专利名称：毛白杨中的MYB类转录因子PtrMYB01及其cDNA的克隆方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，涉及到生物基因技术领域中克隆技术，具体涉及到毛白杨中一个新的MYB类转录因子及其cDNA的克隆。
背景技术：
毛白杨Populus tomentosa Carr为杨柳科杨属植物，落叶乔木，高达30米，胸径达2米，是我国特有的乡土树种。毛白杨分布范围很广，北起我国辽宁南部、内蒙古，南至长江流域，以黄河中下游为适生区。毛白杨树干高大、适应性强、纤维较长，是重要的民用和工业木材。另外毛白杨具有清热利湿，止咳化痰的药效，对肝炎、痢疾、淋浊、咳嗽痰喘都有一定疗效.由于毛白杨具有如此巨大的应用价值，研究人员在提高毛白杨产量方面做了大量研究。贾之春等O010)将来源于益母草的LJAMP2基因转入毛白杨中，显著增加了毛白杨对溃疡病的抗性，提高了毛白杨的产量。LHu等000 将mtlD基因转入毛白杨中，明显的增强了其抗盐性，扩大了毛白杨的栽种范围。自Paz-Ares等从单子叶植物玉米中克隆出与色素合成相关的ZmMYBCl基因以来， 大量MTO类基因从各种植物中得以分离鉴定。其中在拟南芥中已发现超过198个MTO家族基因，玉米基因组中有超过80个MYB转录因子，而棉花中发现大约有200个MYB转录因子。 功能研究表明，MTO参与了植物次生代谢，激素和环境因子应答，并对细胞分化、细胞周期以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。在MTO转录因子的众多生理作用中，抗逆性作用尤其引起了研究人员的关注。近年来也在植物中鉴定出了许多参与植物抗逆胁迫应答的MTO转录因子新基因。 如厚叶旋蒴苣苔中的BcMYBl受干旱强烈诱导，同时能对PEG、高盐、低温等胁迫产生一定程度的应答，但在外源脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJa)、水杨酸(SA)的处理下，其表达量却很低，说明可能通过一种不依赖ABA的途径参与调控基因表达从而对干旱产生应答。拟南芥的AtMYB2和AtMYB60也被证实参与植物的耐旱胁迫过程。拟南芥中的MYB68基因在根中柱鞘细胞中特异表达，高温胁迫下，根中MYB68活性增强，而MYB68突变体的生长活力比野生型低，说明参与高温应答反应。水稻中的0sMYB4基因的高量表达能显著提高转基因植物对干旱、高盐、UV辐射等的耐受性。拟南芥中的MYB家族成员基因LAFl、AtMYB2UPAPl 及PAP2等均参与光信号传导途径，在黄酮醇生物合成途径中，查尔酮合酶(OB)、查尔酮黄烷酮异构酶(CFI)、黄烷酮羟化酶(F3H)和黄酮醇合酶(FLQ这4个基因的启动子中均含有大量的光调节元件(LRUs)，拟南芥中这4个基因一致应答光诱导。植物抗逆性的分子机制研究表明，植物的抗逆性是由多基因控制的，而且许多胁迫因子对植物的伤害结果具有一致性，如干旱胁迫与盐胁迫引起组织脱水。拟南芥的AtMYB2转录因子，在逆境下表达增强，同时也增强了干旱应答基因rd22和AtADHl的表达。在干旱胁迫下AtMYB2也作为ABA 诱导的转录激活子发挥功能。Eleonora Cominelli等人证明得知AtMYB60在拟南芥叶片保卫细胞中表达并调节拟南芥叶片气孔开闭中起到积极的作用，使得过量表达AtMYB60的拟南芥植株具有高度抗旱性。同时，Jong-Sug Park等人证明AtMYB60在生菜中的异位表达使得生菜叶片失去了原本的暗红色，已知生菜叶片中的暗红色源自于黄酮代谢过程中的DFR基因的表达产生的次级代谢产物。通过进一步实验，Jong-Sug Park等人证明AtMYB60在生菜黄酮代谢过程中抑制了 DFR基因的表达，使得黄酮代谢过程受阻，所以失去了叶片的暗红色。由此可知， AtMYB60在植物中不仅有调节气孔开闭从而加强植株抗旱性的功能，还能调节叶片中黄酮代谢过程中关键酶基因的表达，是植物生长过程中非常重要的一个转录因子。而本发明中从毛白杨中新发现的PtrMYBOl转录因子与AtMYB60高度同源，因此PtrMYBOl转录因子可能在植物的抗旱、抗寒等抗逆性方面起着积极作用。因此若将该基因通过基因工程的手段转入植物中，使植物获得较强的抗逆性，将具有极大的实际意义。
