一种从牛睾丸中提取玻璃酸酶的方法
【专利摘要】本发明提供了一种从牛睾丸中提取玻璃酸酶的方法，采用酸液提取和硫酸铵盐析得玻璃酸酶粗品，粗品再经透析、热原处理、冻干得玻璃酸酶精品。本发明选用牛睾丸为原材料，采用高速离心提取方法，对玻璃酸酶进行分离和纯化，使玻璃酸酶效价可以达到340iu/mg。
【专利说明】一种从牛睾丸中提取玻璃酸酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地说涉及从新鲜动物睾丸中提取玻璃酸酶的方法。
【背景技术】
[0002]玻璃酸酶又名透明质酸酶，玻璃糖醛酸酶，玻璃样酸酶。它是水解透明质酸，使其分子量降低的一种蛋白酶，其用途极其广泛，已广泛应用于肿瘤检测、眼科手术及轻缺血损伤，缩小心肌梗死范围等领域。
[0003]由哺乳动物如牛、羊睾丸提取或微生物发酵制得的糖苷内切酶。白色无定形粉末或颗粒，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇和乙醚。最适pH值4.0~7.5。液态常温可稳定24h，5°C以下可稳定一周，100°C加热30min失活。催化透明质酸等酸性黏多糖水解，产生以丁糖为主的偶寡糖，使透明质酸的黏滞性明显下降，从而降低组织黏度，提高毛细血管和组织的通透性，加速细胞内外物质的扩散，是一种重要的药物扩散剂。
[0004]国外50年代初已投入生产，并收载于英国和日本药典中，商品名Rondas。我国1965年正式投入生产，从羊睾丸中提取，收入1977版《中国药典》。李丹，郭育涛等曾在2011年8月第40卷第8期的《应用化工》上发表了一篇名为《牛睾丸中透明质酸酶提取工艺研究》的论文，介绍了用盐酸和乙酸的混合液溶解、硫酸铵盐析方法，从牛睾丸中玻璃酸酶的实验研究。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供了一种从牛睾丸中提取玻璃酸酶的方法，采用酸液提取和硫酸铵盐析得玻璃酸酶粗品，粗品再经透析、热原处理、冻干得玻璃酸酶精品。
[0006]本发明采用如下具体步骤来实现上述目的:
[0007]1 提取:
[0008]将羊睾丸除内外皮层及付睾丸，绞成糜浆。称取糜浆，按每1kg糜浆加酸液
1.0-1.5L的比例，加酸液搅拌，浸出4小时后，将浸出液过滤，滤液调PH3.0~4.0。
[0009]取滤渣，按每Ikg开始加入的糜浆加酸液0.2-0.3L的比例，加酸液搅拌1小时后，再次过滤，滤液调pΗ3.0~4.0。
[0010]所述酸液为冰醋酸，盐酸，氯化钠和水的混合酸液。
[0011]2 粗制:
[0012]合并两次过滤液，在不断搅拌下，以每1L加硫酸铵220-240克的比例，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置12小时，过滤，留固体。量取滤液，在不断搅拌下，按1L滤液加硫酸铵240-280克的比例，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置12小时，过滤，合并两次固体，得粗品。
[0013]3 精制:
[0014]3.1 透析
[0015]粗品溶于少量水中，调pΗ3.5~5.0,以透析袋包扎，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时。
[0016]3.2热原处理:
[0017]将透析液离心10-20分钟，转速2800-3300r/min，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入滤液0.1体积的15%磷酸三钠(Na3PO4.12H20)溶液，在不断搅拌下，缓缓加入滤液0.06体积的20%醋酸钙(Ca(CH3COO)2^H2O)溶液，并以NaOH溶液调pH8_9，离心，时间10分钟~20分钟，转速2800-3300r/min。收集上清液，之后上清液调pH6.5~7.0。
[0018]3.3 冻干
[0019]将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品。
[0020]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
[0021]本发明技术，采用酸液溶解、硫酸铵盐析方法的基础上，增加透析技术、去热原操作，得到的玻璃酸酶效价更高，340iu/mg，且玻璃酸酶不含热原，药品质量符合国家质量标准。生产工艺简易、成本低，适合大规模工业化生产。该项成果有良好的经济效益和社会效益，它不但解决国内外医疗用药的需求，还为畜产品的综合利用开拓了新路，对畜牧业的发展有积极意义。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0023]实施例1
[0024]I 提取:
[0025]称取糜浆Ikg加酸液1.3L，搅拌浸出4小时后，将浸出液过滤，滤液调pH3.16。
[0026]取滤渣加酸液0.24L,搅拌I小时后，再次过滤，滤液调pH3.22。
[0027]2 粗制:
[0028]合并两次过滤液1.6L，在不断搅拌下，加入固体硫酸铵370g，完全溶解后静置12小时，过滤，留固体。量取滤液1.3L，在不断搅拌下，加入硫酸铵340g，完全溶解后静置12小时,过滤,合并两次固体,得粗品129.31g。
[0029]3 精制:
[0030]3.1 透析
