一种简单、快速制备即用esiRNA的方法

专利名称：一种简单、快速制备即用esiRNA的方法
技术领域：
本发明涉及小RNA的制备方法，特别涉及一种简单、快速、低成本的制备即用 (ready-to-use) esiRNA 的新方法。
背景技术：
RNA 干扰(RNA interfering, RNAi)是由双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 诱发引起同源mRNA高效特异性降解的现象，是生物界一种古老而且进化上高度保守的基因表达调控机制。1998年研究者发现在C. elegans或果蝇中注入dsRNA可特异性抑制基因表达，并将这种由dsRNA引发的抑制特定基因表达的现象成为RNAi。随后RNAi的基础研究和应用迅速成为生命科学的热点领域之一。RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。RNAi干扰技术沉默基因具备简单、高效、快速等特点，使得大规模使用这种技术成为可能。近年来，有不同规模和形式的siRNA表达文库被建立起来。针对每一条基因，合成对应的siRNA是目前常用的方法。Dharmacon，Ambion以及Sigma等公司甚至提供全基因组siRNA文库。利用siRNA文库在全基因组筛选功能基因已经取得一些令人瞩目的结果， 目前化学合成的siRNA和shRNA已经成为哺乳动物细胞RNAi最常用的、得到充分表征的介质。通过核酸内切酶制备的siRNA(endoribonuclease-pr印ared siRNA, esiRNA)是一种使用细菌核糖核酸酶III (RNase III)酶消化长链dsRNA而得到的siRNA，由于这种siRNA具有较低的脱靶效应以及成本较低，最近得到较多的关注。这种siRNA类似物的混合物分子由多种异源的RNA片段组成，但是它们的目标转录物却是相同的，这个特点赋予了它们很高的沉默效力以及比化学合成siRNA低12倍的脱靶效应。基于siRNA库的全基因组RNAi 筛选已经被证明了能够发现在细胞分裂中未知的组分、DNA修复、转铁蛋白(transferrin， TF)、表皮细胞生长因子(EGF)相关的内吞贩运。然而，现有技术制备esiRNA是一个相当复杂的过程，包括至少6个步骤PCR扩增、转录、酶消化、纯化、esiRNA定量化以及归一化(图1)，这些步骤包括需要对液体样品进行转移、纯化、定量化和归一化等操作，需要使用昂贵的仪器，例如液体处理系统、离心机和光谱仪。这些繁琐而昂贵的工作严重影响了 esiRNA大规模的制备和应用。另一个方面，业内急切需要对esiRNA的性能评测和提高进行广泛和深入的研究。

发明内容
本发明的目的正是为了解决上述技术问题，提供一种简单、快速、廉价的制备即用(ready-to-use) esiRNA的新方法。本发明采用集成了高分子微球(高分子块体)的芯片对esiRNA进行简单、快速、廉价的制备，利用这个芯片在聚合物支架上进行扩增、转录和酶消化，从而简化了液体转移和纯化等操作步骤，将esiRNA的制备方法由现有技术的6个步骤缩减为本发明的3个步骤，大大简化了 esiRNA的制备过程；同时，利用该芯片可以对 esiRNA产物的量进行裁剪和归一化，使得esiRNA无需进一步的处理就可以直接用于功能丧失(loss-of-function)研究。在本发明中，术语“小RNA”指的是核苷酸数目较少的RNA，包括但不限于微小 RNA(microRNA,简称 miRNA)、小型干扰 RNA(short interfering RNA,简称 siRNA)、小核 RNA (small nuclear RNA，简称 snRNA)、小时序RNA (small temporal RNA，简称 stRNA)、piwi 蛋白作用的 RNA(Piwi-interacting RNA，简称 piRNA)等。