一种球毛壳菌生物菌肥粉剂的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种球毛壳菌生物菌肥粉剂的制备方法及应用，尤其设及W球毛壳菌 烟laetomiumglobosum)ND35菌株的子囊抱子为活性成分的生物肥料粉剂的制备方法，属 于农业微生物领域。
【背景技术】
[0002] 球毛壳菌（化aetomiumglobosum)ND35菌株是一株分离自健康毛白杨的植物内生 真菌，属于子囊菌口、核菌纲、球壳目、黑抱壳科、毛壳菌属。
[0003] 球毛壳菌ND35菌株的抑菌谱很广，对黄瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病 菌、黄瓜霜霉病菌、苹果轮纹病菌、苹果树腐烂病菌、杨树烂皮病菌和水泡溃瘍病菌W及立 枯丝核菌的菌丝生长都有明显的括抗作用，代谢过程中能够产生具有抑菌活性的抗生物 质，并能抑制黄瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、苹果轮纹病菌和杨树水泡溃瘍病菌等的抱子萌 发。在透射电镜下观察，发现球毛壳ND35与立枯丝核菌接触并发生重寄生作用后，球毛壳 ND35菌丝寄生到病原菌菌丝内部后，在互作过程中产生了几了质酶和0 -1，3-葡聚糖酶， 会使其细胞结构发生素乱、细胞壁降解。
[0004] 已有的试验结果表明，球毛壳菌ND35菌株能有效定殖于蔬菜植物如苦瓜、黄瓜、 番茄、菜豆和经济林木如杨树、核桃、板栗W及大田作物如甘馨、小麦、马铃馨、烟草、生姜的 植株中，并对黄瓜、苦瓜、茄子和番茄的生长有明显的促进作用；盆栽条件下接种球毛壳菌 ND35菌株后，可有效地防治黄瓜苗期巧倒病的发生，也能诱导番茄和菜豆对灰霉病菌产生 系统抗病性；还可有效防治菜豆立枯病。大田条件下对杨树的侧根和胸径生长具有一定的 促进作用并诱导其对腐烂病菌和叶诱病菌产生抗性。球毛壳菌ND35菌株对板栗侧根和毛 细根的生长具有积极影响，可增加板栗花序的数量、侧根和毛细根数量，在后期对地茎生长 和一级分枝数也产生明显促生作用；对杨树杆插苗、菜豆、黄瓜、烟草、生姜的生长表现出促 生作用。通过扫描电镜观察球毛壳菌ND35菌株对杨树组培苗的侵染定殖发现：子囊抱子萌 发后，产生的菌丝多集中于根毛，但并不侵染根毛，主要通过根、茎部表面细胞间的缝隙侵 入，或在根表面形成附着胞或菌丝足，通过形成侵染钉直接从表皮细胞侵入，在叶部主要从 气孔侵入叶片内部，侵入根部的菌丝主要定殖于表皮细胞、外皮层细胞和细胞间隙，未进入 内皮层和维管束组织。
[0005] 球毛壳菌ND35菌株抗生物质粗提物对黄瓜、菜豆和小麦种子的萌发没有抑制作 用，能够显著增加须根数、根鲜重和促进苗期生长，球毛壳菌ND35菌株活体菌剂的施用并 不会减少黄瓜、番茄和菜豆根际±壤的细菌总量，而对黄瓜根际±壤的有益菌数量积累有 一定的促进作用。球毛壳菌ND35菌株的子囊抱子在河水、水库水、自来水中均不能萌发且 能自行消解，当浓度不大于l〇5c化/ml时，不会对鱼类的生长造成影响；球毛壳菌ND35菌株 的子囊抱子对小白鼠急性经口毒性属于"低毒"级，急性经皮肤单次刺激试验和经兔眼单次 刺激试验结果均表明为"无刺激性";可推断，球毛壳菌ND35菌株作为活体微生物制剂，与其 它微生物制剂一样无毒、无污染、无残毒，对±壤中其它有益微生物无不良影响，不影响± 壤和环境中微生态循环，用于设施蔬菜及陆地等作物±传病害的生物防治和增产促生无明 显性风险。
[0006] 球毛壳菌ND35菌株的环境适应性非常强，能够适应恶劣的盐碱条件。在室内，W PDA为基础培养基，研究酸碱度和盐分浓度对球毛壳菌ND35的菌丝生长和抱子萌发的影 响，结果发现；在抑值3-12范围内，球毛壳菌ND35的菌丝能够正常生长，在含1 % -10%的 Ca2\r、N和P的培养基中，球毛壳菌ND35的菌丝依旧能够正常生长，且生长速率未受到酸 碱度和盐分的影响；球毛壳菌ND35的子囊抱子在抑值为3-12范围内的PDB培养液中，抱 子的萌发也未受到影响。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的是提供一种制备生物菌肥的方法。
[0008] 本发明提供的制备生物菌肥的方法包括如下步骤：将球毛壳菌（化aetomium globosum)ND35CGMCCNo. 4136的抱子、腐植酸和壳聚糖混匀，得到生物菌肥。
[0009]上述方法中，所述球毛壳菌（Qiaetomiumglobosum)ND35CGMCCNo. 4136 的抱子、 所述腐植酸和所述壳聚糖的配比为2XIQiicfu;(245-275)g;(35-4Wg。
[0010]上述方法中，所述球毛壳菌（Qiaetomiumglobosum)ND35CGMCCNo. 4136 的抱子 为小于100目的抱子粉。
