一种棉花wrky类转录因子及应用的制作方法

专利名称：：一种棉花wrky类转录因子及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于植物基因工程
技术领域：
，具体涉及一种棉花新的WRKY类转录因子(GbffRKYl)及其编码基因与应用。其编码基因的cDNA序列如SEQIDNO:1所示；其编码基因的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。功能验证表明该基因能促进磷转运类蛋白的表达与功能，能够使拟南芥提高对低磷营养缺乏的耐性。利用本发明克隆的基因GbWRKYl，通过遗传转化可应用于磷高效利用植物的培育。
背景技术：
：磷是植物生长发育必需的大量元素之一，在植物的生长发育和新陈代谢过程中发挥着非常重要的作用。磷是核酸和磷脂的结构成分，光合磷酸化和ATP合成的底物，而且也是光合作用产物的关键成分。但是由于磷在土壤中的含量较低，同时磷素(po43_，HPO42-,H2PO4O在酸性与碱性土壤中的能被强烈固定，使得土壤中可以被植物吸收利用的有效磷浓度极低(RaghothamaKG,Phosphateacquisition,Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.1999.50:665—693)。土壤极低的有效磷严重束缚了农作物的产量，成为很多地区制约农作物生产的重要因素。植物磷信号响应的信号传导机制的研究进展表明在植物体内磷信号调控的方式也是非常复杂的。近年来植物基因芯片的运用，加速了研究者对这个信号路径的认识。研究发现在磷饥饿的早期阶段，好几类家族的转录因子可能参与了对磷饥饿反应的调控，目前已有两个在低磷胁迫反应中有调控功能的WRKY类转录因子在拟南芥中被克隆。研究表明AtWRKY6通过调控PHOl基因的表达参与植物响应低磷胁迫。在低磷胁迫条件下，AtffRKY6过量表达拟南芥具有类似phol突变体低磷敏感表型，生长明显受到抑制，叶色发紫，根部和地上部的磷含量明显低于野生型。Northernblot和烟草瞬时转化实验表明，AtffRKY6负调控PHOl基因的表达。低磷条件下的ChIP实验表明，在低磷胁迫条件下AtWRKY6不能结合到PHOl启动子的W_box结构；而Westernblot结果表明，低磷胁迫条件下AtWRKY6蛋白被降解，并且该蛋白降解能被蛋白酶体抑制剂MG132所抑制。这些实验结果表明植物体内可能存在以下响应低磷胁迫的调控机制:在正常供磷条件下，WRKY6结合到PHOl启动子上的W-box结构，进而抑制PHOl基因的表达；在低磷胁迫条件下，WRKY6蛋白被降解，解除了对PHOl基因的抑制作用，PHOl基因表达增强，以使植物能在一定程度上提高其耐受低磷胁迫的能力(Chen等，TheWRKY6transcriptionfactormodulatesPHOSPHATEIexpressioninresponsetolowPistressinArabidopsis，PlantCell.2009.21:3554-3566.)。AtffRKY75基因在拟南芥植株缺磷时被强烈诱导，该基因的RNAi干涉株系在低磷条件下积累的花青素更多，但是IPS基因受低磷诱导表达的程度降低，磷的吸收也受到影响；正常磷浓度和低磷条件下RNAi转基因株系的侧根长度和数目均高于野生型，根毛的数目也比野生型的显著增加，RNAi抑制植株的遗传学分析证实其在拟南芥缺磷反应中起调控作用(Devaiah等，WRKY75transcriptionfactorisamodulatorofphosphateacquisitionandrootdevelopmentinArabidopsis，PlantPhysiol.2007.143:1789-1801.)。但AtWRKY75超量表达后是否会增强植物对磷的吸收或利用效率以及其他对植物发育的影响还未有报道，其他植物中也未有分离与AtWRKY75高度同源并参与磷利用调节与发育调控的报道。棉花是一种重要的经济作物，同时也是生物技术应用范围比较广的农作物。棉花的生物成分和基因组都很复杂，对棉花的基因克隆和功能验证相对于其他植物困难较大。因此本发明所涉及的基因的功能验证主要在模式植物拟南芥中完成的。在本发明申请人前期研究工作中得到一个克隆自海岛棉(Gossypiumbarbadense)可能参与棉花抗病反应的基因，通过序列比对发现其与拟南芥AtWRKY75具有55%的相似性，命名为GbWRKYl(Xu，L.等.DifferentialGeneExpressioninCottonDefenceResponsetoVerticilliumdahliaebySSH.JournalofPhytopathology,2011,159:606-615)。通过该基因在拟南芥中超量表达验证表明GbWRKYl基因与低磷胁迫反应相关。申请人认为利用本发明的基因可促进植物磷营养高效利用，缓解植物的逆境胁迫反应，有利于缓解环境压力，提高土地利用率，对农业的可持续性发展具有极其重要的理论和现实意义。