“U”是酶的单位，定义为在最适反应条件下，1小时完全降解Img DNA的酶的量。“固定化” (immobilize)指的是核酸分子(包括但不限于DNA探针、小RNA等)通过化学基团(如氨基-NH2)与高分子块体上的化学基团(如羧基-C00H)通过化学反应(如氨基与羧基脱去一分子水)形成共价键，从而将核酸分子与高分子块体紧密连接在一起； 或者指溶液中的核酸分子与已经固定化到高分子块体上的探针分子通过碱基配对生成氢键紧密连接在一起。因此，“固定化”不同于物理的吸附或粘附，通常的洗涤方式可以将吸附或粘附在高分子块体上的杂质洗去，却不能洗去“固定化”到高分子块体上的核酸分子。DNA探针，即15_150nt长短的单链DNA片段。通过与目标分子的部分序列形成碱基互补配对，达到识别、检测、分离纯化等功能。"PCR反应”即聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术，包括变性、退火和延伸三个步骤。一般而言，一个PCR反应包括若干个变性、退火和延伸循环过程，用于DNA模板等扩增放大。本发明是通过如下的技术方案实现的。准备一个基板，该基板是一个刚性的平板， 形成该平板的材料包括玻璃、硅、石英、塑料、云母、金属、陶瓷等，在本发明的具体实施方式
中使用容易获得的塑料基片。在该平板上固定多个刚性长条，为便于操作，上述多个刚性长条最好垂直于上述平板，并且规则排列。形成该刚性长条的材料并没有特别限制，例如可以是玻璃、硅、石英、塑料、云母、金属、陶瓷等，在本发明的具体实施方式
中使用容易获得的毛细玻璃管。在该刚性长条的末端(即未固定在平板上的那一端)上附有高分子材料形成的块体，该高分子材料块体的外形和尺寸没有特别的限制，可以是长方体、正方体、多面体、圆球体、椭球体等，优选为小圆球，材料也没有特别的限制，只要能与DNA探针上的化学基团反应形成化学键即可，在本发明的具体实施方式
中使用聚丙烯酰胺在毛细玻璃管末端形成微球，在高分子块体材料的聚合物骨架上固定化一些DNA探针，于是这些块体材料便具有了很强的与核酸结合的能力。为了增加块体上DNA探针的密度和后续反应的效率， 块体优先制备成为多孔状。上述基板、基板上的刚性长条、长条末端的高分子块体以及高分子块体上固定化的DNA探针一起构成了本发明的方法中使用的核酸芯片，使用该芯片可以将传统的esiRNA合成方法的6个步骤减少为三个步骤(图2b) :1、目标扩增(target amplification) ；2、转录(transcription) ；3、酶消化(enzymatic digestion)。整个制备过程中将用到两块核酸芯片，其中在步骤1(也即目标扩增步骤)中用到的核酸芯片称为第一核酸芯片，而在步骤2 (也即转录步骤)中用到的核酸芯片称为第二核酸芯片。1、目标扩增。以一对PCR引物标记的线性化的DNA片段作为PCR模板(该线性化的DNA片段可以是克隆的cDNA片段或者采用芯片化学合成的DNA低聚物)，将其置于多孔板中，将上述第一核酸芯片插入多孔板中(高分子块体浸入孔内溶液中)，于是PCR过程中的扩增产物就可以固定到高分子块体上，PCR扩增反应结束后，将第一核酸芯片从多孔板中取出，用简单的清洗方法就可以将附着在高分子块体上的上清液(其中包含有dNTP、DNA聚合酶和缓冲溶液)洗去，从而省去了繁琐的离心纯化步骤。为证明这些高分子块体上固定化了 PCR扩增产物，将这些高分子块体作为另一个PCR反应的模板，结果表明，当高分子块体上固定化了 DNA探针时，上清液中出现了扩增产物，而当高分子块体上没有DNA探针时， 没有检测到任何扩增产物。块体为多孔状有利于充分进行PCR反应。2、转录。