专利名称：甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝tt16基因家族及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及甘蓝型油菜(Brassica napus)及其亲本 物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea) TT16 (TRANSPARENT TESTA16，透 明种皮 16 ；又称 ABS，ARABIDOPSIS BSISTER ；或 AGL32，AGAM0US-LIKE 32)基因家族及其应用。
背景技术：
十字花科(Brassicaceae)的芸薹属(Brassica)包括很多油料作物、蔬菜和观赏 植物品种，为人类提供营养价值丰富的食用油、蔬菜和观赏植物，并为畜牧业提供饲料，具 有重要的经济价值。在芸薹属物种中，异源四倍体物种甘蓝型油菜是由2个二倍体物种白 菜和甘蓝通过种间杂交后再加倍而形成的。甘蓝型油菜是世界第二大油料作物，在全世界 广泛种植，栽培面积和产量仅次于大豆。白菜和甘蓝也是重要的油料、蔬菜和观赏作物。对 甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝功能基因的比较基因组学研究将为揭示它们之间的 遗传进化关系提供理论基础，并为芸薹属作物的性状改良提供应用基础。籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。甘蓝型油菜黄籽品系具有种皮薄、皮壳 率低、粗纤维含量低、含油量高、饼粕蛋白含量高等优点，与黑籽品系相比，饼粕的经济价值 和油的品质都有所提高。虽然白菜和甘蓝中均存在表型稳定的天然黄籽基因型，但自然界 中不存在天然的甘蓝型油菜黄籽基因型。已有的甘蓝型油菜黄籽材料主要通过远缘杂交等 方式而创造，存在黄籽率和黄籽度不高，表型不稳定，易受环境影响而变异，选育效率低，育 种周期长，负相关性状难以克服等缺点，远远不能满足生产要求。因此，获得稳定遗传的甘 蓝型油菜黄籽性状成为甘蓝型油菜育种的重要目标。长期以来，全世界众多研究者对该性 状进行了广泛研究，但到目前为止对于黄籽性状形成的分子机理仍不清楚，更没有通过转 基因分子育种创造黄籽性状的任何报道。类黄酮物质是广泛存在于植物界的次生代谢物质，是植物组织中红色、蓝色和紫 色等花青素苷色素的呈色物质。拟南芥(Arabidopsis thaliana)等植物种皮色素的主 要成分为原花青素(proanthocyanidin，PA)单体的聚合物，其是经公共苯丙烷途径-类 黄酮途径-原花青素途径合成的。目前的研究表明，类黄酮生物合成的调控是由转录因 子的协同作用来完成的，而这些转录因子表达的时空特性受到精密调控。已知WD40、MYB、 bHLH、MADS-box、WRKY和bZIP转录因子都参与了类黄酮途径的调控，其中MADS_box (TT16)、 WRKY(TTG2)和bZIP(TTl)转录因子在此途径中的作用还没有彻底明确。芸薹属和拟南芥同 属十字花科，具有较近的亲缘关系。拟南芥TT16(AtTT16)基因编码MADS-box转录因子，研 究发现其对于BAN基因的表达和原花青素在内种皮中的积累是必需的。拟南芥ttl6突变 体表现为透明种皮即黄籽性状，且内种皮细胞变得不规则，推测该基因可能还参与调控内 种皮细胞分化和发育，但具体作用和机制尚不清楚。因此，在芸薹属中对TT16基因进行同 源克隆和功能鉴定，是筛选甘蓝型油菜黄籽位点的重要途径。
芸薹属和拟南芥起源于同一祖先，约在1700 1800万年前发生分离，芸薹族植物 发生了基因组水平的三倍化，即芸薹属基本种白菜(AA组，529Mbp)、甘蓝(CC组，696Mbp) 和黑芥(BB组，632Mbp)等的基因组约相当于拟南芥基因组(157Mbp)的3倍，而甘蓝型油 菜(AACC组，1132Mbp)的基因组相当于甘蓝和白菜两个基因组之和，约相当于拟南芥基因 组的6倍，也就是说，在拟南芥中为单拷贝的基因在甘蓝和白菜中可能分别有3个对应的拷 贝，而在甘蓝型油菜中可能有6个拷贝。目前对TT16基因的研究报道较少，而TT16基因在 甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属物种中的成员数、蛋白特征、进化关系、表达的组织特异性 及与黄籽性状的关系等都未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16
基因家族。为达到上述目的，本发明采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术，分别克隆了甘蓝型 油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族成员的全长cDNA和对应的基因组序列，并进 行了系统分析。