入Ang II，诱导心肌肥大反应发生；清洗细胞，通过测定待筛化合物抑制报告基因表达程度，评估所述化合物抗心肌肥大的效果。
全文摘要
本发明涉及以MR-1为靶标的抗心肌肥大药物筛选模型及其构建和应用，所说模型中，在大鼠心肌细胞中Ang II可诱导MR-1启动子-报告基因反应性表达上调，进而通过测定待筛化合物抑制报告基因表达的程度来评价化合物抗心肌肥大的活性，本发明所建立的药物筛选模型新颖、高效、可靠、简便，适于高通量药物筛选，对于寻找心肌肥大防治药物具有重要意义。
文档编号C12N15/113GK102174472SQ20111000794
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者何琪扬, 司书毅, 孔维佳, 王以光, 王真, 蒋建东, 陈金晶 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所