将上述固定化了 DNA扩增产物的第一核酸芯片转移到另一个多孔板中， 在T7RNA聚合酶的作用下，通过体外转录得到了大量的与高分子块体上固定化的DNA互补的RNA链，退火即得到RNA双链(图2c，中间)。为了从含有dNTP、转录酶和缓冲溶液的上清液中分离出上述RNA双链，用另外一块核酸芯片(即第二核酸芯片)取代第一核酸芯片浸入到上述上清液中，使得高分子块体上的DNA探针可以通过杂交与上清液中的RNA双链结合，接着用PBS缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液)进行严格的冲洗。3、酶消化。将步骤2中得到的固定化在第二核酸芯片上的纯RNA在酶的作用下消化得到esiRNA(也称为凝胶-esiRNAfeel-esiRNA)，图2c)。试验证明，当第二核酸芯片的高分子块体上没有固定化探针的时候，得不到任何esiRNA(图3b)。因此，利用该核酸芯片可以方便地转移大量的固定化产物或者杂交产物，而不用对液体样品进行费时费力费钱的繁杂操作。由于无论是PCR还是转录步骤的上清液都会对细胞的生存能力造成显著的负面影响，因此在合成esiRNA的传统方法中，移除这些上清液就成了不可避免的重要步骤。与传统方法不同，本发明提供的上述基于凝胶的方法可以通过固定化或者杂交简单、快速地提纯产品，而不需要进行费时费力的离心分离提纯。而当进行高通量的实验而需要大量 esiRNA的时候，上述不需要进行离心纯化的特点就显得更加有优势。若采用传统方法合成esiRNA，除了纯化之外，在使用esiRNA之前，定量化和归一化也是两个繁琐却关键的步骤。而采用本发明的方法则无需对esiRNA进行定量化和归一化，由于最终获得esiRNA的量与高分子块体上的探针数目、DNA模板的数量以及PCR扩增的循环次数相关，采用本发明的方法可以通过控制上述三个条件来控制最终获得的esiRNA 的数量(图2c、4a&4b)。传统方法之所以要定量化和归一化，是因为最初加入的DNA模板数量的微小差异会导致转录产物或者esiRNA产品数量的巨大差异。我们的实验证明，2-3个PCR反应(每个反应包括30-35个变性、退火和延伸循环)之后，不同孔中esiRNA产品数量趋于一致了 (图fe)。这可能是由于多个PCR反应后，第一核酸芯片高分子块体上的DNA探针与DNA扩增产物的结合趋于饱和了，于是通过控制芯片上各个高分子块体的形状大小相同就可以控制其上固定化的DNA探针数目相同，进一步控制与DNA探针结合的DNA扩增产物数量相同， 而以DNA扩增产物为模板进行体外转录得到的RNA数量也趋于相同，最终，通过控制第二核酸芯片各个高分子块体的形状大小相同就可以在每个高分子块体上结合上相同数量的 RNA,最终通过酶消化得到相同数量的esiRNA。例如，如果最初在不同孔中加入的DNA模板数上下相差10倍(也即最多的量为最少量的10倍)，则经历2个PCR反应之后，最终得到的esiRNA数量差异小于13% ；而经历3个PCR反应之后，即使最初加入的DNA模板数上下相差100倍，最终得到的esiRNA数量差异也小于3%。为进一步确认实验的可重复性，我们按照本发明的方法制备了 10种不同种类的esiRNA，结果发现经历了 2个PCR反应之后， 10种不同esiRNA之间的标准偏差小于等于10% (图恥)。因此，esiRNA产品的量可以通过控制高分子块体上DNA探针的数量以及PCR扩增反应循环次数来进行定量和归一化。准备两块核酸芯片，按照使用先后顺序分别称为第一核酸芯片和第二核酸芯片， 上述核酸芯片具有一个刚性基板，在该基板上并列固定多个刚性长条，在刚性长条未与基板接触的一端设置高分子块体，该高分子块体材料具有能与DNA分子反应生成化学键的化学基团。将含有DNA探针分子的溶液与上述高分子块体接触，使DNA探针分子与高分子块体发生化学反应生成化学键而固定化到高分子块体上。