发明内容本发明的目的是从海岛棉‘海7124’中分离克隆一个包含该功能蛋白同源基因完整编码区段的DNA片段(在本发明中所述“DNA片段”与“核苷酸序列”以及“DNA分子”同义，下同)，这个基因参与植物调节磷高效吸收与利用。对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明它与拟南芥WRKY类基因具有较高的同源性，因此被命名为GbWRKYl基因，利用这个基因可以缓解植物的低磷逆境胁迫反应，在正常和低磷培养条件下提高植物体内无机磷的含量20-30%。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:本发明涉及分离和应用一种包含GbWRKYl基因的DNA片段，该片段具有调控植物磷营养高效吸收与利用的能力。其中，所述的GbWRKYl基因是下列核苷酸序列之一:I)序列表SEQNO:1中第1-957位所示的DNA序列；或2)序列表SEQNO:1中第69-669位所示的DNA序列同源性超过60%的DNA类似物；或3)具有与SEQIDN0.2所示氨基酸序列的蛋白质，或具有与SEQIDN0.2序列相同活性且同源性超过60%的蛋白质。一种分离的基因的cDNA，所述的核苷酸序列含有表达载体p35s_GbWRKYl。所述的表达载体为植物表达载体pCAMBIA2300。一种分离的基因cDNA在提高拟南芥的磷营养利用效率中应用，其应用过程是:可以采用已经克隆的GbWRKYl基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样,也可以米用PCR(PolymeraseChainReaction)技术,从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的GbWRKYl基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含GbWRKYl基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中过量表达的载体连接后转化植物，可获得花药发育受到影响的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子、特异启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。携带有本发明GbWRKYl基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化,微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998,MethodforPlantMolecularBiologyVIII,AcademyPress,NewYork,pp.411—463；GeisersonandCorey,1998,PlantMolecularBiology(2ndEdition)。本发明的优点有:1.本发明克隆的GbWRKYl基因具有调控植物磷营养高效利用，能有效缓解拟南芥的低磷胁迫反应。本发明有助于研究棉花中磷信号传递的分子机制，同时能够利用基因工程技术有目的提高低磷胁迫抗逆能力。2.本发明能够利用基因工程技术有目的提高拟南芥的低磷胁迫抗逆能力，有利于缓解低磷胁迫的环境压力。3.无论在正常培养条件下还是在缺磷培养条件下，GbWRKYl超量表达转基因拟南芥植株根系及地上部分的总无机磷含量都比野生型高20-30%。图1为一种采用ClustalW软件(公开使用软件)对GbWRKYl编码序列与拟南芥中的WRKY编码序列进行比对结果示意图。通过聚类分析表明，GbWRKYl编码序列与拟南芥中的WRKY编码序列中的AtWRKY75同源性最近(图1A);图1B表明GbWRKYl与拟南芥中的AtWRKY75在氨基酸上水平上具有55%的同源性。图2为一种基因所使用的超量表达载体p35S:=GbffRKYl的构建示意图。图3为一种GbWRKYl超量表达转基因拟南芥T2植株GbWRKYl基因表达量检测示意图。第I个泳道为野生型拟南芥对照，第2个至第10个泳道为转基因拟南芥的9个不同系。结果表明，不同转基因系中基因的表达量有所差异。Actinl是拟南芥的肌动蛋白基因，作为内参基因以参考各样品的上样量是否一致。图4为一种GbWRKYl超量表达转基因拟南芥低磷处理下地上部表型分析示意图。