一种多苯并咪唑类配合物及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明公开了一种多苯并咪唑类配合物，及其制备方法和用途。以多元胺羧酸或二羧酸与邻苯二胺为起始原料，合成所需配体多苯并咪唑类化合物；将配体多苯并咪唑类化合物与CuCl2，Cu(NO3)2或Cu(ClO4)2反应，合成多苯并咪唑类配合物。所述多苯并咪唑类配合物可以作为铜锌超氧化物氧化酶(SOD1)的模拟物，具有提高植物抗干旱胁迫能力的作用。
【专利说明】
一种多苯并咪唑类配合物及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及化学领域，具体的，本发明涉及化合物及其制备方法和应用，更具体 的，本发明涉及多苯并咪唑类金属配合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] S0D是生物体内清除0广对细胞伤害的一类重要的抗氧化酶，它可以催化0广歧化 生成〇2和H2〇2。根据活性中心金属离子不同，天然存在的S0D主要有Cu_ZnS0D(S0Dl)，MnS0D， FeS0D，NiS0D和Fe-ZnSOD等类型。X-射线结构分析表明，SOD酶活性中心金属离子大多与3~4 组氨酸残基(可能还包括天门冬氨酸羧基）和一个水分子配位形成形成畸变四方锥或扭曲 四面体几何构型。
[0003] 根据S0D1的催化反应机理及其活性中心的结构特点，研究者设计模拟酶化合物的 主要围绕中心金属Cu2+、Cu-Zn咪唑桥和S0D1活性中心微环境等三方面展开。
[0004] 早期S0D1模拟工作旨在寻找具有歧化功能的Cu11配合物，采用水杨酸和氨基酸类 配体，配合物虽表现出S0D1酶拟活性，但稳定性差;继而又发展出多肽和青霉胺类的Cu 11配 合物，稳定性有改善，但效果并不理想;上世纪80年代Lippard等以大环多胺Cu11配合物用于 S0D模拟研究，使大环超分子体系用于S0D模拟被引起注意，并在国内外取得了新的进展。过 去开展化合物模拟S0D1活性的研究主要以模拟酶活性中心结构和功能、催化0 2'_歧化反应 的动力学为主，这类模拟可用纯化学方法完成，并不能真实反映化合物在复杂生物体系中 的效能。近年来，在药理学领域，研究者为探索开发新型抗癌药物，也将S0D模拟物用于动物 活细胞系研究，但至今未见相关临床应用药物。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明合成了一系列多苯并咪唑类配合物，并 将其作为铜锌超氧化物氧化酶(S0D1)的模拟物，具有提高植物抗干旱胁迫能力的作用。
[0006] -方面，本发明涉及一种配合物及其药理学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、前 体药物，具体为：
[0007]
[0008] 另一方面，本发明提供的配合物(1)-(9)的制备方法，包括如下步骤：
[0009] (1)以多元胺羧酸与邻苯二胺为起始原料，合成所需配体多苯并咪唑类化合物； (2)将配体多苯并咪唑类化合物与CuCl2，Cu(N03)2或Cu(Cl〇4)2反应，合成多苯并咪唑类配合 物。
[0010]在本发明的一种优选的实施方案中，本发明提供的配合物（1) - (9)的制备方法，包 括如下步骤：
[0011] (1)将多元胺羧酸、邻苯二胺与反应溶剂混合，回流反应4~8小时，再冷却至100°C 后倒入蒸馏水中，冷却至室温，得到粘稠固体，向其中加入适量无水乙醇，静置;过滤溶液得 红褐色固体粗产品，将粗产品用无水乙醇重结晶得到白色固体产物，用丙酮洗涤，得粉末状 配体多苯并咪唑类化合物；（2)将粉末状配体多苯并咪唑类化合物溶解于甲醇中，加入适量 CuCl2，Cu(N03)2或Cu(C1〇4)2,50~60°C搅拌反应4~6小时，冷却、过滤，得到澄清的溶液;室 温下静置至析出晶体，得到配合物。
