专利名称：一种提取rna的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体的说是涉及一种提取RNA的方法和试剂盒。
背景技术：
从组织中提取RNA是进行分子生物学方面研究的必要前提，提取纯度高、完整性 好的RNA对于Northern杂交分析、mRNA分离、体外翻译、cDNA文库的构建、RT-PCR分离基 因、差异显示分析等研究都具有重要的意义。许多材料由于富含酚类化合物和多糖以及含 有某些尚无法确定的次生代谢产物，使得这些材料RNA的有效分离纯化极其困难，因而阻 碍了其分子生物学方面研究的进展。常用的RNA的提取方法有TRIZOL法、异硫氰酸胍法、CTAB-LiCl法及国内外各生 物公司的总RNA提取试剂盒等。RNA提取的经典方法TRIZOL法，是一种基于异硫氰酸胍/ 苯酚/氯仿抽提原理的方法，该法适用范围广，动植物都适用，提取的RNA基本无基因组DNA 的污染，但是该法操作步骤繁琐，提取试剂中使用了苯酚、氯仿等有毒试剂，而且该法不适 用于富含多糖多酚材料RNA的提取。国外知名生物公司Qiagen的RNeasy Plant Mini Kit 是一种专门针对植物材料进行RNA提取的试剂盒，该试剂盒采用的方法是基于异硫氰酸胍 裂解的原理，该试剂盒对大部分植物材料都适用，具有提取速度快，纯度高，不使用有毒试 剂等优点，但是针对动物材料、微生物材料RNA提取效果不理想，尤其是富含多糖的材料， 由于多糖和RNA不容易分离很容易把吸附柱堵塞，从而造成RNA提取的失败。CTAB-LiCl法 常被用来提取富含多糖多酚材料RNA的提取，但是由于CTAB本身是一个与SDS功能相类似 的试剂，尽管它可和RNA以及DNA形成不溶的复合物，有利于去除多糖，但CTAB法通常要结 合其它操作，如再经LiCl沉淀等步骤，使得该法操作繁琐，并且在抽提时使用有毒试剂氯 仿。
发明内容
本发明目的是提供一种简单快捷、不使用有毒试剂，能从动物、植物和微生物等多 种材料中提取高质量的RNA的方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案一种提取RNA的方法，包括步骤1 样品与裂解液混勻，离心，所述裂解液含有浓度为10 50mmol/L，pH值 6. 5 8. 0的Tris-HCl、3 5mol/L异硫氰酸胍和1 % β -巯基乙醇；步骤2 取步骤1所得上清，与1/2体积RNase-free的无水乙醇混勻，与0. 45 μ m
玻璃纤维素膜结合；步骤3 用去蛋白液和漂洗液洗涤所述玻璃纤维素膜，所述去蛋白液含有浓度为 5 50mmol/L，pH值 6. 5 8. 0 的 Tris_HCl、0. 1 0. 5mol/L异硫氰酸胍和 5% 20% 的无 水乙醇,所述漂洗液含有浓度为5 5(kimol/L，pH值6. 5 8. 0的Tris-HCl、50 200mmol/ LNaCl和50% 80%的无水乙醇；
步骤4 洗脱所述玻璃纤维素膜上吸附的RNA。本发明所述提取RNA的方法，步骤1裂解液与样品混勻，为RNA的提取提供了最 优的缓冲条件，所述裂解液含有浓度为10 50mmol/L，pH值6. 5 8. 0的Tris_HCl、3 5mol/L异硫氰酸胍和1 % β -巯基乙醇，不含有毒试剂苯酚，既能强烈抑制RNase的活性， 又能高效裂解细胞释放RNA。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解 蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。其中，作为优选，所述裂解液含有浓度为25mmol/L，pH值7. 5的Tris-HCl、4mol/L 异硫氰酸胍和1% β _巯基乙醇。本发明所述提取RNA的方法，步骤1所得上清与1/2体积RNase-free的无水乙醇 混勻后与0. 