图中:A野生型和转基因拟南芥在低磷处理7天后的表型；B野生型和转基因拟南芥在低磷处理7天后花青素含量的测定。在低磷逆境胁迫处理下，野生型拟南芥会表现出花青素积累而使植株叶片产生紫红色的现象。GbWRKYl超量表达转基因拟南芥的花青素积累相对野生型明显减少，缓解了拟南芥的低磷胁迫反应。图5为一种GbWRKYl超量表达转基因和野生型拟南芥组织中无机磷含量检测示意图。分别测定在正常培养和低磷培养下转基因和野生型拟南芥根、叶中无机磷的浓度。图中:在正常培养情况下，无论在根还是叶中，转基因拟南芥中积累的无机磷含量都高于野生型；在低磷的情况下，转基因拟南芥中的无机磷含量仍高于野生型。图6为一种低磷诱导相关基因和高效磷转运相关基因在GbWRKYl超量表达转基因拟南芥中的表达分析示意图。图中:A受低磷诱导的部分基因表达分析。At4，At590354；ACP5,At3gl7790；RNS1,At2902990；IDS4,At5920150.B磷高效转运基因表达分析。PTl,At5943350；PHT1.6，At5943340；PHT1.8，Atlg20860；PHT3.2，At3948850。具体实施例方式以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有GbWRKYl基因完整编码区段的DNA片段，以及验证GbWRKYl基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。实施例1GbWRKYl基因的分离克隆本申请人在作物遗传改良国家重点实验室的前期工作中从海岛棉‘海7124’材料中克隆得到一个EST序列(Xu,L.等.DifferentialGeneExpressioninCottonDefenceResponsetoVerticilliumdahliaebySSH.JournalofPhytopathology,2011,159:606-615)。对这条序列在NCBI基因库中进行tBLASTx比对，发现这个序列可能是一个植物类所特有的WRKY类转录因子。这条EST序列没有包含完整地开放读码框，我们采用RACE(rapid-amplificationofcDNAends)法通过PCR进行cDNA末端快速克隆技术以得到这个基因完整的编码序列。1.海岛棉‘海7124’幼根的总RNA提取及cDNA的获得:从海岛棉‘海7124’幼根中提取总RNA(提取方法根据Zhu等AnimprovedsimpleprotocolforisolationofhighqualityRNAfromGossypiumspp.suitableforcDNAlibraryconstruction.ActaAgronomicaSinica.2005,31.1657-1659.),利用反转录酶SuperscriptIII(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA,反应条件为:65°C5min,50°C60min,70°CIOmin02.棉花GbWRKYl基因全长序列的获得:米用RACE(rapid-ampIificationofcDNAends)(Frohman等，Rapidproductionoffull-lengthcDNAsfromraretranscripts:amplificationusingasinglegene-specificoligonucleotideprimer.PNAS1988,85,8998-9002.)分别扩增出GbffRKYl的5’和3’端，采用的引物序列分别为GbWRKYlra-5(5'CCTTCCCAATGCCTAATTAACCAAGGG3')和GbWRKYlra-3(5'CCGATGCACACATGAAGGATGCAAAG3')。PCR条件为94°C预变性3min；94°C30sec，68°CImin30sec，30个循环；72°C延伸lOmin。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-Τ载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序。将序列拼接后得到GbWRKYl的cDNA序列(SEQIDN0.1)，一种分离的基因的cDNA，其序列为SEQIDN0.1所不的核苷酸序列。再通过ORFFinder(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)对获得的cDNA进行分析，确定包含一个完整的0RF，其表达的蛋白为SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。