[0012] 在本发明的一种实施方案中，其中步骤(1)中所述回流反应温度为140-180°C。
[0013] 在本发明的一种实施方案中，其中步骤(1)中所述反应溶剂为乙二醇或者稀盐酸。
[0014] 另一方面，本发明提供的配合物(10 )，（ 11)的制备方法，包括如下步骤：
[0015] (1)以二羧酸与邻苯二胺为起始原料，合成所需配体多苯并咪唑类化合物；（2)将 配体多苯并咪唑类化合物与CuC1 2，Cu(N03)2或Cu(Cl〇4)2反应，合成多苯并咪唑类配合物。
[0016] 在本发明的一种优选的实施方案中，本发明提供的配合物（10) -(11)的制备方法， 包括如下步骤：
[0017] (1)将二羧酸、邻苯二胺与反应溶剂混合，回流反应6~8小时，将反应所得混合物 倒入冰水中，得到沉淀;将沉淀加入20 %的碳酸钠溶液中，抽滤，滤渣用无水甲醇溶解重结 晶，得到无色块状晶体配体多苯并咪唑类化合物；（2)将粉末状配体多苯并咪唑类化合物溶 解于甲醇中，加入适CuC1 2，Cu(N03)2或Cu(C1〇4)2,50~60°C搅拌反应4~6小时，冷却、过滤， 得到澄清的溶液;室温下静置至析出晶体，得到配合物。
[0018] 在本发明的一种实施方案中，其中步骤(1)中所述回流反应温度为140-180°C。
[0019] 在本发明的一种实施方案中，其中步骤(1)中所述反应溶剂为乙二醇或者稀盐酸。
[0020] 另一方面，本发明提供的配合物（1)-(11)作为铜锌超氧化物歧化酶(S0D1)模拟物 的应用。
[0021 ]另一方面，本发明提供的配合物（1 )-(11)在制备调节农作物抗干旱胁迫药物中的 应用，优选地在制备调节水稻抗干旱胁迫药物中的应用。
[0022]与现有技术相比，本发明提供的多苯并咪唑类配合物，可以用于植物抗氧化酶活 性模拟研究，能够显著提高抗氧化酶的活性，具有提高植物抗旱胁迫的作用。本发明提供的 多苯并咪唑类配合物的制备方法，操作简单，原料易得，反应条件温和，提纯方便，可应用于 工业化规模生产。
【附图说明】
[0023]图1为配合物1-3的单晶结构示意图 [0024]图2为配合物4-6的单晶结构示意图 [0025]图3为配合物7-9的单晶结构示意图 [0026]图4为配合物10的单晶结构示意图 [0027]图5为配合物11的单晶结构示意图 [0028]图6为配合物1的电势图
[0029] 图7为配合物2的电势图
[0030] 图8为配合物3的电势图 [0031]图9为配合物4的电势图 [0032]图10为配合物5的电势图 [0033]图11为配合物6的电势图 [0034]图12为配合物7的电势图 [0035]图13为配合物8的电势图 [0036]图14为配合物9的电势图
[0037]图15为配合物10的电势图
[0038]图16为配合物11的电势图
[0039]图17为S0D1模拟物活性检测实验原理图
[0040]图18为水稻根中0:Γ检测结果图
[0041 ] 图19为水稻叶中Η2〇2检测结果图
[0042] 图20水稻根中Η0 ·检测结果图
[0043]图21水稻组织内S0D活性检测结果图
[0044] 图22水稻组织内APX活性检测结果图
[0045] 图23水稻组织内CAT活性检测结果图 [0046]图24水稻组织内GR活性检测结果图
【具体实施方式】
[0047]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨 在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0048] 实施例1:
[0049] 配合物1的制备：
[0050]
[0051] 步骤 1:亚氨基二乙酸（0.1111〇1，13.38)和邻苯二胺（0.2111〇1，21.68)，以1001^乙二 醇为溶剂，200°C回流反应约8小时，直到无水蒸气气泡放出为止，冷却至室温，将反应所得 混合物倒入200mL蒸馏水中，冷却至室温，得白色粘稠固体，向其中加入过量无水乙醇，静置 过夜，过滤得灰白色固体产物，用少量丙酮洗涤，然后抽滤，用无水甲醇重结晶，得到N，N-二 (2-苯并咪唑甲基)亚胺（IDB)。