[0011]上述方法中，所述球毛壳菌（Qiaetomiumglobosum)ND35CGMCCNo. 4136 的抱子 粉为将球毛壳菌（化aetomiumglobosum)ND35CGMCCNo. 4136抱子在培养料中发酵得到的 产物。
[0012] 上述方法中，所述发酵为将所述抱子W(1-3)X108c化/ml的量接种在含有食用菌 菌慷的培养料中；所述抱子具体W2Xl〇8c化/ml的量接种在所述含有食用菌菌慷的培养料 中。
[0013] 上述方法中，所述含有食用菌菌慷的培养料为将食用菌菌慷和培养液混匀得 到的；所述培养液是将±豆、葡萄糖和水混匀得到的；所述±豆、所述葡萄糖和所述水 配比为70-100)g; (7-10)g; 1000ml;所述±豆、所述葡萄糖和所述水的配比具体为 70g； 7g； 1000ml〇
[0014] 上述方法中，所述食用菌菌慷和培养液的质量比为1 ; (2-4);所述食用菌菌慷和 培养液的质量比具体为1 ; 2。
[0015] 上述方法中，所述发酵时间为25~30天；所述发酵温度为20-30°C。
[0016] 上述方法中，所述发酵时间具体为28天；所述发酵温度具体为25°C。
[0017]上述方法中，在将所述球毛壳菌（Chaetomiumglobosum)ND35CGMCCNo. 4136 的 抱子、所述腐植酸和所述壳聚糖混匀后还包括如下步骤：选取小于100目混匀后的产物。
[0018] 上述方法中，还包括在混匀时添加填料的步骤。
[0019] 上述方法中，所述填料为高岭±。
[0020] 本发明的另一个目的是提供由上述方法制备的生物菌肥。
[0021] 本发明的最后一个目的是提供上述生物菌肥在如下（1)-(14)中至少一种中的应 用：
[0022] (1)增加植物的株高；
[0023] (2)提高植物的叶绿素a含量；
[0024] (3)提高植物的叶绿素b含量；
[0025] (4)提高植物的叶绿素总含量；
[0026] (5)提高植物的类胡萝h素含量；
[0027] 做提高植物叶片的还原糖含量；
[002引 （7)提高植物叶片的脯氨酸含量；
[0029] (8)提高植物单株产量；
[0030] (9)增加植物的叶宽；
[0031] (10)增加植物的叶长；
[0032] (11)增加植物的地径；
[0033] (12)促进植物苗期的生长；
[0034] (13)促使植物提前开花结果；
[0035] (14)防治植物苗期巧倒病。
[0036] 上述应用中，所述植物为辣椒和/或黄瓜。
[0037] 上述球毛壳菌（Qiaetomiumglobosum)ND35CGMCCNo. 4136或其抱子或其发酵产 物在作为生物菌肥添加剂或在制备生物菌肥添加剂的产品中的应用也属于本发明的保护 范围。
[003引本发明的优势如下（1)-(5)所示：
[0039](1)本发明使用的抱子为毛壳菌的有性抱子，相对于木霉菌和非致病镶刀菌等真 菌的无性抱子，有性抱子在抗逆性方面更具有优势，能够有较长的货架期。
[0040] (2)本发明发酵球毛壳菌ND35菌株的原材料是平茹、香茹、金针茹出茹后的废弃 菌慷，该原料具有成本低、易获得、培养性状优良、物理性状好等优点。
[0041] (3)本发明中球毛壳菌ND35菌株的固体培养流程方便简单，且适于大规模培养。
[0042] (4)本发明粉剂配方中添加了腐植酸与壳聚糖。腐植酸不仅具有肥料增效、改良± 壤、刺激作物生长、改善农产品质量等功能，还能够为球毛壳菌抱子提供一个缓冲环境，提 高抱子的生存能力；壳聚糖不仅能够给抱子的萌发提供营养，而且能够诱导球毛壳菌产生 几了质酶，增强球毛壳菌对多种植物病原菌的括抗活性。
[0043] (5)本发明粉剂产品使用方法简单，可用于作物育苗前的拌种和移栽苗时的穴施， 因其活性成分--球毛壳菌ND35菌株是一种植物内生真菌，可W快速定殖于植物体内，使植 物终生受益。
[0044] (6)本发明采用简单的生产技术和生产设备，生产出的粉剂生物肥料价格低廉。该 产品不仅能够防治多种植物病害，而且还对作物具有良好的促生作用，促生作用主要表现 在生物量的增加和产量的提高，具有良好的经济效益。
[0045] 本发明通过发酵生产球毛壳菌ND35的抱子粉，然后经过粉碎、过筛后添加腐植酸 和壳聚糖，得到生物菌肥粉剂。通过试验表明；该生物菌肥粉剂不仅能够防治多种植物病 害，还对作物具有良好的促生作用，使作物在生物量和产量方面有显著的提高，具有良好的 经济效益；并且该生物菌肥粉剂使用简单，避免了飞扬的微粉，减少了环境污染。在理论上 和市场需求上都具有非常大的可行性。
【附图说明】
[0046] 图1为田间应用的球毛壳菌生物菌肥粉剂产品。
[0047] 图2为球毛壳菌生物菌肥粉剂对辣椒生长的影响。其中，A为对辣椒株高生长的 影响；B为对辣椒叶绿素含量的影响（图柱上方不同小写字母表示0. 05水平上差异显著）。
[0048] 图3为球毛壳菌生物菌肥粉剂对黄瓜苗生长的影响。其中，A为球毛壳菌生物菌 肥粉剂对黄瓜叶片中还原糖含量的影响；B为球毛壳菌生物菌肥粉剂对黄瓜叶片中脯氨酸 含量的影响（图柱上方不