通过BlastX(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)确定ORF所对应的166个氨基酸的蛋白质序列(SEQIDN0.2)与拟南芥AtWRKY75(AT5G13080)相似性较高，因此被命名为GbWRKYl基因(图1)。实施例2:棉花GbWRKYl基因植物超量表达载体的构建根据得到的SEQIDN0.1设计引物用于构建表达载体，在引物两端分别加上SacI和XbalI的酶切位点及保护碱基，引物序列分别为GbWRKYl_F(5’ATGGAACCTTGTGTTGGTAATAAG’)和GbWRKYl-R(GTATCAGATGAAGATGGGGTTTCAGAAGGGAGT)以GbWRKYl基因的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应条件为:94°C预变性3min；94°C30sec，58°C30sec,72°Clmin，32个循环；72°C延伸lOmin，经PCR扩增得到包含完整ORF的PCR产物。PCR产物经限制性内切酶SacI和XbalI(购自NEB公司，美国)双酶切(Buffer4+BSA,37度2小时)后通过电泳利用DNA回收试剂盒回收(购自Qiagen公司，美国)。将植物表达双元载体pCABIA2300S(pCAMBIA2300S载体的前体是由澳大利亚CAMBIA实验室CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture惠赠的PCAMBIA2300。将CaMV35S启动子通过酶切连接反向整合到pCAMBIA2300的多克隆位点上，即得到本发明的所用载体PCAMBIA2300S)同样用SacI和XbalI(购自NEB公司，美国)双酶切(Buffer4+BSA,37度2小时)并经DNA回收试剂盒(购自Qiagen公司，美国)回收大片段。使用T4DNA连接酶(NEB公司)将PCR回收产物IOOng和载体酶切后的回收大片段40ng于16°C连接16小时后，取连接产物2μI电转化大肠杆菌感受态细胞DH-5α(购自天根公司)，转化产物进行蓝白斑筛选。挑取白色转化子，使用GbWRKYl基因特异的引物GbffRKYl-F和GbWRKYl-R组合进行PCR反应以筛选阳性克隆，PCR反应条件:先94°C5min变性，然后94°C30sec,55°C30sec,72°Clmin，总共进行25个循环，最后72°C7min延伸。确定为阳性的克隆即为获得了用于转化的超量表达质粒P35s-GbWRKYl(图2)。将构建的p35s_GbWRKYl载体转化农杆菌菌株GV3101(Roger等，AguidetoAgrobacteriumbinaryTivectors.Trendsinplantscience.2000.5,1360-1385.),挑取单菌落接于含25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于150rpm,26°C摇48h，按菌液和甘油体积比为1:1加入1.5mL离心管混匀，-70°C保存。再通过农杆菌介导的转化方法转化拟南芥。以上及以后所述的LB培养基配方为:Typtone10g/LYeastExtract5g/LNaCl10g/L用5mMNaOH调PH=7.2，定容，高温高压灭菌(121_125°C)15_20min。LB固体培养基为每升加入8g琼脂。实施例3GbWRKYl基因的遗传转化及筛选鉴定1、拟南芥的准备供试材料为野生型拟南芥(ArabidopsisthalianaL.Columbiaecotype)。野生型拟南芥种子经过春化处理后点播拟南芥种植专用营养土(培蕾，江苏镇江)并放入人工培养室(16小时光照，22度)等拟南芥长到4叶左右进行定苗，以控制拟南芥的生长密度。待拟南芥生长6周左右开始开花时即可转化，转化前一天给拟南芥浇足水；2、农杆菌的活化从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因的GV3101菌株的甘油管在冰上融化，后于含25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，26.5°C暗培养36_48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在加25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养(26.5°C，IOOrpm)，其0D600=0.8-1.0时即可用于转化；将菌液转移到离心管中5000rpm离心5min，弃上清培养基。