一种转录因子组及其制备方法、应用的制作方法

一种转录因子组及其制备方法、应用的制作方法
【专利摘要】一种转录因子组及其制备方法、应用。本发明涉及三种神经元再生相关转录因子Ascl1,Brn2,Pax6的重组慢病毒载体及其构建和应用。具体地，本发明利用PCR方法获取Ascl1,Brn2,Pax6目的基因，以pGC-LV-GFP为重组载体，插入合成的三种目的基因DNA片段，构建了分别含Ascl1,Brn2,Pax6的GFP报告基因内置的重组慢病毒质粒pGC-GFP-Ascl1，pGC-GFP-Brn2，pGC-GFP-Pax6。经慢病毒包装后，将三种重组慢病毒质粒分别转染293T细胞，培养后获得三种重组的慢病毒颗粒LV-Ascl1，LV-Brn2，LV-Pax6，并经超速离心浓缩病毒颗粒，测定包装病毒滴度。因此，本发明可以应用于阿尔茨海默病的基因治疗，为患者提供新的安全有效的治疗途径。
【专利说明】—种转录因子组及其制备方法、应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及医药及基因工程领域。更具体地，本发明涉及三种神经元再生相关转录因子Ascll, Brn2和Pax6的重组慢病毒载体及其构建,还涉及三种神经元再生相关转录因子Ascll，Brn2和Pax6重组慢病毒载体在阿尔茨海默病基因治疗中的应用。
【背景技术】:
[0002]阿尔茨海默病(AD)又称老年痴呆症，是全球最受关注的神经退行性疾病之一。AD是一种进行性高级认知功能障碍和记忆功能丧失为特征的疾病。研究表明，AD发病率随年龄增长而增加，65岁的发病率约0.5%，85岁以上可达8%。随着我国逐步进入老龄社会，老龄化趋势将使老年痴呆患者数量增多，给个人、家庭和社会带来沉重的经济和心理负担。尽管AD的发病机制尚未完全清楚，但大量研究表明β淀粉样蛋白沉积，神经原纤维缠结，慢性神经炎症，大量神经细胞变性坏死等在AD发生发展过程中发挥重要作用。目前还没有任何一种治疗方法能够有效的阻止或者逆转阿尔茨海默病疾病进展。阿尔茨海默病临床上治疗仍处于药物局限、疗效欠佳的阶段。因此，发展新的治疗技术和方法是摆在人们面前亟待解决的问题。
[0003]随着分子生物学以及医学生物工程的飞速发展，使基因治疗中枢神经系统疾病越来越趋近现实。阿尔茨海默病基因治疗作为一种新型的治疗手段，已经成为神经科学研究的热点。近年来已有研究表明，将特定组合的转录因子通过一定途径异位表达于终末分化的体细胞中，可将这些体细胞直接诱导分化成特定的功能细胞，完成细胞谱系之间转换，而不需要重编程为多能性干细胞后再分化为有功能的体细胞，是基因治疗研究的重大突破。因而，利用外源转录因子基因治疗阿尔茨海默病是一种较为理想的策略。
[0004]Magdalena研究团队研究证实转录因子Pax6过表达于小鼠的胶质细胞中能引起胶质细胞诱导转化为神经元的潜能(HeinsNetal., 2002)。2010年，Vierbuchen等从19个特异表达于神经组织或与细胞谱系转换重编程相关的基因中筛选出Ascll，Brn2，Mytll基因，通过病毒介导的异位表达，成功地将胚胎和产后小鼠成纤维细胞转化为诱导型神经细胞，这些诱导的神经细胞能够表达多种神经元特异性蛋白，产生动作电位，形成功能性突触(Vierbuchenetal.，2010)。Heinrich领导的研究团队通过研究发现星形胶质细胞在转入转录因子Neur0g2或者Dlx2后能够直接分化为谷氨酸能神经元或者Y -羟基丁酸能神经元，第一次证实了通过选择不同的转录因子能够将体细胞直接诱导转化为不同亚型的神经元(Heinrichetal., 2010)。2011年Caiazzo研究小组实验证明实验发现，人成纤维细胞在转入3个转录因子组合(Ascll、NurrU Lmxla)后，能够直接转分化为诱导型多巴胺能神经元，且具有产生多巴胺的功能(Caiazzoetal.，2011)。2012年，Liu等实验证实,将人纤维细胞用病毒介导过表达五种转录因子(Mashl, Ngn2, Sox2, NurrI, Pitx3),可诱导其转化为多巴胺能神 经元，且进一步的大鼠体内试验表明其能够缓解帕金森病大鼠的症状，可作为帕金森患者潜在的治疗策略(Liuetal.，2012)。Karow等通过反转录病毒将转录因子Sox2和Mashl过表达于大脑皮质周细胞，能够将其再编程转化为诱导神经元，实现自体细胞之间的直接转化，进一步为转录因子用于中枢系统神经退行性变基因治疗提供了可能(Goritzetal.，2011)。研究显示，单一的转录因子诱导生成的神经元功能可能尚不完善，即只具备神经细胞特征，不具备神经元功能或神经元功能不完善，故不能用于临床。并且由上所述可知特定的细胞如胶质细胞，成纤维细胞等，需要特定转录因子诱导；