发明内容
本发明提供了一种可能对植物抗逆性其积极作用的新的转录因子PtrMYBOl，它具有SEQID NO. 2所示的序列 SEQ IDN0. 2的信息
(a)序列特征 长度322氨基酸 类型氨基酸眷链型单链眷拓扑结构线型
(b)分子类型蛋白质
(c)序列描述 Met Gly Arg Pro 1
Pro Trp Thr Pro
Glu His Gly Pro
Leu Leu Arg Cys
Leu Arg Pro Gly
Lys Met lie lie
Ala lie Ala Ser
Asn Phe Trp Asn
Ala Gly Gln Glu
Pro Cys Cys Asp Lys lie Gly Val Lys Lys Gly 51015
Glu Glu Asp lie lie Leu Val Ser Tyr lie Gln 202530
Gly Asn Trp Arg Ala Val Pro Thr Ser Thr Gly 354045
Ser Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr 505560
lie Lys Arg Gly Asn Phe Thr Asp His Glu Glu 657075
His Leu Gln Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ala 808590
Tyr Leu Pro Gln Arg Thr Asp Asn Asp lie Lys 95100105
Thr His Leu Lys Lys Lys Leu Arg Lys Leu Gln 110115120
Gly Gln Ser Arg Asp Gly Leu Ser Ser Thr Gly
Ser Asp Gly Tyr Asn Gln Ala Asp Gly
Gln Ile Lys Glu Ile
Gln Asn
Ile
Met
Pro Ser Lys Pro Arg
Ser
Ser Leu
Gly Lys Phe
Ala Asn Asp
Met Ser Pro
Ser Ser
Asp lie
Glu Asp
Ala Gly Glu
Lys Asp Gly Ser Asp Gln Ala Asp
125 Ser 140 Ala 155 Ser 170 Ala 185 Leu 200 Asn 215 Ser 230 Thr 245 Phe 260 Thr 275 Val 290 Met 305 Asn 320
Arg Arg
Gly Gln
Leu Leu
Thr
Leu
Ser
Glu Lys Thr
Gln Ala Thr Pro Gly Thr
Leu Ser Ser
Gly Asp Gly
Leu Ser
Ser Ser
Leu Phe
Trp Leu Gly lie Trp Gln Glu Gln Asn Gln
Pro Leu Ser Leu
Gln
Leu
Gly Phe
Lys Asp
130 Glu 145 Cys 160 Leu 175 Tyr 190 Met 205 Asn 220 Gly 235 Ala 250 Ser 265 Asp 280 lie 295 Tyr 310
Arg Glu Lys Ala lie
Arg Ala
Leu Gln
Leu Ser
Pro Ser
Ser Ser
Ser
Ser Phe Thr
Phe Asp Glu Glu lie
Pro Glu Phe Ser Arg Asn
Gly lie Asp
Cys Thr Pro Asp Lys
Ser Leu
Ser Gln
Lys Trp Glu
Pro
Leu
Val
135 Thr 150 Pro 165 Gly 180 Glu 195 Lys 210 Thr 225 Ala 240 Phe 255 Ser 270 Asn 285 Phe 300 Thr 315
氺
322
本发明还提供一种能编码可能对植物抗逆性其积极作用的新的转录因子 PtrMYBOl的新基因，以及包含所述基因的表达载体，该基因cDNA具有SEQ ID NO. 1所示序列SEQ ID NO 1 的信息(a)序列特征 长度969bp 类型核酸 链型双链 拓扑结构线型(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否