[0052] 步骤2:分别称取IDB(0.27g，lmmol)和Cu(C104)2 · 6H20(0.37g，lmmol)溶于5mL甲 醇中，在水浴下加热至40~50°C，搅拌，反应30min后，滤液冷却至室温，过滤，得到澄清的蓝 色溶液。在室温下静置两周，瓶底出现蓝色晶体，过滤得到蓝色固体物质，分别用二次水、乙 醇及乙醚洗涤，低温干燥，得到0.42g蓝色固体粉末。产率：73 %。红外（KBr，cm-1): 3360， 3062，1654，1570，1397，1100，725和620。
[0053]表1实施例1制备的配合物1单晶结构数据
[0054]
[0055] 附图1内含配合物1单晶结构示意图。
[0056] 实施例2:
[0057]配合物2的制备：
[0058]
[0059] 类似实施例1的制备方法，采用IDB: Cu(N03)2 = 1:1的当量反应得到配合物2。
[0060]表2实施例2所制备的配合物2的键长、键角数据
[0061]
[0062] 附图1内含配合物2的单晶结构示意图。
[0063] 实施例3:
[0064]
[0065] 类似实施例1的制备方法，采用IDB: CuCl2 = 1:1的当量反应得到配合物3。
[0066] 表3实施例3制备的配合物3键长、键角数据
[0067]
[0068] 附图1内含配合物3单晶结构示意图。
[0069] 实施例4:
[0070]配合物4的制备：
[0071]
[0072]类似实施例1的制备方法，采用氨三乙酸：邻苯二胺=1: 3的起始原料制得NTB，再 以NTB: Cu (C104) 2 = 1:1的当量反应得到配合物4。
[0073]表4实施例4所制备的配合物4的单晶结构数据
[00741
[0075]附图2内含配合物4的单晶结构示意图。
[0076] 实施例5:
[0077]配合物5的制备：
[0078]
[0079]类似实施例1的制备方法，采用乙二胺四乙酸：邻苯二胺= 1:4的起始原料制得 EDTB，再以EDTB: Cu (C104) 2 = 1:1的当量反应得到配合物5。
[0080] 表5实施例5所制备的配合物5的单晶结构数据
[0081]
[0082]附图2内含配合物5的单晶结构示意图。
[0083] 实施例6:
[0084]配合物6的制备：
[0085]
[0086]类似实施例1的制备方法，采用氨三乙酸：邻苯二胺=1: 3的起始原料制得NTB，再 以NTB: CuCl 2 = 1:1的当量反应得到配合物6。
[0087]表6实施例6所制备的配合物6的单晶结构数据
[0088]
[0090] 附图2内含配合物6的单晶结构示意图。
[0091] 实施例7 [0092]配合物7的制备：
[0093]
[0094]类似实施例1的制备方法，采用氨三乙酸：邻苯二胺=1: 3的起始原料制得NTB，再 以NTB:Cu(N03)2 = l: 1的当量反应得到配合物7。
[0095] 附图3内含配合物7的单晶结构示意图。
[0096] 实施例8 [0097]配合物8的制备：
[0098]
[0099]类似实施例1的制备方法，采用乙二胺四乙酸：邻苯二胺= 1:4的起始原料制得 EDTB，再以EDTB:CuS〇4 · 5H20=1:1的当量反应得到配合物8。
[0100]表7实施例8备的配合物8单晶结构数据
[0101]
[0102] 附图3内含配合物8的单晶结构示意图。
[0103] 实施例9 [0104]配合物9的制备：
[0105]
[0106]类似实施例1的制备方法，采用乙二胺四乙酸：邻苯二胺= 1:4的起始原料制得 EDTB，再以EDTB: Cu (N03) 2 = 1:1的当量反应得到配合物9。
[0107]表8实施例9所制备的配合物9的单晶结构数据
[0108]
[0110] 附图3内含配合物9的单晶结构示意图。