结果显示所述白菜TT16(BrTT16)基因家族包括以下3个成员BrTT16_l基因、BrTT16_2基 因和BrTT16-3基因；所述BrTT16_l基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，BrTT16_2 基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 4所示，BrTT16_3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 6 所示；所述甘蓝TT16(BoTT16)基因家族包括以下3个成员BoTT16_l基因、BoTT16_2基 因和BoTT16-3基因；所述BoTT16-l基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 8所示，BoTT16_2 基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 10所示，BoTT16_3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 12所示；所述甘蓝型油菜TT16(BnTT16)基因家族包括以下6个成员ΒηΤΤ16-1基因、 ΒηΤΤ16-2 基因、ΒηΤΤ16_3 基因、ΒηΤΤ16_4 基因、ΒηΤΤ16_5 基因和 ΒηΤΤ16_6 基因；所述 ΒηΤΤ16-1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 14所示，BnTT16_2基因的全长cDNA序列如 SEQ ID No. 16所示，BnTT16_3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 18所示，BnTT16_4基因 的全长cDNA序列如SEQ ID No. 20所示，BnTT16_5基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 22 所示，BnTT16-6基因的全长cDNA序列如SEQ ID No. 24所示。进一步，所述BrTT16-l基因的基因组序列如SEQ ID No. 1所示，BrTT16_2基因的 基因组序列如SEQ ID No. 3所示，BrTT16-3基因的基因组序列如SEQ ID No. 5所示；所述BoTT16-l基因的基因组序列如SEQ ID No. 7所示，BoTT16_2基因的基因组 序列如SEQ ID No. 9所示，BoTT16-3基因的基因组序列如SEQ ID No. 11所示；所述BnTT16-l基因的基因组序列如SEQ ID No. 13所示，ΒηΤΤ16_2基因的基因组 序列如SEQ ID No. 15所示，ΒηΤΤ16_3基因的基因组序列如SEQ ID No. 17所示，ΒηΤΤ16_4 基因的基因组序列如SEQ ID No. 19所示，ΒηΤΤ16_5基因的基因组序列如SEQ ID No. 21所 示，ΒηΤΤ16-6基因的基因组序列如SEQ ID No. 23所示。上述3个物种的12条ΤΤ16基因与AtTT16基因具有较高的同源性，基因组序列一 致性为67. 1 70. 3%，编码区序列一致性为82. 9 87. 0%，编码蛋白的氨基酸序列的一致性和相似性分别为73. 0 78. 2%和78. 2 85. 7 %，核酸水平和氨基酸水平的序列比 对、系统发生聚类等方面都表明，它们是AtTT16基因的垂直同源基因。这3个物种的12条 TT16基因之间也具有很高的同源性，基因组序列一致性为69. 4 100. 0%，编码区序列一 致性为85. 2 100. 0%，编码蛋白的氨基酸序列的一致性和相似性分别为75. 1 100%和 80. 4 100% ；其中，甘蓝型油菜的BnTT16-l、BnTT16-4、BnTT16-6基因分别来源于白菜的 BrTT16-l、BrTT16-2、BrTT16_3 基因，而甘蓝型油菜的 BnTT16_2、ΒηΤΤ16_3、ΒηΤΤ16_5 基因 分别来源于甘蓝的 ΒοΤΤ16-1、ΒοΤΤ16-2、ΒοΤΤ16-3 基因。BnTT16、BrTT16、BoTT16 基因家族 保持了与AtTT16基因类似的器官特异性，主要在生殖器官中表达，以花和发育中的种子表 达最高，并随着种子的发育进程而逐渐下降。此外，TT16基因在甘蓝型油菜和白菜的黑籽 与黄籽材料中的表达存在着较明显的差异，而在甘蓝的黑籽与黄籽材料中无明显差异，说 明甘蓝型油菜和白菜的黄籽性状与TT16基因表达下调有关，而甘蓝的黄籽性状与TT16基 因几乎没有关系。基于上述结果，利用本发明的BnTT16、BrTT16、BoTT16基因家族中的任一种或多 种基因或基因截短片段，可以构建TT16基因重组表达载体和转化体，用于TT16基因的正义 表达、反义抑制、RNA干扰等。本发明的目的之二在于提供所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因 家族在芸薹属作物种子性状的分子育种中的应用。进一步，所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族在甘蓝型油菜 黄籽性状的分子育种中的应用。为达到上述目的，本发明选取甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家 族特异保守保守区段BTT16I(核苷酸序列如SEQ ID No. 14中第353 966位碱基所示)为 RNA干扰片段，以基于PTOC5941改造的植物RNA干扰基础载体pFGC5941M为骨架，将BTT16I 分别以反义和正义方式同时插入ρΚΧ5941Μ的CaMV35S启动子和OCS终止子之间形成反向 重复序列，构建了芸薹属TT16基因家族RNA干扰载体preC5941M-BTT16I，并通过农杆菌转 化法转化了甘蓝型油菜典型黑籽品种中双10号，所得阳性转基因植株的性状调查发现，通 过RNA干扰沉默BnTTie基因家族后，转基因植株的背景性状正常，转基因种子明显变小且 种皮色素明显减少，多数呈黄褐色和黄棕色，与非转基因种子的典型黑籽形成鲜明对比。