加入IOOml浓度为5%(W/V)的蔗糖溶液，重悬农杆菌GV3101，在28°C摇床中复苏1_2小时。加入表面活性剂0.05%(V/V)SilwetL-77，震荡摇混匀。3、农杆菌介导的花序法转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的转化方法和程序参照参考(Zhang等，Agrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthalianausingthefloraldipmethod.NatureProtocols,2006.1:641-646)。具体步骤如下:(I)将拟南芥花器浸入农杆菌悬液，并轻轻搅动约30秒钟，用纸巾吸掉过多的菌液，并用黑色塑料袋将拟南芥植株包裹起来，保湿避光处理24小时；(2)24小时之后将塑料袋逐渐揭开透气，正常培养；(3)一个星期之后重复上述(I)的操作；(4)待种子成熟可以停止浇水并收获种子，即T1代种子。(5)将收获的种子消毒:先用70%(V/V)乙醇浸泡I分钟，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次；(6)处理后的种子用Topagar(0.1%(W/V)琼脂水溶液)均匀涂布在固体筛选培养基(含有100mg/L卡那霉素的MS培养基)表面；(7)4°C春化3天，移入培养室培养10天后，共选取具有卡那霉素抗性植株15株；`(8)将15株转基因T1代拟南芥植株移栽到土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T2代种子。(9)将收取的T2代种子按操作步骤(5)-(6)进行操作I次；(10)4°C春化3天，正常培养10天后计算具有卡那霉素抗性植株与非抗性植株的分离比，并进行统计分析；(11)符合抗性与非抗性植株的分离比为3:I的株系认为是单拷贝株系，移栽土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T3代种子。4、转基因拟南芥植株的纯系检测将收取的T3代种子按实施例3中农杆菌介导的花序法转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选的操作步骤(5)-(6)进行操作I次；然后4°C春化3天，移入培养室培养10天后查看转基因植株在固体筛选培养基(含有100mg/L卡那霉素的MS培养基)上是否发生抗性分离，不发生抗性分离的株系即认为是转基因纯系T4代种子，用作下一步表型分析和功能鉴定。实施例4:转基因拟南芥的表达分析收集T4代种子生长的拟南芥植株叶片以提取RNA，RNA的抽提方法参用Trizol试剂盒(购自Sigma公司，美国)。RNA完整性通过1.2%(w/v)琼脂糖胶(EtBr)电泳检测(5V/cm)。RNA浓度的测定在BeckmanDU800spectrophotometer(BECKMAN公司，美国)上进行。RNA260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0的RNA用于下一步的分析。cDNA的合成是以3μg总RNA为模版，与IμI500μg/mloligo-dT(15)引物(购自Promega公司)，IμIlOmMdNTP,DEPC-water混合，总体积为12μI;然后65°C变性5min冰上骤冷；再加入8μI含有4μIRTbuffer,2yI0.1Mdithiothreitol,40unitsofRNasinRibonucleaseInhibitor(购自Promega公司，美国)，和200unitsofSuperscriptIII反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；50°C温浴Ih合成第一链；反应结束后75°C处理15min使SuperscriptIII反转录酶失活。每份cDNA稀释到300μI后-20°C保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用弓丨物GbWRKYlin-f(GbWRKYlin-f:5'AGGATGCAAAGTAAAGAAGCAAG3')和GbWRKYlin-r(GbWRKYlin-r:5/GGGITTCAGAAGGGAGTGTAAAT3')对GbWRKYl基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长204bp)。同时用拟南芥Atactin2(GenBank登陆号:NM_179953)基因作为内对照基因，引物分别为Actin-f(Actin-f:5'CACTGTGCCAATCTACGAGGGT3')和Actin-r(Actin-r:5'CACAAACGAGGGCTGGAACAAG3')做特异扩增(扩增产物长216bp)。