[0005]转录因子Ascl 1，Brn2, Pax6等参与神经组织且与细胞谱系转换重编程，并且与其他相关基因在体外实验中被证实参与神经细胞转化、再生相关，但用于基因治疗阿尔茨海默病却仍然有很大难度。其原因可能有，首先，中枢神经系统主要有神经元与神经胶质细胞构成，神经元具有不可再生的特性，虽然细胞谱系转换重编程可以将机体体细胞诱导转化为神经元用于中枢神经系统退行性变的治疗，且多种转录因子联合诱导转化的神经元可具有一般神经元所具有的的特征和功能，但选择合适转录因子组合成为难题。目前，虽然Ascll, Brn2,Pax6等基因在实验中被证实参与神经细胞转化、再生相关，但是尚未见有报道此三者转录因子组合形式诱导胶质细胞转导为神经元的报道；再者，基因治疗需要合适、安全的基因载体，且通过有效可行的途径实施。慢病毒是一种逆转录病毒载体，不但能感染分裂期的细胞并整合到其基因组中，而且还可以感染非分裂期的细胞，具有容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等优点，其作为基因治疗载体已被广泛应用。但现有技术也表明尽管慢病毒载体的研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。首先，重组病毒的滴度还不够高，均在IO1TUAiI~103TU/ml之间，难以达到体内应用的需要；其次，由于HIV复杂的生物学性质，要像常用的小鼠逆转录病毒载体那样建立稳定的HIV载体包装细胞十分困难，已建立的包装细胞均不理想。
[0006]本发明利用慢病毒作为 基因载体建立转录因子Ascll, Brn2，Pax6重组慢病毒颗粒，用于治疗阿尔茨海默病小鼠，观察小鼠空间记忆能力改善情况。

【发明内容】
:
[0007]本发明的目的是在于提供三种神经元再生相关转录因子Ascll，Brn2, Pax6，其作为特异表达于神经组织且与细胞谱系转换重编程相关的基因，能够诱导细胞谱系之间转换，具有诱导神经元再生的能力。
[0008]本发明的另一目的是在于提供三种转录因子基因重组慢病毒载体的制备方法，将转录因子Ascl 1，Brn2, Pax6基因分别克隆于慢病毒转移载体pGC_L_GFP，获得重组慢病毒质粒 pGC-L-GFP-Ascll, pGC-L-GFP-Brn2, pGC_L-GFP_Pax6，进而与包装质粒载体pHelperl.0和pHelper2.0共转染293T细胞，培养获得包装重组慢病毒颗粒LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6。并经超速离心浓缩病毒颗粒，测定包装病毒滴度。
[0009]本发明的另一目的是在于将制备好的三种转录因子重组慢病毒颗粒注入阿尔茨海默病小鼠模型的双侧海马中，观察混合的三种病毒载体颗粒治疗后模型小鼠的空间记忆学习能力的改变情况。
[0010]为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施:
[0011]三种神经元再生相关转录因子Ascll, Brn2, Pax6的制备方法,其步骤是:
[0012]目的基因Ascll, Brn2，Pax6的DNA片段的合成:参照Genbank小鼠Ascll, Brn2, Pax6基因序列，设计目的基因引物，提取、扩增、纯化Ascll, Brn2, Pax6的DNA片段。[0013]将目的基因片段插入带有报告基因GFP的慢病毒转移载体pGC-L-GFP，经病毒包装后，与包装质粒载体pHelperl.0和pHelper2.0共转染293T细胞，培养获得包装重组慢病毒颗粒LV-Ascll，LV-Brn2, LV_Pax6。同样方法获得的慢病毒LV-GFP作为对照。