说 明在甘蓝型油菜等植物中，TT16基因同时调控种子大小发育、种皮色素积累等性状的形成， 可以应用于芸薹属作物种子性状的分子育种，尤其是甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种，利 于创造出新型的甘蓝型油菜黄籽材料，也可以超量表达后用于增加种子的大小，提高种子 千粒重。本发明的有益效果在于本发明提供了 TT16基因在甘蓝型油菜及其亲本物种白 菜和甘蓝中的成员数、各成员的全长cDNA序列和基因组序列、编码蛋白特征、进化关系、表 达的组织特异性等，并确认了 TT16基因家族同时参与种子大小的发育和种皮色素的积累， 由此本发明提供了 TT16基因在芸薹属作物种子性状改良特别是甘蓝型油菜黄籽性状的分 子育种中的应用，应用前景好。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图 1 为 BnTT16 (A)、BrTT16 (B)、B0TTI6 (C)基因家族 5，cDNA 末端的扩增。图 2 为 BnTT16 (A)、BrTT16 (B)、B0TTI6 (C)基因家族 3，cDNA 末端的扩增。图3为BnTT16(A)、BrTT16(B)、BoTT16(C)基因家族成员全长cDNA的扩增，其 中1采用引物组合FBT16-l+RBT16-2，2采用引物组合FBT16-3+RBT16-4，3采用引物组合 FBT16-5+RBT16-6。图4为BnTTie (A)、BrTT16 (B)、BoTTie(C)基因家族成员基因组DNA的扩增，其 中1采用引物组合FBT16-l+RBT16-2，2采用引物组合FBT16-3+RBT16-4，3采用引物组合 FBT16-5+RBT16-6。图5为BrTT16、B0TTI6、BnTT16基因家族成员及AtTT16基因mRNA的序列比对。图6为BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白及AtTT16蛋白的氨基酸序列比对。图7为肚1716、801716、8111716基因家族成员与六忖116基因1111 離的聚类分析。图8为BrTT16、BoTT16、BnTT16家族蛋白与AtTT16蛋白的聚类分析。图9为BrTT16、B0TTI6、BnTT16基因家族成员的Southern杂交鉴定，其中M为地 高辛标记的分子量标准。图10为BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族总体和成员的器官特异性表达检测。图11为白菜、甘蓝、甘蓝型油菜的黑籽、黄籽材料主要生殖器官中TT16基因家族 总体和成员的表达。图12为RNA干扰片段BTT161的PCR扩增。图13为RNA干扰载体pFGC5941M_BTT16I的结构图。图14为RNA干扰载体PreC5941M_BTT16I构建中的酶切和PCR鉴定，其 中 A 为 Swa I+Aat11 双酶切 pMD19-T_BTT16I，M 为 DNA marker, CK 代表酶切前的 PMD19-T-BTT16I ；B 为 Swa I+Aat11 双酶切 pFGC5941M, M 为 DNA marker, CK 代表酶切前 的 pFGC5941M ；C 为 pFGC5941M_BTT16IA 的克隆子菌液 PCR 检测；D 为 BamH I+Xba I 双酶 切 pMD19-T-BTT16I, M 为 DNA marker, CK 代表酶切前的 pMD19-T_BTT16I ；E 为 BamH I+Xba I 双酶切 pFGC5941M-BTT16IA ；M 为 DNAmarker，CK 代表酶切前的 pFGC5941M_BTT16IA ；F 为 PFGC5941M-BTT16I 的克隆子菌液 PCR 检测，M 为 DNA marker 图15为再生植株的Basta复检鉴定，其中CK为非转基因植株，1-3为再生植株。图16为再生植株的PCR检测结果，其中M为DNA marker, CK为阳性对照，1为阴 性对照，2-15为再生植株。图17为转基因种子(左)和非转基因种子(右)的比较。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。优选实施例采用的植物材料白菜材料均来自于白菜型油菜亚种(B.rapa ssp. oleifera)，包括黑籽系09L597和黄籽系09L600 ；甘蓝材料均来自于羽衣甘蓝变种 (B. oleracea var. acephala)，包括黑籽系09L598和黄籽系09L599 ；甘蓝型油菜材料包括黑籽系5B和籽色近等基因系(黑籽系09L588、黄籽系09L587)，均由重庆市油菜工程技术 研究中心选育和大田常规种植，并经过了 10代以上的单花序套袋自交；甘蓝型油菜黑籽品 种中双10号由中国农业科学院油菜作物所选育，种子由重庆市油菜工程技术研究中心提供。