45 μ m玻璃纤维素膜结合，乙醇能使RNA被选择性的结合在所述玻璃纤维素膜 上，而蛋白、基因组DNA以及其他多糖多酚等代谢产物不结合在所述玻璃纤维素膜上。蛋白质是污染RNA样品的一个重要因素，要获得完整的、高质量的RNA就必须有效 地去除蛋白杂质。常规方法大都采用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。本发明所述提取RNA的 方法，步骤3利用去蛋白液和漂洗液去除结合在所述玻璃纤维素膜上的蛋白和其他杂质， 所述去蛋白液含有浓度为5 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0的Tris_HCl，0. 1 0. 5mol/L异 硫氰酸胍和5% 20%的无水乙醇，所述漂洗液含有浓度为5 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0 的Tris-HCl，50 200mmol/LNaCl和50% 80%的无水乙醇。其中，去蛋白液能去除所述 玻璃纤维素膜上吸附或未吸附的蛋白或其他杂质，漂洗液可以去除所述玻璃纤维素膜上吸 附的蛋白和其他代谢产物如多糖、纤维素、脂类等杂质。其中，作为优选，所述去蛋白液含有浓度为10mmol/L、pH值7. 5的Tris-HCl， 0. 3mol/L异硫氰酸胍和10%的无水乙醇。作为优选，所述漂洗液含有浓度为lOmmol/L、pH值7. 5的Tris-HCl，IOOmmol/ LNaCl和80%的无水乙醇。本发明所述提取RNA的方法，步骤4洗脱所述玻璃纤维素膜上的RNA，可以用 RNase-free的低盐高pH值的溶液洗脱RNA。其中，作为优选，用pH值为7. 0 8. 5的灭菌的0. 的DEPC处理水或无核酸酶 的无菌蒸馏水洗脱RNA。更优选地，用pH值为8. 0的灭菌的0. 1 %的DEPC处理水或无核酸酶的无菌蒸馏水 洗脱RNA。本发明还提供一种不含有苯酚、氯仿等有毒试剂，能从动物、植物和微生物等多种 材料中提取高质量的RNA的试剂盒。一种提取RNA的试剂盒，包括裂解液、去蛋白液、漂洗液，其中，所述裂解液含有浓 度为10 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0的Tris_HCl，3 5mol/L异硫氰酸胍和β -巯基 乙醇，所述去蛋白液含有浓度为5 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0的Tris_HCl，0. 1 0. 5mol/ L异硫氰酸胍和5 % 20 %的无水乙醇，所述漂洗液含有浓度为5 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0 的 Tris-HCl，50 200mmol/LNaCl 和 50% 80%的无水乙醇。本发明所述提取RNA的试剂盒，所述裂解液为RNA的提取提供了最优的缓冲条件， 既能强烈抑制RNase的活性，又能高效裂解细胞释放RNA。其中，作为优选，所述裂解液含有 浓度为25mmol/L、pH值7. 5的Tris-HCl，4mol/L异硫氰酸胍和1% β-巯基乙醇。
本发明所述提取RNA的试剂盒，所述去蛋白液能去除所述玻璃纤维素膜上吸附或 未吸附的蛋白或其他杂质。其中，作为优选，所述去蛋白液含有浓度为10mmol/L、pH值7. 5 的Tris-HCl，0. 3mol/L异硫氰酸胍和10%的无水乙醇。本发明所述提取RNA的试剂盒，所述漂洗液可以去除所述玻璃纤维素膜上吸附的 蛋白和其他代谢产物如多糖、纤维素、脂类等杂质。其中，作为优选，所述漂洗液含有浓度为 10mmol/L、pH 值 7. 5 的 Tris-HCl, lOOmmol/LNaCl 和 80%的无水乙醇。本发明所述提取RNA的试剂盒，还包括0. 45 μ m玻璃纤维素膜，所述0. 