将第一核酸芯片上的高分子块体浸入到PCR扩增溶液中进行DNA扩增反应，扩增产物DNA在反应过程中与高分子块体上的DNA探针结合而固定化到高分子块体上，反应结束后取出第一核酸芯片，洗涤高分子块体，然后将高分子块体浸入到转录溶液中进行转录反应，反应结束后取出第一核酸芯片，将第二核酸芯片上的高分子块体浸入到上述转录溶液中，使转录溶液中的RNA产物与第二核酸芯片高分子块体上的DNA探针结合而固定化到高分子块体上，结束后取出第二核酸芯片，洗涤高分子块体，然后将高分子块体浸入到酶消化溶液中，在酶的作用下将固定化在高分子块体上的长链RNA消化为esiRNA。采用上述方法制备esiRNA可以得到纯的esiRNA，无需进行传统方法中的离心分离步骤。具有上述技术效果的关键在于每一步骤都把需要的产物固定化到高分子块体上， 而其他杂质只是附着在高分子块体上，因而可以通过简单的冲洗除去这些杂质，省去了繁琐的离心分离步骤，这个优点在大量制备esiRNA时尤其突出，例如并列进行1000个对比实验的时候，如果采用传统方法制备esiRNA，光对液体样品进行离心分离就要耗费大量的时间，而采用上述方法，则只需增加核酸芯片上的附有高分子块体的刚性长条数目即可，操作时间与进行1、2个实验几乎相同。如果进一步将同一核酸芯片上不同高分子块体的形状、体积设置为相同，则可以省去传统方法中的定量化以及归一化步骤。这是由于固定化到高分子块体上的DNA分子或者RNA分子主要取决于高分子块体上的DNA探针数目，控制DNA探针数目一致，就可以最终得到数量相近的esiRNA。进一步控制PCR扩增溶液中初始加入的DNA模板数量相同、增加PCR扩增反应的次数等，都可以使得最终得到的esiRNA的量更加趋于一致。


图1现有技术制备esiRNA的6个步骤PCR扩增、转录、酶消化、纯化、esiRNA定量化以及归一化。图2本发明的制备esiRNA方法示意图及中间产物和最终产物的电泳图。a. 96针的核酸芯片结构示意图，每一根毛细管末端具有大小相同的聚丙烯酰胺微球，微球上固定化了一定数量的DNA探针。b.本发明的制备esiRNA的方法可以分为3个步骤1、目标扩增(target/templateamplification) ；2、转录(transcription) ；3、酶消化(enzymatic digestion)。c. PCR扩增产物、转录产物和esiRNA产物的电泳结果图，Ll和L2是两个并行实验，DNA模板量Ll < L2，PCR扩增产物和转录产物都是使用固定化到第一核酸芯片上的DNA为模板制备得到的，由图可以看出，PCR扩增产物、转录产物和esiRNA产物的量都与最初加入的DNA模板数相关。L2中esiRNA的量约为40ng，与传统方法中转移到96孔板中的一个孔中的esiRNA量相同。图3证明高分子块体上固定化的DNA探针作用的电泳图片。 a.三组并行实验，其中两组的第一核酸芯片上固定化了 DNA探针(用“ + ”表示)，而第三组的第一核酸芯片上未固定化DNA探针(用“-”表示)，将三块上述第一核酸芯片分别浸入到PCR扩增溶液中，在相同的条件下进行孵育，孵育完成后取出，洗涤高分子块体，分别将洗涤好的三块芯片浸入到不含有DNA模板的PCR扩增溶液中进行PCR扩增，然后对上清液进行电泳检测。b.三组并行实验，其中两组的第一核酸芯片上固定化了 DNA探针(用“ + ” 表示)，而第三组的第一核酸芯片上未固定化DNA探针(用“-”表示)，三组实验的第二核酸芯片上都固定化了 DNA探针，对酶消化后的上清液进行电泳检测。图4通过控制固定化到高分子块体上的DNA探针数控制esiRNA产品的数量。PCR 扩增产物量(a)和esiRNA的产量(b)主要与DNA探针数相关。