优选实施例采用的试剂Easy-Taq DNA聚合酶[5U/ μ 1，附10 X PCR Buffer (含 Mg2+)]购自北京全式金生物技术有限公司；LA Taq DNA聚合酶[5U/μ 1，附10XLA PCR Buffer II (含Mg2+)]、λ-HindIII DNA marker等购自宝生物工程(大连)有限公司；限制 性内切酶DraI、EcoRI、EcoRV, HindIII、尼龙膜、地高辛标记的DNA marker等购自立陶宛 MBI Fermentas公司；pMD19_T载体购自宝生物工程(大连)有限公司，MS (Murashige and Skoog medium)培养基购自荷兰Duchefa公司，结冷胶购自浙江中肯生物科技有限公司，其 它分子、生化和植物组织培养试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司和上海稼丰园 艺用品有限公司；改进型植物RNA干扰基础载体PTOC5941M是在pTOC5941的基础上改进而 成，改进之处是采用来自甘蓝型油菜的BnPAP2基因第2内含子(BnPAP2I2)替换pTOC5941 上过长的PhChsA间隔区，并在间隔区与启动子间增加一个AatII切点。优选实施例采用的试剂盒小量植物组织RNA抽提试剂盒(W7021)购自上海华舜 生物工程有限公司，小量胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自Omego公司，PMD19-T载体连 接试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，GeneRacer Kit购自美国Invitrogen公司，PCR DIG ProbeSynthesis Kit、DIG Easy Hyb>DIG Wash and Block Buffer Set、DIG Nucleic Acid Detection Kit 均购自德国 Roche 公司，RNA PCR Kit(AMV) Ver. 3.0 购自宝生物工程 (大连)有限公司。一、甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族的克隆1、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝基因组总DNA的提取取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的嫩叶，采用 十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因组总DNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样 品的质量和浓度。1. 0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的3个物种的基因组总DNA完整性 好，平均分子量均大于λ -HindIII DNA Marker的23kb条带，RNA消化比较完全，经分光光 度法检测纯度较高，可以直接用于PCR扩增及Southern杂交。2、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝各器官总RNA的提取取大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的蕾(Bu)、 花(Fl)以及4个发育阶段的种子[甘蓝型油菜和甘蓝取开花后15天(15D)、30天(30D)、45 天(45D)和55天(55D)的种子；白菜取开花后10天(IOD)、25天(25D)、40天(40D)和45 天(45D)的种子]；以及大田常规条件下栽培的甘蓝型油菜09L587和09L588、白菜09L597 和 09L600、甘蓝 09L598 和 09L599 的根(Ro)、下胚轴(Hy)、子叶(Co)、茎(St)、叶(Le)、蕾、 花、荚果皮(SP)以及4个发育阶段的种子(甘蓝型油菜和甘蓝取15D、30D、45D和55D的种 子；白菜取10D、25D、40D和45D的种子)共12个器官；采用小量植物总RNA抽提试剂盒提 取各器官总RNA，采用电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。1. 0%琼脂糖凝胶 电泳结果显示，获得的总RNA特征条带清晰，且无明显RNA降解和DNA污染，经分光光度法 检测纯度较高，能够满足RACE操作的基本要求。3、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝RACE第一链cDNA的获得
分别取甘蓝型油菜5B、白菜09L597和甘蓝09L598的蕾、花和4个发育阶段的种 子的总RNA混合成总量为5 μ g的RNA样品，采用GeneRacer Kit按其说明书进行一系列的 RACE操作，最终反转录获得在3’端和5’端同时锚定有人工接头序列的第一链cDNA，PCR 放大后进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，三个物种的第一链cDNA呈现出大小在 200bp IOkb的拖带，重心区域在500bp 4kb，最核心区在1. 5kb左右，说明反转录比较 完全，得到了较高质量的总cDNA，可用于克隆甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族完整 的cDNA末端。