45 μ m玻璃 纤维素膜在乙醇作用下可以选择性吸附RNA。所述0.45 μ m玻璃纤维素膜可以固定于离心 柱中，组成0. 45 μ m玻璃纤维素膜吸附柱。本发明所述提取RNA的试剂盒，还包括洗脱液，所述洗脱液为RNase-free的低盐 高PH值的溶液，能够把吸附在所述玻璃纤维素膜上的RNA洗脱下来。其中，作为优选，所述洗脱液为pH值为7. 0 8. 5的灭菌的0. 1 %的DEPC处理水 或无核酸酶的无菌蒸馏水。更优选地，所述洗脱液为pH值为8. 0的灭菌的0. 1 %的DEPC处理水或无核酸酶的 无菌蒸馏水洗脱RNA。许多材料富含酚类化合物、多糖以及某些尚无法确定的次生代谢产物，在完整的 细胞内这些物质在空间上与核酸是分离的，但在提取RNA过程中，当组织被研磨、细胞破碎 后，这些物质就会与RNA相互作用。酚类化合物被氧化后会与RNA不可逆地结合，导致RNA 活性丧失；在用苯酚、氯仿抽提时RNA易丢失，或形成不溶性复合物；而多糖会形成难溶的 胶状物，与RNA共沉淀下来；萜类化合物和RNase会分别造成RNA的化学降解和酶解。由于 多糖多酚类物质与RNA相互作用，使得RNA的分离纯化极其困难，阻碍了其分子生物学方面 研究的进展。因此本发明另一个目的是提供一种适用于富含多糖多酚和次生代谢产物材料的 提取RNA的方法。 一种提取RNA的方法，包括步骤1 样品与裂解液混勻，离心，上清中加入助提剂混勻，离心，所述裂解液含有 浓度为10 50mmol/L, pH值6. 5 8. 0的Tris-HCl、3 5mol/L异硫氰酸胍和1% β -巯 基乙醇，所述助提剂含有浓度为5 20%的聚乙烯吡咯烷酮和0. 5 2%的Tween20 ；步骤2 取步骤1所得上清，与1/2体积RNase-free的无水乙醇混勻，与0. 45 μ m
玻璃纤维素膜结合；步骤3 用去蛋白液和漂洗液洗涤所述玻璃纤维素膜，所述去蛋白液含有浓度为 5 50mmol/L，pH值 6. 5 8. 0 的 Tris_HCl、0. 1 0. 5mol/L异硫氰酸胍和 5% 20% 的无 水乙醇,所述漂洗液含有浓度为5 50mmol/L，pH值6. 5 8. 0的Tris-HCl、50 200mmol/ LNaCl和50% 80%的无水乙醇；步骤4 洗脱所述玻璃纤维素膜上吸附的RNA。本发明在所述样品与裂解液混勻离心所得上清中加入助提剂混勻，所述助提剂含 有浓度为5 20%的聚乙烯吡咯烷酮和0. 5 2%的Tween20，能和核酸中的多糖多酚特异 性结合，离心后能最大限度的去除多糖多酚类物质，从而有效地从富含多糖多酚和次生代 谢产物的材料中分离到高质量的RNA。其中，作为优选，所述助提剂含有浓度为20%的聚乙烯吡咯烷酮和的Tween20。本发明通过分别采用经典TRIZOL法、异硫氰酸胍/ β -巯基乙醇裂解法和本发明 所述提取RNA的方法提取禾本科绿草、芦荟、牡丹、红宝石花、松针、冬青材料中的RNA，发现 本发明所述提取RNA的方法针对富含多糖多酚的植物材料提取RNA的效果明显优于经典 TRIZOL法和异硫氰酸胍/ β -巯基乙醇裂解法。本发明还提供一种适用于富含多糖多酚和次生代谢产物的材料提取RNA的试剂
品.ο一种提取RNA的试剂盒，包括裂解液、助提剂、去蛋白液、漂洗液，其中，所述裂解 液含有浓度为10 5(kimol/L、pH值6. 5 8. 0的Tris-HCl，3 5mol/L异硫氰酸胍和1% β -巯基乙醇，所述助提剂含有浓度为5 20%的聚乙烯吡咯烷酮和0. 5 2%的Tween20， 所述去蛋白液含有浓度为5 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0的Tris_HCl，0. 1 0. 5mol/L异 硫氰酸胍和5% 20%的无水乙醇，所述漂洗液含有浓度为5 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0 的 Tris-HCl，50 200mmol/LNaCl 和 50% 80%的无水乙醇。