[0014]将收集的上清液离心后经滤膜过滤，继而进一步超速离心获得纯化的慢病毒颗粒，进一步测定包装病毒滴度。
[0015]三种转录因子重组慢病毒颗粒在阿尔茨海默病基因治疗方面的应用。其步骤是:
[0016]为了评价三种重组慢病毒颗粒LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6在阿尔茨海默病基因治疗方面的作用，我们选取阿尔茨海默病小鼠模型作为实验对象，观察其经经慢病毒颗粒治疗后，空间记忆学习能力的改变情况。 [0017]我们将三种重组慢病毒颗粒LV-Ascl 1，LV-Brn2, LV_Pax6按照1:1:1的比例混合(病毒滴度l*108TU/ml)，继而将混合后的病毒混合液通过立体定向注射仪注入模型组的小鼠双侧海马中，对照组给予生理盐水，模型组给予慢病毒LV-GFP作为对照。
[0018]混合病毒注射后一周，通过水迷宫实验观察各组小鼠空间记忆学习能力的改变情况，评价三种重组慢病毒颗粒LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6在改善阿尔茨海默病空间记忆学习能力方面的作用。图1为四组小鼠经重组慢病毒颗粒LV-Ascl 1，LV-Brn2, LV-Pax6治疗后水迷宫实验结果。
[0019]本发明中提及的神经胶质细胞，或简称胶质细胞，胶质细胞比神经元多，在哺乳类，二者的比例约为十比一，胶质细胞没有神经传导能力，但对神经元的正常活动与物质代谢都有重要作用。
[0020]有益效果:
[0021]1、现有技术表明，β淀粉样蛋白沉积、大量的神经胶质细胞增生、神经元死亡是阿尔茨海默病发生发展过程中的主要病理变化过程。本发明首次成功的利用转录因子Ascll, Brn2, Pax6介导神经胶质细胞转化为诱导神经元以及其进一步治疗阿尔茨海默病。具体本发明通过慢病毒技术包装此三种Ascll, Brn2, Pax6基因，并将其整合到神经胶质细胞的基因组中，发挥其神经元诱导转化的作用。在机体水平能够诱导神经元转化再生，改善阿尔茨海默病小鼠的空间学习记忆能力。
[0022]2、本发明采用的是基因治疗途径，即将重组的三种转录因子慢病毒表达载体直接导入小鼠双侧海马，我们观察到小鼠空间学习记忆能力明显提高，并且不良反应少，效果肯定，为阿尔茨海默病治疗提供新的思路。
[0023]3、现有技术表明尽管慢病毒载体的研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。首先，重组病毒的滴度还不够高，均在IO1TUAiI~103TU/ml之间，难以达到体内应用的需要；其次，由于HIV复杂的生物学性质，要像常用的小鼠逆转录病毒载体那样建立稳定的HIV载体包装细胞十分困难，已建立的包装细胞均不理想。而本发明重组的滴度2*108TU/ml，达到了体内给药应用的需要。
[0024]4、慢病毒载体具有感染谱广、效率高、免疫原性较低等特点，感染后可长期、稳定地表达外源基因；
【专利附图】

【附图说明】
[0025]图1.水迷宫实验中定位航行试验结果分析图(逃避潜伏期数据结果);[0026]图2.水迷宫实验中的空间探索实验结果分析图；如图2A为穿台次数数据结果，图2B为第四象限穿越频率结果分析图。
【具体实施方式】
[0027]以下结合具体实例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0028]实施例1:三种神经元再生相关转录因子Ascll, Brn2, Pax6的重组慢病毒表达载体的构建根据目的基因Ascll, Brn2, Pax6的DNA片段的合成:根据人Ascll (Genbank登录号:NM_008553)，Brn2 (Genbank 登录号:NM_008899)，Pax6 (Genbank 登录号:NM_008899)基因序列，设计目的基因引物，其序列如下:
[0029](I) Ascll:5，_caagagcgcagccttag_3，；3，_gcaaaagtcagtgctgaacg_5，?