PCR反应体系的总体积为20μ1，DNA模板Iul(约50ng)、IXTaq酶反应缓冲液、25mMMgCL2l.2ul、2mMdNTP1.5ul、IOuM引物0.2ul、0.3单位Taq酶，加ddH20至20μI。反应程序为:94°C变性5min，94°C30s,55°C30s,72°C30s30cycles，72°C延伸5min。获得的PCR产物取10μI以0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳检测结果如图3。结果表明:本发明克隆的GbWRKYl基因在拟南芥中能够表达，并且在不同转基因系中的表达量有差异，后续的功能验证研究中选取表达量相对较高的4和9号两个系进行分析。实施例5:利用转基因拟南芥对GbWRKYl基因进行功能验证1.GbffRKYl超量表达拟南芥低磷处理表型分析及花青素含量测定将实施例4收到的转基因纯系T4种子和野生型拟南芥种子消毒:先用70%(V/V)乙醇浸泡I分钟，然后用无菌水洗四次；处理后的种子用0.1%(W/V)琼脂水溶液均匀涂布在拟南芥正常生长培养基上；4°c春化2到3天，移入培养室(22°C，16小时光照)培养5天后分别移入正常培养和低磷培养基，7天后照相，并取拟南芥的地上部组织，提取花青素，以测定野生型和转基因植株分别在正常培养和低磷培养下的花青素的含量。花青素提取和测定方法如下:(I)每个处理取50mg幼苗，加入300μI提取液(甲醇+1%HCl)，4°C过夜，每处理重复3次；(2)加入200μI水和500μI氯仿，混匀，离心，吸取上清；(3)分光光度计(BackmanDU800)分别测定530nm和657nm处的吸光度值；(4)花青素含量计算方法:C=A530-0.24*Α657/ε*1(ε-38000L/mol*cm摩尔消光系数)拟南芥野生型和转基因系分别在低磷处理7d后的表型见图4A，花青素测定结果见图4B。在低磷逆境胁迫处理下，野生型拟南芥会表现出花青素积累而使植株发紫的现象。GbffRKYl超量表达转基因拟南芥植株的花青素积累相对野生型明显减少，表明GbWRKYl超量表达能缓解拟南芥在低磷下的胁迫反应。2.GbffRKYl超量表达转基因拟南芥低磷处理无机磷含量检测拟南芥种子的消毒处理和低磷胁迫处理参考本实施例中的1，在低磷处理7天后分别取样植株的根和叶，按钥酸根孔雀石绿法检测磷离子的含量检测植株内无机磷含量。具体操作如下:根或叶分别取50mg，加入5M&3043(^1，磨匀后加入60(^1双蒸制成母液。测定时该母液稀释与孔雀绿溶液按3:I比例混合，放置5min后在650nm下测定吸光度。磷含量根据标准曲线换算。结果见图5，在正常培养情况下，无论在根还是叶中，GbffRKYl超量表达转基因拟南芥积累的无机磷含量均高于野生型；在低磷的情况下，转基因系中的无机磷含量仍高于野生型。结果说明，GbWRKYl超量表达转基因拟南芥植株有更高的磷吸收能力和磷的累积能力。3.低磷诱导及高效磷转运基因在GbWRKYl超量表达转基因拟南芥中的表达分析拟南芥种子的消毒处理和低磷胁迫处理参考本实施例中的1，在低磷处理7天后分别取样植株的根和地上部分，RNA抽提和反转录方法同实施例4。以上述反转录合成的cDNA为模板，设计引物对受到低磷诱导的拟南芥基因和磷高效转运基因进行特异的PCR扩增。同时用引物Actin-2f和Actin-2R对拟南芥Atactin2(GenBank登陆号:匪179953)基因做特异扩增(扩增产物长216bp)，以作为内对照进行相对定量分析。定量PCR仪为ABI7500，定量PCR试剂购自Bio-Rad公司。PCR反应体系(20μI)包括:1μI稀释后的cDNA(等于IOng起始总RNA)，10μI2XPCRMasterMix，200nM的引物。反应条件为:95°C30s；95°C5s,60°C35s，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。