本发明所述提取RNA的试剂盒，所述助提剂含有浓度为5 20%的聚乙烯吡咯烷 酮和0. 5 2%的Tween20，能够与核酸中的多糖多酚特异性结合，离心后能最大限度的去 除多糖多酚类物质，从而有效地从富含多糖多酚和次生代谢产物的材料中分离得到高质量 的RNA。其中，作为优选，所述助提剂含有浓度为20%的聚乙烯吡咯烷酮和的Tween20。本发明所述提取RNA的方法简单快捷，不使用有毒试剂、适用范围广，除了应用于 植物材料RNA提取外，同样适用于动物组织、丝状真菌、细菌RNA的提取。本发明所述提取 RNA的方法，在裂解细胞中加入助提剂能有效地从富含多糖多酚和次生代谢产物的材料中 分离得到高质量的RNA。本发明所述提取RNA的试剂盒不含有毒试剂、适用范围广，针对富 含多糖多酚的植物材料提取RNA时效果优于国外RNA提取试剂盒，而且成本低，适用于广大 的实验室和科研工作。
图1示按照本发明实施例4所述提取RNA的方法，从植物、细菌、酵母、动物材料中 提取的RNA的琼脂糖凝胶电泳图；泳道1-5的被检测物质分别为从仙人掌、JM109大肠 杆菌、酵母AH109菌株、小鼠肝脏组织、小鼠肾脏组织中提取的RNA。图2示按照经典TRIZOL法、异硫氰酸胍/ β β -巯基乙醇裂解法(Qiagen方法) 和本发明实施例7所述提取RNA的方法，从禾本科绿草、芦荟、牡丹、红宝石花、松针、冬青材 料中提取的RNA的琼脂糖凝胶电泳图；泳道1、4、7、10、13、16的被检测物质分别为按照TRIZOL法从绿草、芦荟、牡丹、红 宝石花、松针、冬青植物材料中提取的RNA ；泳道2、5、8、11、14、17的被检测物质分别为按照异硫氰酸胍/ β -巯基乙醇裂解法 (Qiagen方法)从绿草、芦荟、牡丹、红宝石花、松针、冬青植物材料中提取的RNA ；泳道3、6、9、12、15、18的被检测物质分别为按照本发明实施例7所述提取RNA的 方法从绿草、芦荟、牡丹、红宝石花、松针、冬青植物材料中提取的RNA。图3示按照本发明实施例7所述提取RNA的方法，从丝状真菌中提取的RNA的1 % 琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种提取RNA的方法和试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本 文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术 人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法和产品已经通过较佳 实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方 法和产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案本发明所述简单快捷、不使用有毒试剂，能从动物、植物和微生物等多种材料中提 取高质量的RNA的方法，包括步骤1 样品与裂解液混勻、离心，以去除未裂解的细胞残渣。所述裂解液含有浓 度为10 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0的Tris-HCl，3 5mol/L异硫氰酸胍和1 % β -巯 基乙醇；步骤2 吸取步骤1离心后所得上清，与1/2体积RNase-free的无水乙醇混勻，加 入到0. 45 μ m玻璃纤维素膜吸附柱中，离心，弃流出液；步骤3 吸附柱中加入去蛋白液，离心弃流出液，然后吸附柱中加入漂洗液，离心 弃流出液，然后再离心以去除残留的乙醇，所述去蛋白液含有浓度为5 50mmol/L、pH值 6. 5 8. 0的Tris-HCl，0. 1 0. 