[0111] 实施例10:
[0112] 配合物10的制备：
[0113]
[0114]
[0115]
[0116] 步骤 1:取二甘醇酸（0 · lmol，13.4g)和邻苯二胺(0 · 2mol，21.6g)，以 100mL乙二醇 为溶剂，180°C回流反应约8小时，直到无水蒸气气泡放出为止，冷却至室温，将反应所得混 合物倒入200mL冰水中，得到沉淀，将沉淀倒入20 %的碳酸钠溶液中调pH为中性，然后抽滤， 用无水甲醇重结晶，得到化合物二苯并咪唑醚(0ΤΒ)。
[0117] 步骤 2:将 4mL CuCl2 · 2H2〇(2.83g，0.025mol)乙醇溶液逐滴加入到 200mL 0ΤΒ (6.958g，0.025mol)甲醇溶液中，搅拌，加热50-60°C，反应半小时后，过滤，滤液冷却静置， 过夜，有浅黄色晶体析出。过滤，依次用少量水，乙醇，乙醚洗涤，低温红外干燥，得到浅黄色 固体，称重3.30g，产率:51%。
[0118] 表9实施例10所制备的配合物10的单晶结构数据
[0119]
[0121] 附图4为配合物10的单晶结构示意图。
[0122] 实施例11:
[0123] 配合物11的制备
[0124]
[0125] 类似实施例10的制备方法，采用0TB: CuCl2 = 2:1的当量反应得到配合物11。
[0126] 表10施例11所制备的配合物11的单晶结构数据
[0127]
[0128] 附图5为配合物11的单晶结构示意图。
[0129] 实施例12:
[0130] 苯并咪唑类配合物作为S0D1模拟物的电化学实验。
[0131] (1)实验仪器：
[0132] 电化学工作站(CHI600E)
[0133] (2)实验方法：
[0134] 2mM的配合物在含有0.1M电解质NaC104的DMF溶液中。工作电极为玻碳电极，辅助 电极为铂丝，参比电极选择Ag/AgCl，扫描速率50mV/S。所有测试严格保持无水无氧条件。
[0135] (3)实验结果分析：
[0136] 实验结果见附图6-16,由上述结果可见本发明提供的苯并咪唑类化合物分子具有 氧化还原的性质，且电势都在EQ2/Q2_ = -0.405〈E〈EQ2-/H2Q2 = 0.645范围之内，能够有效的催化 超氧阴离子，因此可以作为潜在的S0D1模拟物。
[0137] 实施例13:
[0138] 苯并咪唑类配合物作为S0D1模拟物活性检测的实验。
[0139] (D实验仪器：
[0140] UV紫外-可见分光光度计(Analytik-jena SPEC0RD-210)
[0141] (2)实验原理：
[0142] 在生物体内，S0D1能催化0厂歧化为H202和02，该反应很难直接检测到底物，所以利 用间接法测定S0D1的活性。本实验利用在有氧存在的条件下，核黄素 (Vitamin B2)能够与 氧作用得到〇2…。在光照作用下，加入硝基四氮唑蓝（p-Nitro-Blue tetrazolium chl〇ride，NBT)，与0厂反应得到另一种新的蓝色物质(在波长为560nm处有最大吸收）。当加 入S0D1时，能够加速降低0厂浓度，抑制氯化NBT的还原反应，降低蓝色物质的生成量。本实 验主要过程是改变加入S0D1样品液的体积，光照适当时间后，用酶标仪或紫外光度计测定 560nm处各样品液的吸收值。
[0143] 抑制率的计算公式为ri= (l-A/Ao)X 100%，式中Ao为空白反应液的吸光度，A为加 入模拟物后反应液的吸光度，不同浓度模拟物的A不同，SN不同。在一定范围内，S0D1酶的 活性与抑制NBT的还原相对百分率呈正比，利用这种关系，我们可以在Origin作图软件中， 以抑制率η对模拟物的浓度c作图，再通过相关曲线拟合的公式计算出S0D1酶活性。当n= 50%时，模拟物的浓度即为一个活性单位，记作IC 5Q。具体的原理见附图17。
[0144] (3)实验方法：