(e)最初来源毛白杨(Populus tomentosa Carr)(f)序列描述:SEQ ID NO. 1atgggcagac caccttgctg tgataagata ggagtgaaaa aaggaccatg gactcctgag 60gaagatatca tcttggtatc atatattcaa gaacatggtc ctgggaattg gagagctgtg 120ccaactagta caggactgct tagatgcagt aagagttgca gattgagatg gactaattac 180ctaaggccag ggatcaaacg tggtaatttt accgatcacg aggagaagat gataatccac 240ctccaagccc ttctaggcaa cagatgggct gccatagctt catacctccc tcagagaaca 300gcagggcaag aaggtcagtc tagagatggg ttatcatcaa caggttcaca gcaaatttct 360gcagggcaag aaggtcagtc tagagatggg ttatcatcaa caggttcaca gcaaatttct 420agaggccaat gggagagaag gcttcaaact gatatcaaca tggctaggca agccctatgc 480gaggccttgt ctcccggtaa accaagcagc ttgttaaccg ggttgaaacc ctcttgtggg 540tatgaaaaac cagctacaga accaatctat gcatcaagca ctgaaaatat atccagattg 600ctcaaaggat ggatgataag tgggcctaag cagtcgctaa aaaattcaac tactcagaat 660tccttcatcg atacggctgg agctgattca ctgtctagtg aagggactcc tgataaagca 720gacaaaaatg gcactggatt atcacaggca tttgaatcac tctttggttt tgactctttc 780gactcttcaa attcagattt ctctcaatcc atgtcgcctg atactggcct tttccaagac 840gaaagtaagc caaattccag tgctcaagtg ccactgtcat tgattgagag gtggctattt 900gatgaaggag ccatgcaagg gaaagattac ataaacgaag tcacaataga tgaagataat 960ctcttctag 969。本发明的毛白杨MYB类转录因子PtrMYBOlcDNA的克隆方法如下(1)从毛白杨中提取总RNA，然后反转录合成cDNA ；(2)根据PtrMYBOl转录因子的保守序列设计特异性引物Fdtsd 5-ATGGGCAGACCACCTTGCTG-3Rdtsd 5-GAGCCCTCCCACTAGAAGAG-3(3)通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；(4)将扩增产物纯化，取纯化物克隆到pCXSN载体，转化DH5 a细胞。上述方法具体操作如下从毛白杨材料中提取总RNA，再反转录合成cDNA，cDNA第一链合成取4_10 U g总 RNA和1 ill 0. 5 ii g/ ill的Oligo (dT) 18primer,小心混勻，70°C保温5分钟，立即浸入冰水 中。按次序分别加入下列试剂5 ill 5 X M-MLV RT Buffer2u 1 dNTP mix(2. 5mM)1 u 1 RNase 抑制剂(30U/ U 1)Iyl M-MLV Reverse Transcriptase然后加DEPC水到25 u 1.小心混勻，室温离心5秒，将所有溶液收集到管底，370C 保温1小时，再90°C处理5分钟，冰上冷却。链式聚合酶反应试剂与条件如下首先将下列试剂混在一起ddH2018. 25 U 1
10XPCR buffer2. 5μ 1
