一种精制玻璃酸酶的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及从新鲜动物睾丸中提取玻璃酸酶的方法。
【背景技术】
[0002]玻璃酸酶又名透明质酸酶，在哺乳动物的睾丸里含量很丰富，能水解透明质酸，使其粘滞性明显下降，有利于受精时精子进入卵子。也存在于精子、颂下腺、蜂毒、蛇毒、皮肤、脾脏、水蛭及细胞的溶酶体中。
[0003]玻璃酸酶的稳定性较好，42°C加热60分钟活力不损失；100°C加热5分钟，活力可保留80%。受热失活后进行冷却可恢复部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍较稳定。在低浓度水溶液中较易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯胶或0.2%明胶保护。Fe2+、Cu2+对酶有可逆抑制作用，Pb2+、Hg2+、Ni2+等对酶活性没有明显影响。硫酸软骨素B (皮肤素)、硫酸类肝素、硫酸角质素、肝素及高浓度玻璃酸酶对酶均有抑制作用，但可被0.15mol/L氯化钠或硫酸鱼精蛋白所逆转。
[0004]药用玻璃酸酶为白色或微黄色粉末，无气味，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚、乙醇等有机溶剂。生化制药主要用牛、羊睾丸为原料进行提取制备。
[0005]低温乙醇法是1940年由美国哈佛大学医学院的Edwin J.Cohn教授发明的，因此又称为“孔氏法”。孔氏法最初用来分离牛血清白蛋白，随后应用于人血浆分离。1944年，白蛋白制品首次进行临床输注，用于抢救7名在日军偷袭珍珠港中严重烧伤的美国水兵，并由此开始了血浆蛋白制品的工业化生产。乙醇作为一种蛋白沉淀剂，具有许多优点:介电常数低、与水易混溶、在正常环境和工作条件下无易爆性、低分子量、化学上的相对惰性、低毒、价廉、易得和抑菌作用。至今，大规模血浆蛋白分离仍基本采用低温乙醇分离法。
[0006]国外50年代初已投入生产，并收载于英国和日本药典中，商品名Rondas。我国1965年正式投入生产，从羊睾丸中提取，收入1977版中国药典。王彦，周淑敏等曾在2002年15卷(1)期的《黑龙江医药》上发表了一篇名为《透明质酸酶提取工艺的研究》的论文，较详细的介绍了工业生产中从羊睾丸中提取玻璃酸酶的传统工艺以及在此基础上由他们改良的新工艺；李丹，郭育涛等曾在2011年8月第40卷第8期的《应用化工》上发表了一篇名为《牛睾丸中透明质酸酶提取工艺研究》的论文，介绍了用盐酸和乙酸的混合液溶解、硫酸铵盐析方法，从牛睾丸中提取玻璃酸酶的实验研究。国内传统工艺是用酸液溶解和硫酸铵盐析来提取玻璃酸酶粗品，粗品经透析、冻干得玻璃酸酶精品的，本发明提供了一种精制玻璃酸酶的制备方法，它包括以下步骤:糜浆、预处理、碾磨、热交换、二级离心、微滤、超滤、真空冷冻干燥、粉碎调制、成品。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种精制玻璃酸酶的制备方法，它包括以下步骤:糜浆、预处理、碾磨、热交换、二级离心、微滤、超滤、真空冷冻干燥、粉碎调制、成品。
[0008]所述的预处理步骤是:对采收的新鲜糜浆添加0.5%-1.0%的抗氧化剂，0.5%-1.0%的重金属螯合剂后，充分搅拌20-30分钟。
[0009]所述的碾磨步骤是:将预处理的糜浆倒入胶体磨中，充分磨碎，得到玻璃酸酶料液。
[0010]所述的热交换步骤是:玻璃酸酶料液通过板式换热器迅速降低温度至8-12°C，并且在此后的提取分离过程通过冷水循环系统维持料液在这个温度范围。
[0011]所述的二级离心步骤是:玻璃酸酶料液通过碟式离心机、管式离心机的不断连续分离，得到澄清的玻璃酸酶料液。
[0012]所述的微滤步骤是:玻璃酸酶澄清料液通过截留分子量为0.1-0.2 μ的微滤组件去除微生物和大分子量杂质。
[0013]所述的超滤步骤是:除菌除杂的玻璃酸酶料液通过截留分子量为8000-16000的超滤膜组件去除小分子量杂质和水，浓缩料液，体积比为4.0-5.0:1。
[0014]所述的真空冷冻干燥步骤是:将玻璃酸酶浓缩液放入真空冷冻干燥机或超低温冰箱(冷库)中速冻至温度为_30°C;开始抽真空，继续维持制冷2小时；将制冷变为加热，缓慢加热使料液温度上升至30°C时即得玻璃酸酶干燥固体。
[0015]所述的粉碎调制步骤是:玻璃酸酶干燥固体经过粉碎、添加辅料、混匀后就可以包装成不同规格的成品。
[0016]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
国内现有技术是用酸液溶解、硫酸铵盐析的方法来制取玻璃酸酶粗品，粗品经透析、冻干得玻璃酸酶精品；而本发明提供了一种精制玻璃酸酶的制备方法，它包括以下步骤:糜浆、预处理、碾磨、热交换、二级离心、微滤、超滤、真空冷冻干燥、粉碎调制、成品。本提取方法的特点是:通过预处理、热交换并保持提取过程在低温条件下进行，能有效减少长期高温等条件对酶活力降低的影响；通过碾磨将糜浆充分溶解在料液中，利于提高酶提取回收率；本方法提取的玻璃酸酶纯度高、效价高、热稳定性好，外观、理化、微生物限度等指标均达到或超过国内外相关药品标准；该方法工艺简单、生产成本低，产量高，可工业化生产。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0018]实施例1
本实施例的精制玻璃酸酶制造方法，它包括以下步骤:糜浆一预处理一碾磨一热交换—二级离心一微滤一超滤一真空冷冻干燥一调制、粉碎、成品。具体操作为:采收新鲜糜楽，添加0.5%的抗氧化剂、0.5%的重金属螯合剂，充分搅拌20分钟；将预处理的糜浆倒入胶体磨中，充分磨碎，得到玻璃酸酶料液；玻璃酸酶料液通过板式换热器降低温度至8°C，并且在此后的提取分离过程通过冷水循环系统维持料液在这个温度范围；玻璃酸酶料液通过碟式离心机、管式离心机的不断连续分离，得到澄清的玻璃酸酶澄清料液；玻璃酸酶澄清料液通过截留分子量为0.1 μ的微滤组件去除微生物和大分子量杂质；除菌除杂的玻璃酸酶料液通过截留分子量为8000的超滤膜组件去除小分子量杂质和水，浓缩料液，体积比为4.0:1 ;将玻璃酸酶浓缩液放入真空冷冻干燥机或超低温冰箱(