[0145] 取核黄素 0.5mL，TEMED 0.5mL，水 0.5mL 和 PBS lmL，37°C 恒温水浴 5 分钟，再加 NBT 2.5mL，摇匀，测其吸光度值。每光照1分钟测一次，连续测7分钟，同样方法把水换成配合物 或牛S0D1，每个样品浓度进行3次平行实验，取平均值计算。
[0146] (4)实验结果分析：
[0147] 表11苯并咪唑类化合物S0D活力值
[0148]
[0149] A5Q:当S0D1的活力还原为原来的一半时，抑制剂与S0D1的摩尔比
[0150] alunit=1000/IC50(yM_1)
[0151] 本实验中配合物具有相同的中心原子Cu，但铜的配位数不同和配体的立体结构不 同。由上述结果可见本发明提供的苯并咪唑类配合物分子具有良好的柔性和配位能力，且 分子构型与铜离子能够形成很好的配位，因此可以作为潜在的S0D1模拟物。因此本发明提 供的苯并咪唑类配合物具有铜锌超氧化物歧化酶(S0D1)模拟物的活性，并且与高氯酸铜配 位的配合物效果更优异。
[0152] 实施例14:
[0153] 苯并咪唑类配合物对植物体内活性氧(R0S，主要为02'_、0H ·和H2〇2)浓度调控的 检测。
[0154] (D实验仪器：
[0155] SPEC0RD 210型紫外-可见分光光度计（Germany，Analytik jena)，AK/QC_058离心 机，Leica倒置荧光显微镜(Germany)，Cary Eclipse荧光分光光度计，QHX-250BS-m型人工 气候箱
[0156] (2)实验方法：
[0157] A)秧苗培养液的配制
[0158] 分别取配合物适量，用lOOyL的DMS0溶解后，各配制成2ymol/L、20ymol/L、200y mol/L的溶液。
[0159] B)水稻秧苗的培养
[0160]挑选饱满的水稻种子（金优928,湖北荆州），分别用等量的所需溶液浸泡于烧杯 中，避光浸种72h后，将发芽的种子转移到装有蛭石的培养盘中，每穴3粒，在人工气候箱(温 度为29/24°C，光周期16h，相对湿度控制在60-80%)中培养，定时定量浇蒸馏水10天后，干 旱胁迫3天，所得水稻幼苗即可用于做实验。
[0161] C)水稻根中02- ·的检测
[0162] 采集培养好的水稻秧苗的根(每组各三份），用蒸馏水洗干净，滤纸吸干外面水分， 各称量0.1000g，剪碎，浸泡在2mL的PBS(0.01mol · L-lpH 7.8)缓冲液中，再加入111^的盐酸 轻胺(O.Olmol · L-1)，混勾，反应40min后，各取出1.5mL，加入lmL的4-氨基苯磺酸和lmL的 甲萘胺溶液，37 °C水浴反应10分钟。用紫外-可见分光光度计测528nm处的吸光度值。
[0163] D)水稻叶中H202的检测
[0164] 剪取水稻苗的第一和第二片叶(每组各三份)0.1500g，剪碎置于预冷的研钵中，加 入5mL预冷的三氯乙酸（0.001g · L-1)，冰上快速研磨后，在〇-4°C，10000g下离心20min两 次。取2mL的上清液，加入2mL的PBS(0.01mol · L-lpH 7.8)和5mL的KI(lmol · L-1)，混匀，反 应30min，用紫外-可见分光光度计，在340nm处测吸光度值。
[0165] E)水稻根中HO ·的检测
[0166] 用蒸馏水洗净水稻秧苗的根(每组各三份），滤纸吸干外面水分，各称量0.0500g， 剪碎，加入5mL的对苯二甲酸(0.0 lmo 1 · L-1)，36 °C水浴中反应40分钟后，过滤，取滤液，用 荧光光度计，测定426nm处的荧光强度。实验参数:激发波长Aex = 315nm，发射波长范围Aem =350- 550nm，入射狭缝/发射狭缝为5nm/5nm，PMT为800V。
[0167] (3)实验结果分析：