四个并列实验中固定化到第一核酸芯片高分子块体上的DNA探针数量分别为5、10、25、50pmol。注初始DNA模板数量为30ng，进行了 35个扩增循环。图ksiRNA产品的归一化。a.初始的DNA模板数分别为100、10、1、0. Ing(体积 5μυ。第一个PCR反应(35个循环)后，冲洗第一核酸芯片，将其转移到另外一个多孔板中进行下一个PCR反应。实验证明不同试验中esiRNA的产量在进行2_3个PCR反应之后变得接近。b.使用本发明的方法制备了 10种不同的esiRNA，PCR反应次数为2，10个产品之间的标准差约为10%。图6本发明制备的凝胶-esiRNA沉默效率和特异性。a.概念验证 (proof-of-concept)实验证明了大量制备即用凝胶-esiRNA的可行性。并行制备的15批 GFP凝胶esiRNA能强烈抑制GFP的荧光，而5批Skp2凝胶esiRNA对GFP的荧光强度没有任何影响。Mc.采用本发明的方法(Gel)和传统方法(Conv.)制备的多种esiRNA沉默效率定量对比。qRT-PCR结果表明，采用两种方法制备的12种esiRNA都能产生有效的抑制效应，而Western blot实验表明以p53、Ezh2、Cdhl或Vim为靶标的esiRNA抑制蛋白表达到低于62%的水平。图7a.显微荧光照片显示对Skp2或者Cdkl的抑制相应导致了 Hela细胞的核增大(白色箭头)或者细胞周期停滞(白色箭头)。b.荧光激活细胞分选 (fluorescence-activated cell sorting(FACS))数据证明了对 Skp2 或者 Cdkl 的沉默导致Hela细胞相应地停滞在Gl或G2/M阶段。
具体实施例方式以下将通过具体的实施例说明本发明，但是这些具体的实施例不应当理解为对本发明的限制，对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护范围之内。材料和方法1.高分子块体的制备含丙烯酰胺(丙烯酰胺双丙烯酰胺=19 1) IOwt %的丙三醇溶液、0. IM的磷酸钠缓冲溶液(pH=7. 0)、3wt%&甲基丙烯酸、0. 005wt%&APS和2mM TEMED在氮气保护下充分混合，然后转移到试管中，在65°C下孵育过夜使其聚合。
2. DNA探针在高分子块体上的固定化使用含有EDCQmM)禾Π sulfo-NHS (2mM)的 MES (0. 1M)缓冲溶液(pH = 6. 0)对聚丙烯酰胺高分子块体上的羧基进行活化，然后加入5’端氨基修饰过的DNA低聚物 (Invitrogen Co. Ltd.，上海)并在室温下孵育过夜。PCR扩增反应所用的DNA探针(也即固定化到第一核酸芯片上的探针)序列如下5’ -amino-TCACAGGATGGCTAATACGACTCACTATA GGGC-3’，而转录过程用到的DNA探针(也即固定化到第二核酸芯片上的探针)序列如下 5，-amino-AAGATGTCACAGGATGGCTAATACG-3，。3.核酸芯片的制备实验中为与常用的96孔板配合使用，按照96孔板的构造，在一块塑料板上用聚二甲基硅氧烷(PDMS)固定一组毛细管(8 X 12共96根，按照96孔板的构造规则分布)，然后在用二氧化硅修饰的毛细管末端结合上聚丙烯酰胺微球。4. PCR 为获得PCR模板，可以利用cDNA，也可以直接提取特定细胞(如Hela)的信使RNA， 也可以通过化学合成的办法直接获得。每一对引物的序列见表1。PCR溶液包括Taq DNA 聚合酶(2. 5U, TakaRa Co. Ltd)、0· 18mM dNTPs、0. 5mM PCR 引物 1 (5，-TCACAGGATGGCTAATA CGACTCACTATAGGGC-3’)以及模板。将每个高分子块体浸入到5 μ LPCR溶液中进行孵育，然后用矿物油盖住。第一个PCR反应之后，用0. IM的MES缓冲液(pH = 6. 0)冲洗3次。如果需要再进行一次PCR反应，则按照上述条件重复一次，但是不用加模板。表1. DNA片段的引物序列