[0030](2) Brn2:5，-aataaggcaaaaggaaagcaact-3J !3，-caaaacatcattacctgct-5J ；
[0031](3) Pax6:5，-gccagcaacacacctagtca-3J ;3，-ggggaaatgagtcctgttga-5J?
[0032]采用含有转录因子Ascll，Brn2，Pax6目的基因的DNA序列的基因片段，该基因片段由人cDNA文库(上海英基生物科技有限公司)购买得到，对Ascll，Brn2, Pax6目的基因进行PCR扩增，获得PCR产物(PCR试剂盒购自Takara公司).[0033]PCR 扩增反应体系(25ul):10*buffer2.5ul，引物(10pmol/ul)各 0.5ul，dNTP(10mmol/L) 2ul,DNA聚合酶(2.5U/ul) 0.4ul, DNA模板lul,加双蒸水补至25ul ;具体反应程序参照试剂盒的说明书。
[0034]PCR 反应条件:94°C变性 5min ；(94°C 45sec，60°C 45sec，72°C 60sec) 32 个循环；72°C IOmin。
`[0035]反应结束后，将扩增后经纯化所得的目的基因DNA片段克隆于含有报告基因GFP的慢病毒转移载体pGC-L-GFP (购自上海吉凯基因化学技术有限公司)的相应位点，构建重组慢病毒质粒 pGC-L-GFP-Ascll, pGC-L-GFP_Brn2，pGC_L-GFP_Pax6 (上海吉凯基因化学技术有限公司构建)，用于制备慢病毒包装质粒。
[0036]实施例2:重组质粒慢病毒包装
[0037]1.病毒包装步骤
[0038]慢病毒表达载体根据Zhou等(ZhouLetal.，2010)介绍的方法构建。通过脂质体法 Lipofectamine2000 将重组慢病毒质粒 pGC-L-GFP-Ascll, pGC-L-GFP_Brn2，pGC-L-GFP-Pax6 与慢病毒包装质粒 pHelperl.0 (Invitrogen 公司，cat.N0.11668-500)和 pHelper2.0(Invitrogen公司，cat.N0.11668-500)共转染293T细。72小时后收集上清，同时补加生长液，12小时后再次收集上清液，获得三种重组慢病毒颗粒LV-Ascll，LV-Brn2, LV_Pax6。
[0039]2.病毒的收获及浓缩具体步骤
[0040]将步骤I获得的上清液于4°C，4000g离心10分钟后，去除细胞碎片，再经0.45um滤膜过滤上清液于40ml超速离心管中；将病毒粗提液样品加入到过滤杯中，将过滤杯插到过滤液收集管中，经4000g超速离心至病毒浓缩体积。离心结束后，取出离心装置，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心力不超过lOOOg，离心时间2分钟。样品收集杯中即为病毒浓缩液；将病毒浓缩液移出，分装保存病毒管中，_80°C保存。取其中一管做病毒生物学滴度测定。[0041]3.慢病毒滴度检测具体步骤
[0042]采用逐孔稀释滴度测定法，在测定前一天，为测定滴度所需的细胞铺板，每孔加4*104个细胞，体积为IOOul ;根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的Ep管，在每管中加入90ul的无血清培养基；取待测定的病毒原液IOul加入第一管中，混匀后取IOul加到第二个管中，继续相同的操作到最后一管；选取所需的细胞孔，吸取90ul培养基，丢弃，加入90ul稀释好的病毒溶液，放入培养箱培养；24小时后，加入完全培养基IOOu ；4天后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随着稀释倍数的增加而减少。滴度检测结果2*108TU/ml。
[0043]实施例3:三种转录因子重组慢病毒颗粒在阿尔茨海默病基因治疗方面的应用