[0031]粗品溶于少量水中，调pH3.7，以透析袋包扎，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时。
[0032]3.2热原处理:
[0033]将透析液离心20分钟，转速3200r/min，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入15%磷酸三钠(Na3PO4.12H20)溶液2ml，在不断搅拌下，缓缓加入20%醋酸钙(Ca(CH3COO)2.H2O)溶液1.2ml，并以NaOH溶液调pH8.5，离心，收集上清液，之后上清液调pH6.70。
[0034]3.3 冻干
[0035]将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品49.33g。
[0036]实施例2
[0037]I 提取:
[0038]称取糜浆IOkg加酸液13L，搅拌浸出4小时后，将浸出液过滤，滤液调pH3.42。
`[0039]取滤渣加酸液2.4L，搅拌I小时后，再次过滤，滤液调pH3.71。[0040]2 粗制:
[0041]合并两次过滤液15.8L，在不断搅拌下，加入固体硫酸铵3480g，完全溶解后静置12小时，过滤，留固体。量取滤液13.1L，在不断搅拌下，加入硫酸铵3150g，完全溶解后静置12小时，过滤，合并两次固体，得粗品1293.52g。
[0042]3 精制:
[0043]3.1 透析
[0044]粗品溶于少量水中，调pH4.5，以透析袋包扎，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时。
[0045]3.2热原处理:
[0046]将透析液离心15分钟，转速2900r/min，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入15%磷酸三钠(Na3P04.12H20)溶液20ml，在不断搅拌下，缓缓加入20%醋酸钙(Ca(CH3COO)2^H2O)溶液12ml，并以NaOH溶液调pH8.5，离心，收集上清液，之后上清液调pH6.75。
[0047]3.3 冻干
[0048]将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品496.2g。
[0049]经测算，实施例1中玻璃酸酶精品效价为346.29iu/mg,收率4.93% ;实施例2中玻璃酸酶精品效价为344.87iu/mg，收率4.96%。
[0050]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【权利要求】
1.一种从牛睾丸中提取玻璃酸酶的方法，其特征在于，采用酸液提取和硫酸铵盐析得玻璃酸酶粗品，粗品再经透析、热原处理、冻干得玻璃酸酶精品，所述玻璃酸酶精品的效价可以达到340iu/mg。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: (一)提取: 将牛睾丸除内外皮层及付睾丸，绞成糜浆，称取糜浆加酸液，搅拌、浸溃，过滤，滤液调PH ;取滤渣再加酸液，搅拌、过滤，滤液调pH ;所述酸液为冰醋酸，盐酸，氯化钠和水的混合酸液； (二)粗制: 合并两次过滤液，在不断搅拌下，加入固体硫酸铵，搅拌溶解，静置12小时，过滤，留固体；量取滤液，在不断搅拌下，加入固体硫酸铵，溶解，静置12小时，过滤，合并两次固体，得粗品； (二)精制: (1)透析 粗品溶于少量水中，调PH，以透析袋包扎，在磷酸盐-柠檬酸缓冲液中透析24小时； (2)热原处理: 将透析液离心，过滤，将滤液放冰浴中冷却，加入滤液0.1体积的15 %磷酸三钠(Na3PO4.12H20)溶液，在不断搅拌下，缓缓加入滤液0.06体积的20 %醋酸钙(Ca (CH3COO) 2.H2O)溶液，并以NaOH溶液调pH8_9，离心，收集上清液，之后上清液调ρΗ6.5 ~7.0 ; (3)冻干 将滤液冷冻干燥，即得无热原的玻璃酸酶精品。
3.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，第一次每Ikg糜浆加酸液1.0-1.5L，第二次酸液仍根据开始糜浆量加入，每Ikg糜浆加酸液0.2-0.3L。
4.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(一)中，酸液提取后调节滤液的pH值均为3.0~4.0。
5.权利要求书2所述的方法，其特征在于，在步骤(二)中，第一次每IL滤液加固体硫酸铵220-240克，第二次每IL滤液加固体硫酸铵240-280克。
6.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤(三)的(I)中的pH值调为3.5~5.0。
7.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤(三)的(2)中的透析液在过滤前以及调pH值至8-9后都要进行离心，离心时间:10分钟~20分钟，转速:2800~3300r/min。
【文档编号】C12N9/42GK103725659SQ201310625607
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年11月24日 优先权日:2013年11月24日
【发明者】刘乃山, 宋超龙, 葛翠凤, 刘翠珍 申请人:青岛康原药业有限公司