权利要求
1.一种制备esiRNA的方法，其特征在于包括以下步骤(1)准备两块核酸芯片，按照使用先后顺序分别称为第一核酸芯片和第二核酸芯片，上述核酸芯片具有一个刚性基板，在该基板上并列固定多个刚性长条，在刚性长条未与基板接触的一端设置高分子块体，该高分子块体材料具有能与DNA分子反应生成化学键的化学基团，将含有DNA探针分子的溶液与上述高分子块体接触，使DNA探针分子与高分子块体发生化学反应生成化学键而固定化到高分子块体上；(2)将第一核酸芯片上的高分子块体浸入到PCR扩增溶液中进行扩增反应，扩增产物 DNA在反应过程中与高分子块体上的DNA探针结合而固定化到高分子块体上，反应结束后取出第一核酸芯片，洗涤高分子块体；(3)将高分子块体浸入到转录溶液中进行转录反应，反应结束后取出第一核酸芯片， 将第二核酸芯片上的高分子块体浸入到上述转录溶液中，使转录溶液中的RNA产物与第二核酸芯片高分子块体上的DNA探针杂交而固定化到高分子块体上，结束后取出第二核酸芯片，洗涤高分子块体；(4)将高分子块体浸入到酶消化溶液中，在酶的作用下将固定化在高分子块体上的长链RNA消化为esiRNA。
2.根据权利要求1所述的制备esiRNA的方法，其特征在于同一核酸芯片上各高分子块体的形状、体积相同。
3.根据权利要求1或2所述的制备esiRNA的方法，其特征在于PCR扩增反应次数大于等于2。
4.根据权利要求1-3的任意一项所述的制备esiRNA的方法，其特征在于PCR扩增溶液中初始加入的DNA模板数量相差不超过100倍。
5.根据权利要求1-4的任意一项所述的制备esiRNA的方法，其特征在于PCR扩增溶液中初始加入的DNA模板数量相同。
6.根据权利要求1-5的任意一项所述的制备esiRNA的方法，其特征在于高分子材料含有一种或两种以上的选自羧基-C00H、磺酸基-SO3H、氨基-NH2、叠氮基、环氧基、硫醇基、炔基、氰基、烯烃双键、丙烯酸脂类双键。
7.根据权利要求1-6的任意一项所述的制备esiRNA的方法，其特征在于高分子材料选自聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)、聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚2-羟乙基(甲基)丙烯酸酯、聚N-异丙基(甲基)丙烯酰胺、 聚乙酸乙烯酯、聚丙烯胺中的一种或两种以上的组合物。
8.根据权利要求1-7的任意一项所述的制备esiRNA的方法，其特征在于刚性基片的材料选自玻璃、硅、石英、塑料、云母、金属、陶瓷、复合材料、聚酯中的任意一种。
全文摘要
本发明涉及小RNA的制备方法，特别涉及一种简单、快速、低成本的制备即用(ready-to-use)esiRNA的新方法。本发明采用集成了高分子微球(高分子块体)的芯片对esiRNA进行简单、快速、低成本地制备，利用这个芯片在聚合物支架上进行扩增、转录和酶消化，从而简化了液体转移和纯化等操作步骤，将esiRNA的制备方法由现有技术的6个步骤缩减为本发明的3个步骤，大大简化了esiRNA的制备过程；同时，利用该芯片可以对esiRNA产物的量进行裁剪和归一化，使得esiRNA无需进一步的处理就可以直接用于基因沉默导致的功能丧失(loss-of-function)研究。
文档编号C12N15/10GK102586224SQ20111000757
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者席建忠, 黄璜 申请人:北京大学