5mol/L异硫氰酸胍和5 % 20 %的无水乙醇，所述漂洗液 含有浓度为 5 50mmol/L、pH 值 6. 5 8. 0 的 Tris-HCl，50 200mmol/LNaCl 和 50% 80%的无水乙醇；步骤4:在吸附柱中加入洗脱液，室温放置，离心，收集流出液即为所提植物RNA， 所述洗脱液为RNase-free的低盐高pH值的溶液。本发明所述不含有苯酚、氯仿等有毒试剂，能从动物、植物和微生物等多种材料中 提取高质量的RNA的试剂盒，包括裂解液、去蛋白液、漂洗液，其中，所述裂解液含有浓度为 10 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0的Tris_HCl，3 5mol/L异硫氰酸胍和β-巯基乙 醇，所述去蛋白液含有浓度为5 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0的Tris_HCl，0. 1 0. 5mol/ L异硫氰酸胍和5% 20%的无水乙醇，所述漂洗液含有浓度为5 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0 的 Tris-HCl，50 200mmol/LNaCl 和 50% 80%的无水乙醇。其中，作为优选，所述试剂盒还包括0. 45 μ m玻璃纤维素膜和洗脱液，所述洗脱液 为RNase-free的低盐高pH值的溶液。本发明所述适用于富含多糖多酚和次生代谢产物材料的提取RNA的方法，包括步骤1 样品与裂解液混勻，离心，上清中加入助提剂混勻，离心，所述裂解液含有 浓度为10 5(kimol/L，pH值6. 5 8. 0的Tris_HCl、3 5mol/L异硫氰酸胍和β -巯 基乙醇，所述助提剂含有浓度为5 20%的聚乙烯吡咯烷酮和0. 5 2%的Tween20 ；步骤2 吸取步骤1离心后所得上清，与1/2体积RNase-free的无水乙醇混勻，加 入到0. 45 μ m玻璃纤维素膜吸附柱中，离心，弃流出液；步骤3 吸附柱中加入去蛋白液，离心弃流出液，然后吸附柱中加入漂洗液，离心 弃流出液，然后再离心以去除残留的乙醇，所述去蛋白液含有浓度为5 50mmol/L、pH值 6. 5 8. 0的Tris-HCl，0. 1 0. 5mol/L异硫氰酸胍和5 % 20 %的无水乙醇，所述漂洗液含有浓度为 5 50mmol/L、pH 值 6. 5 8. 0 的 Tris-HCl，50 200mmol/LNaCl 和 50% 80%的无水乙醇；步骤4:在吸附柱中加入洗脱液，室温放置，离心，收集流出液即为所提植物RNA， 所述洗脱液为RNase-free的低盐高pH值的溶液。本发明所述适用于富含多糖多酚和次生代谢产物的材料提取RNA的试剂盒，包 括裂解液、助提剂、去蛋白液、漂洗液，其中，所述裂解液含有浓度为10 50mmol/L、pH值 6. 5 8.0的Tris-HCl，3 5mol/L异硫氰酸胍和β -巯基乙醇，所述助提剂含有浓 度为5 20%的聚乙烯吡咯烷酮和0. 5 2%的Tween20，所述去蛋白液含有浓度为5 50mmol/L、pH 值 6. 5 8. 0 的 Tris-HCl, 0. 1 0. 5mol/L 异硫氰酸胍和 5%~ 20% 的无水 乙醇，所述漂洗液含有浓度为5 50mmol/L、pH值6. 5 8. 0的Tris-HCl，50 200mmol/ LNaCl和50% 80%的无水乙醇。其中，作为优选，所述试剂盒还包括0. 45 μ m玻璃纤维素膜和洗脱液，所述洗脱液 为RNase-free的低盐高pH值的溶液。本发明所述提取RNA的方法简单快捷，不使用有毒试剂，适用范围广，除了应用于 植物材料RNA的提取外，同样适用于动物组织、丝状真菌、细菌RNA的提取。本发明所述提 取RNA的方法，在裂解细胞中加入助提剂能有效地从富含多糖多酚和次生代谢产物的材料 中分离得到高质量的RNA。