[0044]选取40只成年的雄性C57BL6小鼠，随机分为四组，设置为空白对照组、阿尔茨海默病模型组、高剂量病毒治疗组、低剂量病毒治疗组，模型组小鼠以及治疗组给予A β 1-42(购自一)立体定向注射于小鼠双侧海马，空白对照组予以无菌生理盐水。Αβ 1-42造模前三天，将三种重组慢病毒颗粒LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6按照1:1:1的比例混合(病毒滴度l*108TU/ml)，混合后的病毒混合液2ul通过立体定向注射仪注入治疗组小鼠双侧海马中，空白对照组和模型组分别给予同剂量的无菌生理盐水和慢病毒LV-GFP作为对照。
[0045]三种转录因子重组慢病毒颗粒混合液治疗后一周，将四组小鼠进行为期七天的水迷宫实验，记录小鼠逃避潜伏时间，穿越特定象限频率，穿越实验中设置平台的次数等数据，进行统计分析，评价这三种重组慢病毒颗粒LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6在改善阿尔茨海默病空间记忆学习能力方面的作用。
[0046]结果显示:较模型组小鼠而言，经三种转录因子重组慢病毒颗粒混合液治疗的小鼠，逃避潜伏期明显缩短(图1)，穿台次数数(图2A)和第四象限穿越频率(图2B)显著增加，说明治疗后小鼠空间学习记忆能力显著增强，疗效肯定；同时，实验小鼠并未表现出明显的不良反应，且未见小鼠死亡`，说明了该治疗方式分安全性可以得到保证。因此，本发明可以应用于阿尔茨海默病的基因治疗，为患者提供新的安全有效的治疗途径。
【权利要求】
1.一种转录因子组，其特征在于所述的转录因子组由Ascll、Brn2和Pax6构成,其介导神经胶质细胞转化为诱导神经元。
2.一种含有权利要求1所述的转录因子组的重组慢病毒载体。
3.根据权利要求2所述的转录因子组的重组慢病毒载体的构建方法，其特征在于，通过以含绿色荧光蛋白GFP报告基因的pGC-L-GFP的质粒为载体，分别插入Ascl 1，Brn2, Pax6基因片段，构建三种含Ascll，Brn2，Pax6基因片段和绿色荧光蛋白GFP报告基因的PGC-L-GFP-Ascll，pGC-L-GFP-Brn2，pGC-L-GFP-Pax6 的重组质粒，与包装质粒载体pHelperl.0和pHelper2.0共转染293T细胞，培养获得包装重组慢病毒颗粒，命名为LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6。
4.根据权利要求3所述的转录因子组的重组慢病毒载体的构建方法，其特征由以下步骤实现: Cl)制备含有目的基因Ascll, Brn2, Pax6的DNA片段； 根据 Genbank 登录号:NM_008553, Genbank 登录号:NM_008899, Genbank 登录号:NM_008899记载的基因序列，设计目的基因引物，其序列如下:
Ascll:5，_caagagcgcagccttag_3，；3，_gcaaaagtcagtgctgaacg_5，。
Brn2:5’ -aataaggcaaaaggaaagcaact-3? ;3’ -caaaacatcattacctgct-5?；
Pax6:5，-gccagcaacacacctagtca-3? ;3，-ggggaaatgagtcctgttga-5?; (2)扩增、纯化Ascl`l,Brn2, Pax6基因的目的片段； (3)通过pGC-L-GFP载体质粒制备重组慢病毒质粒pGC-L-GFP-Ascll，pGC-L-GFP_Brn2，pGC-L-GFP-Pax6 ； (4)与包装质粒载体pHelperl.0和pHelper2.0共转染293T细胞，培养获得包装重组慢病毒颗粒，命名为 LV-Ascll, LV-Brn2, LV_Pax6。
5.根据权利要求2所述的转录因子组的重组慢病毒载体，其特征步骤(4)中获得慢病毒滴度为2*108TU/ml。
6.根据权利要求2所述的转录因子组的重组慢病毒载体在制备治疗阿尔茨海默药物中的应用。
【文档编号】C12N15/12GK103773771SQ201310625388
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】赵鹏, 顾爱华, 陈品, 颜青, 邹鹏, 王松涛 申请人:南京医科大学