专利名称：同时检测木质部难养菌和柑桔麻风病毒病多重rt-pcr检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于一种RT-PCR检测方法及其检测用试剂盒，具体的说，涉及一种同时检 测木质部难养菌和柑桔麻风病毒病多重RT-PCR检测方法及试剂盒。
背景技术：
柑桔是世界第一大水果，我国柑桔栽培面积和产量均居世界首位，在国民经济中 占有十分重要的地位。近几年来，随着我国柑桔产业的发展和优势产业带的确立，柑桔的种 植区域更趋集中，面积亦进一步扩大，而病害问题日益引起生产者的重视。柑桔杂色褪绿病是由木质部难养菌(Xyllela fastidiosa)引起的一种细菌性 病害，于1987年首次在巴西的圣保罗和Minas Gerais地区发现，由带病苗木和叶蝉、沫 蝉等昆虫介体传播。迄今，该病已蔓延到巴西的各个柑桔产区和阿根廷、巴拉圭等南美国 家，并对美国柑桔产业构成了威胁。杂色褪绿病能危害大多数柑桔种及其杂种，造成植株 生长缓慢，产量降低；果实小而硬，失去经济价值。柑桔麻风病是由柑桔麻风病毒(Citrus leprosis virus, CiLV)引起的一类重要柑桔病毒病害，于20世纪20年代首次在巴拉圭发 现，主要由短须螨(Brevipalpus spp.)传播。目前该病主要分布于巴西、阿根廷、巴拿马、 委内瑞拉等南美洲国家，严重威胁到北美和加勒比地区的柑桔产业，最近在美国佛罗里达 州已检测到该病。在亚洲和非洲也曾报道发现有类似柑桔麻风病症状的植株，但实验证实 均不是CiLV引起的。感病叶片、果实和枝干上表现典型褪绿斑症状，严重时落叶落果，病树 产量下降，进而枯萎；当很多病斑出现时可相互接合，最后导致嫩枝死亡，严重时导致植株 死亡。柑桔杂色褪绿病和柑桔麻风病在我国尚未发生，但我国存在传播这两种病害的虫 媒。因此检疫是杜绝病害在我国发生的重要手段。迄今为止，由于高特异性和灵敏性，PCR 和RT-PCR是检测这两种病害最为高效的方法。Pooler与Hartung( 1995)根据RAPD-PCR产 物的测序结果，设计了多对引物，用常规PCR扩增X. fastidiosa ;P00ler等(1997)用引物 对272-1、272-2和引物对272-l-int、272-2_int建立了一种目标片段为500bp的巢式PCR， 大大提高了检测灵敏度。Oliveira等(2002)根据Pooler与Hartung的常规PCR引物，选 择设计了一对引物建立了实时定量PCR方法，评价X. fastidiosa在不同寄主和不同季节 的时空变化。通过构建cDNA文库并测序，Locali等(2003)和Guerra-Moreno等(2004)分 别依据所测序列，设计引物扩增CiLV。多重PCR技术可以实现同时检测多个病原微生物，具 有高效、低成本、快速等优点，已在多种病原微生物检测中得以应用。但尚未见对柑桔杂色 褪绿病和柑桔麻风病病原多重RT-PCR检测研究的报告。近年来由于各国柑桔种质资源交流日益频繁，柑桔杂色褪绿病和柑桔麻风病传入 我国的可能性亦加大，但我国口岸缺乏对这两种病害病原的检测方法。因此，发展快速有效 的病原诊断和检测方法及研制相关试剂盒投入使用，将有效阻击外来有害生物入侵，未雨 绸缪保障我国柑桔产业可持续发展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有传统检测技术中的不足之处，提供一种用于同时检测 木质部难养菌和柑桔麻风病毒的特异性强、灵敏度高的多重RT-PCR检测方法，并在此基础 上研制出同时检测该两种病原的多重RT-PCR检测试剂盒，适合大规模、高通量样品检测。本发明目的是这样实现的
本发明从已报道的检测木质部难养菌和柑桔麻风病毒的所有引物对中筛选出两对引 物，其中来源于木质部难养菌假定蛋白区域的特异性引物，碱基序列为 上游引物:5，-GCC GCT TCG GAG AGC ATT CCT-3，； 下游引物:5，-CTC CTC GCG GTT AAG CTA C-3，； 来源于柑桔麻风病毒假定运动蛋白的特异性引物，碱基序列为 上游引物:5，-TGT ATA CCA AGC CGC CTG TGA ACT-3，； 下游引物:5，-GCG TAT TGG CGT TGG ATT TCT GAC-3， 本发明的目的可通过如下措施来实现 1、核酸提取
(1)称取5-10啤寄主皮、叶或果皮装入一无菌离心管中，在液氮中研磨；
(2)依次加入60μ L TES缓冲液和60 μ L饱和酚氯仿异戊醇(25 24 1),混勻；
(3)70°C水浴5 10分钟，室温下13 OOOrpm离心5分钟；
(4)吸取4(^1^上清液加入5印1^(1^G-50-80构成的微柱中，置于一新的无菌离心管；