MgCl21. 5μ 1
dNTP0. 5μ 1
ΙΟμπιοΙ. L-1FSD0. 5μ 1
ΙΟμπιοΙ. L^1RSD0. 5μ 1
cDNA1 μ 1
Pfu酶0. 25 μ 1
总体积25 μ 1
链式聚合酶反应条件为首先94°C变性:3min，然后进入下列循环94°C 30sec,
55°C 30sec,72°C lmin，共进行 34 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。
图1是重组质粒结构示意2是转化大肠杆菌的PCR检测图3是重组质粒的酶切验证
具体实施例方式实施例1 毛白杨(Populus tomentosa Carr)，实验室已有材料。1.总 RNA 提取①、取植物组织5g加入液氮充分研磨，转到一支预冷50mL的离心管中，顺序加入 15mL异硫氰酸胍溶液，1. 5mL 2M NaAc (pH4. 0)，15mL水饱和酚和3mL氯仿/异戊醇。混勻后置冰上15min。②、4°C，15000g离心30min转上清于另一管中，加等体积异丙醇，混勻_20°C沉淀 Ihr. ο③、4°C，15000g离心25min，弃去上清，加5mL异硫氰酸胍溶液溶解沉淀后再加异丙醇_20°C沉淀Ihr。离心收集RNA沉淀，70%乙醇洗一次后晾干，加500 μ 1 DEPC处理的水溶RNA。取5 μ 1电泳检测完整性，取5 μ 1测紫外吸收值检测纯度及浓度。2. cDNA第一链的合成取4 μ g 总 RNA 禾口 1 μ 1 0. 5 μ g/ μ 1 的 Oligo (dT) 18primer,小心混勻，70°C保温 5 分钟，立即浸入冰水中。按次序分别加入下列试剂5μ 1 5XM-MLV RT Buffer2 μ 1 dNTP mix (2. 5mM)1 μ 1 RNase 抑制剂(30U/ μ 1)1 μ 1 M-MLV Reverse Transcriptase然后加DEPC水到25 μ 1.小心混勻，室温离心5秒，将所有溶液收集到管底，37°C 保温1小时，再90°C处理5分钟，冰上冷却。3. PCR反应PCR反应的试剂和条件首先将下列试剂混在一起ddH2018. 25 μ 1
10XPCR buffer2. 5 μ 1MgCl21. 5μ 1dNTP0. 5μ 110 μ mo 1. L^1FSD0. 5 μ 1IOymol-L-1RSD0. 5 μ 1cDNA1 μ 1Pfu 酶0. 25μ1总体积25 μ 1Fdtsd 5-ATGGGCAGACCACCTTGCTG-3Rdtsd 5-GAGCCCTCCCACTAGAAGAG-3链式聚合酶反应条件为首先94°C变性:3min，然后进入下列循环94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，共进行 34 个循环，最后 72°C延伸 lOmin。4.高保真酶扩增产物加A体系
(MH2O10 μ 1
IOXPCR buffer2μ 1
MgCl21. 2μ 1
dNTP1 μ 1
扩增产物5. 5μ 1
Taq0. 3μ 1
总体积20 μ 1
反应条件72度，1小时
5. PtrMYBOl转录因子cDNA克隆取4ul加A产物，连接到pCXSN载体上，连接
温度为16°C，时间为16h。再转化到大肠杆菌DH5a菌株，转化后的菌株在加有抗生素 (Amp+50ppm)的LB固体培养基上过夜培养，从平板上挑取抗性菌落用煮沸裂解法鉴定阳性克隆。6.阳性克隆的酶切鉴定①.挑阳性克隆接种于LB(含相应抗生素)液体培养基中，培养(37°C， 200rpm)8h,再将此活化的菌液取200ul于20ml含相应抗生素的液体培养基中(1/100)， 250rpm，37°C 培养 2h。②.质粒的提取(用Takara质粒抽提试剂盒提取)③.酶切Xcm I酶切反应体系
质粒15ul )BamHI0. 5ulIOXK Buffer2. 5ulddH202 ul总体积20 ul) ④.电泳检测