所用引物序列如下:At4-F:5/-AGAGAGAAGCCATAAAAACCCTAA-3'At4-R:5'-GAAACAAAGTAAACACGGAACATAA-3'ACP5-F:5/-CACGGCGAGTCTGAGTTTGCTGTTG-3'ACP5-R:5'-TCCCATCTGATAAGCAACGAGAGACTG-3'RNSl-F:5/-TTTGATTTCTTCTACTTCGTCCAAC-3'RNSl-R:5/-CCGGTCAACACAAAGATAGACTTG-3'IDS4-F:5/-TTGCGAAAGCTAAGGATTCA-3'IDS4-R:5'-AACTGTAGAGGCGGCAATGA-3'PTl-F:5/-AGTTGACTACATTTGGCGAATCATC-3'PTl-R:5/-ATAAGAGTCTGAGCCCTAGCAATC-3'PHT1.6-F:5/-GGCTACGATCATGTCCGAGTATTCC-3'PHT1.6-R:5/-AAGTTTTGGCTGTAGAAAGCGATGT-3'PHT1.8-F:5/-GTGATTACCCGCTCTCG-3'PHT1.8-R:5/-ACATTCGCCAATAGAACG-3'PHT3.2-F:5/-CGAAGAGAAAAGTCGAAAAACC-3'PHT32-R:5'-AAGCTCCTTGGGCACTGTAA-3'Atactin2-2F:5/-TTCCTCATGCCATCCTCCGTCTT-3'Atactin2-2R:5/-CAGCGATACCTGAGAACATAGTGG-3'实验结果如图6。结果表明:本发明克隆的GbWRKYl基因在拟南芥中超量表达之后，引起了一系列受低磷诱导的基因和磷高效转运基因的表达变化。在低磷情况下，检测的四个受低磷诱导的基因，除了AT4在转基因系中的表达量高于野生型，ACP5、RNSl和IDSl都低于野生型，同时在叶中表现出与根中相同的表达模式，但是高于在根中的表达量。而检测的四个磷高效转运基因，除了PHT1.6，不论在低磷和正常培养情况下，在转基因系中的表达量都高于野生型，同时在叶中的表达量低于在根中检测到的。ACP5、RNS1和IDSl三个低磷诱导基因在转基因系中受低磷诱导的程度低于野生型，表明转基因系对低磷胁迫的响应程度较之野生型要低，也就是对低磷胁迫的敏感性降低了。因为AT4基因可能主要参与无机磷的重新分配，因此低磷培养下转基因系中高表达量的表达说明转基因系改变低磷反应的可能是改变了植株体内磷的动态平衡。而磷高效转运子基因在低磷条件下转基因系中的高表达则进一步印证了上述结果。以上结果说明棉花GbWRKYl基因具有提高植物在低磷胁迫下的磷高效吸收和利用的能力，利用本基因可用于植物，包括棉花、拟南芥、油菜、水稻、小麦、大豆、玉米等磷高效利用系的培育。以上所述的培养基及溶液的配方为:拟南芥正常生长培养基:5mMKNO3,2mMMgSO4,2mMCa(NO3)2,ImMKH2PO4,1.5mMKCI,70yMH3BO3,14μMMnCl2,1μΜZnSO4,0.5μΜCuSO4,10μMNaCI,0.2μMNa2MoO4,40μMFe-EDTA，10g/L蔗糖，ΡΗ5.7，8g/LAgar。拟南芥低磷处理培养基:5mMKNO3,2mMMgSO4,2mMCa(NO3)2,20μMKH2PO4,1.5mMKCI,70yMH3BO3,14μMMnCl2,1μΜZnSO4,0.5μΜCuSO4,10μMNaCI,0.2μΜNa2MoO4,40μMFe-EDTA，10g/L蔗糖，PH5.7，8g/LAgar。孔雀绿溶液的配制:硼酸(H3BO3)1.2克，钥酸铵[(NH4)6Μ07024.7H20]36.18克溶解在350ml蒸馏水，缓慢搅拌的加入476ml的5MH2SO4，接着加入孔雀绿(分子量42000)0.229克。以上配好的试剂用滤纸过滤除杂。另外取IOoml的蒸馏水，加入Ig聚乙烯醇(98%能被水解，分子量在11000-31000)，持续加热溶解。该溶液冷却后，加到上述过滤后的孔雀绿溶液，混合液定容至IL。该试剂应避光室温保存。权利要求1.一种分离的基因CDNA，其序列为SEQIDN0.1所示核苷酸序列。2.一种分离的基因的cDNA蛋白质，其序列为SEQIDN0.2所示氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的一种分离的基因的cDNA，其特征在于:所述的核苷酸序列含有表达载体p35s-GbWRKYl。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于:所述表达载体为植物表达载体PCAMBIA2300。5.权利要求1所述的一种分离的基因cDNA在提高拟南芥的磷营养利用效率中应用。全文摘要本发明属于植物基因工程
技术领域：
，具体涉及一种从海岛棉中鉴定的基GbWRKY1因的分离克隆、功能验证和应用。其编码基因的cDNA序列如SEQIDNO1所示；其编码基因的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。本发明还公开了该基因(GbWRKY1)能促进磷转运类蛋白的表达与功能，具有促进拟南芥磷营养高效利用的功能。文档编号A01H5/00GK103173461SQ20111043229公开日2013年6月26日申请日期2011年12月21日优先权日2011年12月21日发明者张献龙,朱龙付,徐理申请人:华中农业大学