4、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族5’ cDNA末端的克隆根据AtTT16基因序列多重比对的结果，设计了对应于两个最保守点的反向引物R TT16-50(5，-ggatcgttttgaagattaggctgagcaag-3，)和 RBT16RT(5，-gctcgtgtggaggaatgga gg-3’)。分别以白菜、甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，用GeneRacer Kit提供的引物 5，P (5，-cgactggagcac-gaggacactga-3，)与 RTT16-50 配对,进行 5，cDNA 末端的 RACE — 扩。50 μ 1 标准 Taq PCR 扩增体系为10 X PCR Buffer 5. 0 μ 1，25mmol/L 的 MgCl23. 0 μ 1， 10mmol/L 的 dNTPs 1.0 μ 1，10 μ mol/L 的正向引物 1. 0 μ 1，10 μ mol/L 的反向引物 1. 0 μ 1， 5U/ μ 1的Taq酶0. 5 μ 1，模板0. 5 μ 1，加双蒸水至总体积为50 μ 1。PCR扩增循环参数为 94°C预变性2分钟；再94°C变性1分钟，52 °C退火1分钟，72 °C延伸1分钟，共30个循环； 最后72°C延伸10分钟。以一扩产物为模板，用 GeneRacer Kit 提供的引物 5’NP (5’-ggacactgacatggactg a-aggagta-3，)与RBT16RT配对，进行5，cDNA末端的RACE巢扩，PCR扩增体系与一扩相同 但模板改为0. 1 μ 1，PCR扩增循环参数为94°C预变性2分钟；再94°C变性1分钟，58°C退 火1分钟，72°C延伸1分钟，共25个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产物进行1. 0%琼脂 糖凝胶电泳检测(图1)，采用小量胶回收试剂盒回收目标片段，与PMD19-T载体连接，再转 化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素(Amp)、IPTG和Χ-gal的LB平板培养至 蓝白斑清晰，挑取白斑单菌落，用含有Amp的LB液体培养基增菌培养后，取菌液进行PCR检 测，结果阳性克隆子表现出明显的长度多态性，各挑选10个具有代表性的阳性克隆子委托 上海英潍捷基生物技术有限公司进行测序。测序结果表明BrTT16基因家族的5’ cDNA末 端介于429 681bp之间，B0TTI6基因家族的5，cDNA末端介于448 658bp之间，BnTT16 基因家族的5，cDNA末端介于526 649bp之间。NCBI BLASTn表明，这些5，cDNA末端与 AtTT16/ABS mRNA(AJ318098)具有很高的一致性，表明它们的确为芸薹属TT16基因家族的 5’ cDNA 末端。5、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族3’ cDNA末端的克隆根据AtTT16基因序列多重比对的结果，设计了对应于两个最保守点的正向引物 FTT16-30(5，-tgagctctct(g/a)ttctctg(c/t)gatgc-3，)和 FTT16_3N(5，-ctcacatcggtctc atcgtcttctc-3')。分别以白菜、甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，用GeneRacer Kit提 供的弓丨物 3，P(5，-gctgtcaacga-tacgctacgtaacg-3，)与 FTT16-30 配对，进行 3，cDNA 末 端的RACE—扩。PCR扩增体系和扩增循环参数与5’ cDNA末端的RACE—扩相同。以一扩产物为模板，用GeneRacer Kit提供的引物3’ N P (5，-cgctacgtaacggcatgacagtg-3，)与 FTT16-3N 配对，进行 3，cDNA 末端的 RACE 巢扩， PCR扩增体系和扩增循环参数与5’ cDNA末端的RACE巢扩相同。PCR产物如前法所述进行电泳检测(图2)、胶回收、PMD19-T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、 菌液PCR鉴定和测序。测序结果表明BrTT16基因家族的3，cDNA末端介于778 853bp 之间，B0TTI6基因家族的3，cDNA末端介于733 936bp之间，BnTT16基因家族的3，cDNA 末端介于687 820bp之间[均不包括poly (A)]。NCBI BLASTn表明，这些3，cDNA末端与 AtTT16/ABS mRNA基因具有很高的一致性，表明它们的确为芸薹属TT16基因家族的3’cDNA 末端。6、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族成员全长cDNA的克隆根据BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族5，和3，cDNA末端的测序结果，设计了 3条 正向引物和3条反向引物(表1)，得到3对引物组合:FBT16-l+RBT16-2、FBT16-3+RBT16-4、 FBT16-5+RBT16-6 ；分别以白菜、甘蓝、甘蓝型油菜第一链cDNA为模板，采用上述引物组合 和50 μ 1标准Taq PCR扩增体系，扩增BnTT16、BrTT16、B0TTI6基因家族各成员的全长 cDNA，PCR扩增循环参数为94°C预变性2分钟，再94°C变性1分钟、54 57°C退火1分钟、 72°C延伸2分钟，共35个循环，最后72°C延伸10分钟；再如前法所述进行电泳检测(图3)、 胶回收、PMD19-T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和测 序。表lBrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成员全长cDNA的扩增引物