7.阳性克隆的测序选取阳性克隆送至金思特公司测序。所得基因具有SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 所示序列。8.转化农杆菌EHA105 ①取Iyg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混勻后，冰浴 30mino②在37°C水浴 5min 或 42°C水浴 Imin。③冰浴2min，加入800mlLB液体培养基。④在，200rpm摇培1小时后涂在含50 μ g/ml Kanamycin的LB平板上。⑤培养到形成单菌落。将转化后的农杆菌于-70°C保存，以用于后续研究。实施例2:将实施例1中获得的农杆菌DHA105用于侵染植物，获得转基因植株，可能会增加其抗逆性(如抗寒、抗旱性)，在大田或森林中应用。
权利要求
1.一种来源于毛白杨的MYB类转录因子PtrMYBOl，其特征在于其具有SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列。
2.一种能编码转录因子PtrMYBOl的基因，该基因具有SEQ ID NO. 1所示的序列。
3.—种表达载体，包含权利要求2所述的基因。
4.权利要求2所述的基因在大田或森林中增加植物抗逆性方面的应用。
5.权利要求1所述毛白杨MYB类转录因子PtrMYBOl的克隆方法，包括如下步骤(1)从毛白杨中提取总RNA，然后反转录合成cDNA；(2)根据PtrMYBOl转录因子的保守序列设计特异性引物 Fdtsd 5-ATGGGCAGACCACCTTGCTG-3Rdtsd 5-GAGCCCTCCCACTAGAAGAG-3(3)通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；(4)将扩增产物纯化，取纯化物克隆到pCXSN载体，转化DH5α细胞。
6.如权利要求5所述毛白杨MYB类转录因子PtrMYBOl的克隆方法，其特征在于所述步骤1中反转录合成cDNA是第一链合成cDNA，取4 μ g总RNA和1 μ 1 0. 5 μ g/ μ 1的 Oligo (dT) 18primer,小心混勻，70°C保温5分钟，立即浸入冰水中；按次序分别加入下列试剂5 μ 1 5XM-MLV RT Buffer 2 μ 1 dNTP mix 2. 5mM 1 μ 1 RNase 抑制齐[J 30U/ μ 1 1 μ 1 M-MLV Reverse Transcriptase然后加DEPC水到25 μ 1，混勻，室温离心5秒，将所有溶液收集到管底，37°C保温1小时，再90°C处理5分钟，冰上冷却。
7.如权利要求5所述毛白杨MTO类转录因子PtrMYBOl的克隆方法，其特征在于所述链式聚合酶反应试剂与反应条件如下首先将下列试剂混在一起 ddH2018. 25 μ 1IOXPCR buffer2. 5 μ 1MgCl21. 5μ 1dNTP0· 5 μ 1.10 μ mo 1. L^1FSD 0. 5 μ 1 IOymol. L^1RSD0. 5 μ 1cDNA1 μ 1Pfu 酶0. 25 μ 1总体积25 μ 1链式聚合酶反应条件为首先94 °C变性:3min，然后进入下列循环94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，共进行 34 个循环，最后 72°C延伸 .lOmin。
全文摘要
本发明提供一种新的毛白杨MYB类转录因子PtrMYB01，一种编码该转录因子的基因及其cDNA的克隆方法。所述的转录因子是一种从毛白杨中分离的多肽。通过对其高度同源的同家族转录因子ATMYB60分析，其可能具有调控植物抗逆性(抗旱)和调节植物黄酮合成代谢的功能。因此，若将PtrMYB01基因的重组质粒转入植物中，由于在植物中过度表达所述基因，可产生一种具有强的抗旱、抗寒植物，从而增加植物产量。本发明的克隆方法是，从毛白杨中提取总RNA，反转录合成cDNA；根据该转录因子的保守序列设计引物，通过链式聚合酶反应扩增到一个DNA片段；将扩增产物纯化，取纯化产物克隆到pCXSN载体，转化DH5α细胞，平板过夜培养。提取转化后大肠杆菌质粒，转入农杆菌EHA105中，用于后续研究。
文档编号C12N15/29GK102399270SQ20101028253
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者刘松领, 王晴岚, 秦智超, 罗克明 申请人:西南大学