(5)5OOOrpm离心4分钟，收集洗脱液。2、RT-PCR 扩增
将反转录和扩增反应所需试剂一次性加入反应管，整个实验过程无需开盖。多重RT-PCR 反应体系5XAMV buffer 1. 25 μ IUOmM dNTP 0. 5 μ 1U00U MLV
0.15 μ 1、40U Rnasin 0. 15 μ 1、5U Taq酶0· 35 μ 1U0XPCR buffer 2. 5 μ 1、25 mM MgCl2 1μ lUOymol/L木质部难养菌引物各1μ lUOymol/L柑桔麻风病毒引物各1μ 1、模板 1μ 1、加 DEPC 7jC至 25 μ 1。扩增条件420C30min,94°C 2min ；然后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 45s，共 35 个循环；最后72°C延伸7min。3、PCR产物电泳检测
取扩增产物5 μ 1，在1. 5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在Bio-Rad凝胶成像系统观察结^ ο4、结果分析
4.1多重RT-PCR特异性
木质部难养菌和柑桔麻风病毒在多重扩增中均得到了清晰特异的预期扩增条带，木质 部难养菌的预期条带为500bp，柑桔麻风病毒的预期条带为339bp。以混合模板单引物、单 模板混合引物、混合模板混合引物三种反应模式均验证本发明所涉及引物的特异性，三种 模式扩增均产生特异预期条带，而引物间及引物与模板间没有发生交叉反应，每个RT-PCR 反应都产生大小为500bp和339bp的特异性条带。水对照和阴性对照无扩增条带，见附图1。
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4. 2多重RT-PCR灵敏度
将核酸模板进行10倍梯度稀释后进行多重RT-PCR扩增，木质部难养菌可检测到的最 高灵敏度为10pg，柑桔麻风病毒可检测到的最高灵敏度为lOOpg，见附图2。本发明的同时检测木质部难养菌和柑桔麻风病毒多重RT-PCR检测试剂盒由以下 试剂构成木质部难养菌上游引物、木质部难养菌下游引物、柑桔麻风病毒上游引物、柑桔 麻风病毒下游引物、100U MLV 反转录酶、40U Rnasin,5U Taq 酶、10mmol/LdNTP、25mmol/ LMgCl2,5XMLV bufferUOXPCR buffer和DEPC水组成。一次检测所用组分量为木质 部难养菌上下游引物各1 1 ；柑桔麻风病毒上下游引物各Ιμ ;5XMLV buffer 1.25μ1； IOmM dNTP 0. 5 μ 1 ； 100U MLV 0· 15 μ 1 ；40U Rnasin 0· 15 μ 1 ； 5U Taq 酶 0· 35 μ 1 ； 10 X PCR buffer 2. 5μ 1 ；25 mM MgCl2 1 μ 1 ；力口 DEPC 水至 25 μ 1。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
速度快，从样品制备到获取检测结果仅需6小时，特别适合口岸检疫；重复性好、稳定 性高。同一样品的不同检测批次，不同人员操作，其结果一致性强；试剂盒产品操作简便，适 合大规模、高通量的样品分析。
图1 多重RT-PCR特异性分析的电泳图。M :100bpDNA标准分子量；从左到右的电 泳带为1 阴性对照；2-3 柑桔麻风病毒(339bp) ；4-5 木质部难养菌(500bp) ；6-7 木质部 难养菌和柑桔麻风病毒。图2 多重RT-PCR灵敏度分析的电泳图。M IOObpDNA标准分子量；从左到右的电 泳带为1 阴性对照；2-6 木质部难养菌(500bp)和柑桔麻风病毒(339bp)的多重RT-PCR 灵敏度检测，所对应的核酸量依次为10ng，lng, lOOpg, 10pg, Ipgo图3 多重RT-PCR检测巴西柑桔病样结果。M :100bpDNA标准分子量；从左到右 的电泳带为1 阴性对照；2-6 :巴西柑桔病样中木质部难养菌(500bp)和柑桔麻风病毒 (339bp)多重扩增检测结果。
具体实施例方式实施例1
实施例1
多重RT-PCR检测方法用于同时检测巴西柑桔病样中木质部难养菌和柑桔麻风病毒 (1)核酸提取
称取5-10 mg柑桔皮、叶或果皮装入一无菌离心管中，在液氮中研磨后依次加入60 μ TES缓冲液和60 III乪和酚氯仿异戊醇(25 24 :1)，混勻。70°C水浴5 10分钟。室
温下13 OOOrpm离心5分钟，吸取40 μ 丨二清液加入由S印hadex G-50-80构成的微柱中，