引物名称引物序列(5’—3’)核苷酸数(nt)解链温度(°c)FBT16-1ggatccgagaaagtctgattaagcatattattccc3561.80/67.01FBT16-3ggatccaaaagcaacttatagatgtatatatgtaagg3759.35/64.68FBT16-5ggatccacacacgctatacacacggagtta3062.86/68.73RBTl 6-2CCCggggatgatgaatgattattatgattaatataatC3856.96/64.69RBT16-4cccggggatggctagttaatcatataatcaagacc3561.80/69.36RBTl 6-6CCCgggagatgtaatgatgattgattatataattaaag3856.96/64.69 结果以白菜第一链总cDNA为模板，引物组合分别为FBNA10-6+RBRA10-10、 FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6，各扩增得到 1 条长度分别为 1060bp、1242bp、1123bp 的全长 cDNA，分别命名为 BrTT16-lmRNA、BrTT16_2mRNA 和 BrTT16_3mRNA。 以甘蓝第一链总cDNA为模板，引物组合分别为FBNA10-6+RBRA10-10、 FBT16-3+RBT16-4、FBT16-5+RBT16-6，各扩增得到 1 条长度分别为 1087bp、1028bp、1134bp 的全长 cDNA，分别命名为 BoTT16-lmRNA、BoTT16_2mRNA 和 BoTT16_3mRNA。
以甘蓝型油菜第一链总cDNA为模板，引物组合为FBT16-1+RBT16-2，扩增得到2条 长度分别为1060bp和1084bp的全长cDNA，分别命名为BnTT16_lmRNA和BnTT16_2mRNA ；引 物组合为FBT16-3+RBT16-4，扩增得到2条长度分别为1214bp和1243bp的全长cDNA，分别 命名为BnTTl6-3mRNA和BnTT16_4mRNA ；引物组合为FBT16-5+RBT16-6，扩增得到2条长度 分别为 1128bp 和 1123bp 的全长 cDNA，分别命名为 BnTT16_5mRNA 和 BnTT16_6mRNA。VectorNTI Advance 9. 0 多重比对表明，所得的 BnTT16、BrTT16、BoTT16 基因家族 的全长cDNA均有相应的RACE末端克隆子序列与之对应，说明它们均是可转录表达的基因。 多重比对还表明，3个物种中RACE末端所指示的各独立基因均已获得了对应的全长cDNA。7、甘蓝型油菜、白菜和甘蓝TT16基因家族成员基因组DNA的克隆
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根据BrTT16、B0TTI6、BnTT16基因家族成员全长cDNA的序列多重比对结 果，设计检测各成员的特异引物组合FBT16-1S+RBT16-12S、FBT16-2S+RBT16-12S、 FBT16-34S + RBT16-3S、FBT 1 6 - 34 S + RBT16-4 S、FBT16 - 56 S + RBT16 - 5 S、 FBT16-56S+RBT16-6S (表 2)；根据 BrTT16、BoTT16、BnTT16 基因家族 RACE 末端和全长 cDNA 的克隆结果，分别以白菜09L597、甘蓝09L598、甘蓝型油菜5B的基因组总DNA为模板，采用 上述全长cDNA的扩增引物组合和50 μ 1标准Taq PCR扩增体系进行相同PCR，扩增ΒηΤΤ16、 BrTT16、BoTT16基因家族各成员的基因组DNA，再如前法所述进行电泳检测(图4)、胶回收、 PMD19-T载体克隆、转化大肠杆菌感受态细胞、阳性克隆子筛选、菌液PCR鉴定和特异引物 鉴定(用上述特异引物组合进行梯度PCR)，最后测序。表2检测BrTT16、BoTT16、BnTT16基因家族成员的特异引物
权利要求
甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族，其特征在于所述白菜TT16基因家族包括以下3个成员BrTT16 1基因、BrTT16 2基因和BrTT16 3基因；所述BrTT16 1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.2所示，BrTT16 2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.4所示，BrTT16 3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.6所示；所述甘蓝TT16基因家族包括以下3个成员BoTT16 1基因、BoTT16 2基因和BoTT16 3基因；所述BoTT16 1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.8所示，BoTT16 2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.10所示，BoTT16 3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.12所示；所述甘蓝型油菜TT16基因家族包括以下6个成员BnTT16 1基因、BnTT16 2基因、BnTT16 3基因、BnTT16 4基因、BnTT16 5基因和BnTT16 6基因；所述BnTT16 1基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.14所示，BnTT16 2基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.16所示，BnTT16 3基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.18所示，BnTT16 4基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.20所示，BnTT16 5基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.22所示，BnTT16 6基因的全长cDNA序列如SEQ ID No.24所示。
2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族，其特征 在于所述BrTT16-l基因的基因组序列如SEQ ID No. 1所示，BrTT16_2基因的基因组序列 如SEQ ID No. 3所示，BrTT16-3基因的基因组序列如SEQ ID No. 5所示；所述BoTT16-l基因的基因组序列如SEQ ID No. 7所示，BoTT16_2基因的基因组序列 如SEQ ID No. 9所示，BoTT16-3基因的基因组序列如SEQ ID No. 11所示；所述BnTT16-l基因的基因组序列如SEQ ID No. 13所示，ΒηΤΤ16_2基因的基因组序列 如SEQ ID No. 15所示，ΒηΤΤ16_3基因的基因组序列如SEQ ID No. 17所示，ΒηΤΤ16_4基因 的基因组序列如SEQ ID No. 19所示，ΒηΤΤ16_5基因的基因组序列如SEQ ID No. 21所示， ΒηΤΤ16-6基因的基因组序列如SEQ ID No. 23所示。
3.含有权利要求1或2所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝ΤΤ16基因家族中任 一种或多种基因或基因截短片段的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为含有甘蓝 型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝ΤΤ16基因家族特异保守片段ΒΤΤ16Ι的RNA干扰载体，所 述ΒΤΤ16Ι片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 14中第353 966位碱基所示。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述RNA干扰载体是将ΒΤΤ16Ι 片段分别以反义和正义方式同时插入改进型植物RNA干扰基础载体PTOC5941M的CaMV35S 启动子和OCS终止子之间形成反向重复序列而得到。
6.含有权利要求3或4或5所述重组表达载体的转化体。
7.权利要求1或2所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族在芸薹属 作物种子性状的分子育种中的应用。
8.根据权利要求7所述甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族的应用，其 特征在于所述芸薹属作物种子性状的分子育种为甘蓝型油菜黄籽性状的分子育种。
全文摘要
本发明公开了甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝TT16基因家族及其应用，其中白菜TT16基因家族包括BrTT16-1基因、BrTT16-2基因和BrTT16-2基因，甘蓝TT16基因家族包括BoTT16-1基因、BoTT16-2基因和BoTT16-3基因，甘蓝型油菜TT16基因家族包括BnTT16-1基因、BnTT16-2基因、BnTT16-3基因、BnTT16-4基因、BnTT16-5基因和BnTT16-6基因；上述基因家族可应用于芸薹属作物种子性状的分子育种。
文档编号C12N5/10GK101942455SQ20101028190
公开日2011年1月12日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者吕俊, 周清元, 李加纳, 柴友荣, 谌利, 闫楠, 雷波, 马丽娟, 马赑 申请人:西南大学