[0168] 实验结果见附图18-20,由图可知，不同浓度的苯并咪唑类配合物处理的水稻，分 析体内活性氧水平的变化，发现CV_、〇H ·和H202的水平相对于对照组明显降低，说明目标 配合物可以清除胞内〇广、0H ·和H2〇2,且02'0H ·和H2〇2的浓度水平变化与加入的配合物 浓度呈梯度递减的趋势，这进一步证实S0D1模拟物与胞内0 2''0H ·和H2〇2浓度水平之间存 在密切关系。通过分析胞内活性氧R0S(02''0H ·和H2〇2)浓度变化随配合物浓度之间的关 系，并结合配合物S0D1模拟物的活性实验结果，可知本发明提供的苯并咪唑类配合物能够 调控胞内活性氧R0S(0 2'0H ·和H2〇2)的浓度水平。
[0169] 实施例15:
[0170] 苯并咪唑类配合物对植物体内抗氧化酶活性测定实验。
[0171] (D实验仪器：
[0172] SPEC0RD 210型紫外-可见分光光度计（Germany，Analytik jena)，QHX-250BS-III 型人工气候箱
[0173] (2)实验方法：
[0174] 秧苗培养液的配制和水稻秧苗的培养同实施例5。
[0175] A)水稻组织内S0D活性分析
[0176] 表12反应系统中各试剂及酶液的加入量(mL)
[0177]
[0178] 取15个洗净干燥好的试管，按表3加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。各试 剂全部加入后，充分混匀，取1号管置于暗处，做参比，比色时调零用。其余均放在温度为25 °C，光强为3500LUX的光照箱内照光20min，然后立即遮光终止反应。用紫外-可见分光光度 计，测定560nm波长下的吸光度值，并记录结果。
[0179] B)水稻组织内CAT活性分析
[0180] 取3mL的PBS缓冲液（50mmol · L-lpH 7.0)，加入 100yL的H202溶液和 10yL的粗酶 液，混合均匀后，用紫外可见分光光度计，测240nm处的吸光度值。
[0181] C)水稻组织内APX活性分析
[0182] 取3mL的PBS缓冲液（50mmol · L-lpH 7.0)，加入5yL H202溶液，2.5yL Vc溶液和 15 yL的粗酶液，混合均匀，用紫外可见分光光度计，测在290nm处的吸光度值。
[0183] D)水稻组织内GR活性分析
[0184] 取3mL GR活性测试液，加入15yL的NADPH(3mmol · L-1)和15yL的粗酶液，混合均匀 后，用紫外可见分光光度计，测340nm处的吸光度值。
[0185] (3)实验结果分析：
[0186] 实验结果见图21-24,不同浓度梯度的配合物处理水稻，分析水稻胞内抗氧化酶 (500^?乂、0六1\61?等）的变化，发现抗氧化酶的相对于对照组明显升高，说明目标配合物有 助于增强抗氧化酶的水平，且抗氧化酶的水平变化与加入的目标配合物浓度呈递度递增的 趋势。通过分析胞内抗氧化酶水平变化随优选配合物浓度之间的关系，可见本发明提供的 苯并咪唑类配合物能够调控胞内抗氧化酶的水平。
[0187] 应理解本文所述的实施例和实施方案仅用于验证目的，并且提示本领域技术人员 根据它们进行各种变形或改变，而且这些变形或改变包括在本申请精神和范围以及待批权 利要求范围内。此外，本文披露的任意本发明的任意要素或限制或其实施方案可以与本文 披露的任意或所有其他要素或限制（单独或以任意组合方式)或任意其它发明或其实施方 案组合，且所有这些组合均属于本发明范围内，但不限于此。
【主权项】
1. 一种配合物及其药理学上可接受的盐、水合物、溶剂合物、前体药物，其特征在于:它 是以多苯并咪唑为配体的金属配合物，具体是：2. 如权利要求1所述的配合物作为铜锌超氧化物歧化酶(SODl)模拟物的应用。3. 根据权利要求1所述的配合物在制备调节农作物抗干旱胁迫药物中的应用。4. 根据权利要求3所述的配合物在制备调节水稻抗干旱胁迫药物中的应用。
【文档编号】C07F1/08GK106008561SQ201610226529
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】刘长林, 许琼, 马飞, 金烨
【申请人】华中师范大学