置于一新的无菌离心管，5 OOOrpm离心4分钟，收集洗脱液，-20°C冰箱中保存备用。(2 )多重 RT-PCR 检测
多重RT-PCR反应体系:5XMLV buffer 1. 25μ|、10mM dNTP 0. τ μ 100U MLV 0. 15μ1、40U Rnasin 0·15μ1、5υ Taq 酶 0· 35 μ!、10XPCR buffer 2 ]μ1、25 mM MgCl2 1 μ ο pmoi/L木质部难养菌引物各ι μ!、ιο pmoi/L柑桔麻风病毒引物各ι μ 、模板ι μ!、加 DEPC 水至 25 μ 。扩增条件420C30min,94°C 2min ；然后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 45s，共 35 个循环；最后72°C延伸7min。(3 )电泳检测、PCR产物测序
取扩增产物。μ 在1. 5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在Bio-Rad凝胶成像系统观察结 果。PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成。(4)巴西柑桔病样中木质部难养菌和柑桔麻风病毒多重RT-PCR检测结果 木质部难养菌的扩增条带为500bp，柑桔麻风病毒的扩增条带为339bp。电泳结果如图3。实施例2 —种同时检测木质部难养菌和柑桔麻风病毒的多重RT-PCR试剂盒。该试剂盒由以下试剂组成木质部难养菌上游引物100 |J1、木质部难养菌下游引
物100 JUl、柑桔麻风病毒上游引物100 μ!、柑桔麻风病毒下游引物100 μ!、100U MLV 20 μ
、40U Rnasin 20pl、5U Taq 酶 35 μ 、lOmmol/LdNTP 50 μ 、25mm。l/LMgCl2 100 μ1、5XMLV buffer ImLUOXPCR buffer 2M1、DEPC 水 2mL。
权利要求
一种同时检测木质部难养菌和柑桔麻风病毒病多重RT PCR检测方法，其特征在于以木质部难养菌上游引物、木质部难养菌下游引物、柑桔麻风病毒上游引物、柑桔麻风病毒下游引物对待侧样品进行RT PCR扩增，最后电泳鉴定；所述木质部难养菌特异性引物上游引物5’ GCC GCT TCG GAG AGC ATT CCT 3’下游引物5’ CTC CTC GCG GTT AAG CTA C 3’；所述柑桔麻风病毒特异性引物上游引物5’ TGT ATA CCA AGC CGC CTG TGA ACT 3’下游引物5’ GCG TAT TGG CGT TGG ATT TCT GAC 3’。
2.根据权利要求1所述同时检测木质部难养菌和柑桔麻风病毒病多重RT-PC检测方 法，其特征在于所述木质部难养菌特异性引物产物大小为500bp，所述柑桔麻风病毒特异 性引物产物大小为339bp。
3.一种同时检测木质部难养菌和柑桔麻风病毒病的检测试剂盒，其特征在于所述试 剂盒内包括权利要求1所述的木质部难养菌特异性引物和柑桔麻风病毒特异性引物。
4.根据权利要求3所述同时检测木质部难养菌和柑桔麻风病毒病的检测试剂盒，其特 征在于所述试剂盒由以下试剂构成10ymol/L木质部难养菌上游引物、lOymol/L木质 部难养菌下上游引物、10 μ mol/L柑桔麻风病毒上游引物、10 μ mol/L柑桔麻风病毒下游 引物、100U MLV 反转录酶、40U Rnasin,5U Taq 酶、10mmol/LdNTP、25mmol/LMgC12、5XMLV bufferUO X PCR buffer 和 DEPC 水。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测木质部难养菌和柑桔麻风病毒病多重RT-PCR检测方法及试剂盒，其关键在于以木质部难养菌上游引物、木质部难养菌下游引物、柑桔麻风病毒上游引物、柑桔麻风病毒下游引物对待侧样品进行RT-PCR扩增，最后电泳鉴定。同时也提高了一种产品操作简便，适合大规模、高通量的样品分析的检测试剂盒。速度快，从样品制备到获取检测结果仅需6小时，特别适合口岸检疫；重复性好、稳定性高。同一样品的不同检测批次，不同人员操作，其结果一致性100％；试剂盒产品操作简便，适合大规模、高通量的样品分析。
文档编号C12Q1/68GK101914634SQ20101028206
公开日2010年12月15日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者周常勇, 周彦, 唐科志, 李中安, 杨方云, 王晶, 王雪峰, 鲁昕 申请人:西南大学