本发明所述提取RNA的试剂盒不含有毒试剂、适用范围广，针对 富含多糖多酚的植物材料提取RNA时效果优于国外RNA提取试剂盒，而且成本低，适用于广 大的实验室和科研工作。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提取RNA的方法和试剂盒进行 详细说明。实施例1 本发明所述提取RNA的试剂盒本发明所述提取RNA的试剂盒包括裂解液、去蛋白液、漂洗液。裂解液含有3M的异硫氰酸胍、IOmM pH值为6. 5的Tris_HCl、l %的β -巯基乙醇。 具体配制方法为称取异硫氰酸胍35. 45g，加入足够的RNase-free蒸馏水进行充分溶解， 然后加入pH为6. 5、浓度为IM的Tris-HCl 1. 0ml，充分混勻，定容到99ml，加入Iml β -巯 基乙醇。去蛋白液含有0. IM的异硫氰酸胍、5mM pH值为7. 5的Tris_HCl、5%的无水乙醇。 称取1. 18g异硫氰酸胍，加入RNase-free的蒸馏水充分溶解，然后加入pH为6. 5、浓度为 IM的Tris-HCl 0. 5ml，最后加入IOml RNase-free的无水乙醇，定容到100ml，充分混勻。漂洗液含有5mM的pH值为6. 5的Tris_HCl、50mM的NaCl、50%的无水乙醇。量取 PH值为6. 5，浓度为IM的Tris-HCl 0. 5ml，再量取5M的NaCllml，加入适量的RNase-free 的蒸馏水混勻，再加入50ml的RNase-free的无水乙醇，定容到100ml，充分混勻。实施例2 本发明所述提取RNA的试剂盒本发明所述提取RNA的试剂盒包括裂解液、去蛋白液、漂洗液，洗脱液和玻璃纤维 素膜。其中，裂解液含有5M的异硫氰酸胍、50mM pH值为8. 0的Tris_HCl、1 %的β -巯基 乙醇；去蛋白液含有0. 5Μ的异硫氰酸胍、50mM pH值为8. 0的Tris_HCl、20%的无水乙醇； 漂洗液含有20mM的pH值为8. 0的Tris-HCl、200mM的NaCl、80%的无水乙醇；洗脱液为pH 值8. 0灭菌的0. 1 %的DEPC处理水；玻璃纤维素膜为0. 45 μ m, Whatman公司，GF/B型。配置方法同实施例1。实施例3 本发明所述提取RNA的试剂盒本发明所述提取RNA的试剂盒包括裂解液、去蛋白液、漂洗液，洗脱液和玻璃纤维 素膜吸附柱。其中，裂解液含有4M的异硫氰酸胍、25mM pH值为7. 5的Tris_HCl、1 %的 β-巯基乙醇；去蛋白液含有0. 3Μ的异硫氰酸胍、IOmMpH值为7. 5的Tris-HCl、10%的无 水乙醇；漂洗液含有IOmM的ρΗ值为7. 5的Tris-HClUOOmM的NaCl、80%的无水乙醇；洗 脱液为PH值7. 5无核酸酶的无菌蒸馏水；玻璃纤维素膜吸附柱为0. 45 μ m玻璃纤维素膜， Whatman公司，GF/B型，1. 5mL离心柱。配置方法同实施例1。实施例4 本发明所述提取RNA的方法用实施例3所述试剂盒提取RNA。样品加入裂解液，充分混勻，室温放置5min使 其充分裂解，然后12，OOOrpm离心IOmin以去除未裂解的细胞残渣。吸取离心后的上清， 加入上清1/2体积RNase-free的无水乙醇，充分混勻。加入到玻璃纤维素膜吸附柱中， 12，OOOrpm离心30s，弃流出液。吸附柱中加入去蛋白液，12，OOOrpm离心30s，弃流出液。 然后吸附柱中加入漂洗液，12，OOOrpm离心30s，弃流出液。再加入漂洗液洗涤一次，弃流出 液，然后再12，OOOrpm离心2min以去除残留的乙醇。转移吸附柱到一个干净的RNase-free 的离心管中，在吸附柱中加入洗脱液，室温放置lmin，12，OOOrpm离心lmin，收集流出液。收 集的流出液再加入到吸附柱中重复洗脱一次，收集流出液，流出液即为所提植物RNA。实施例5 本发明所述提取RNA的试剂盒本发明所述提取RNA的试剂盒包括裂解液、助提剂、去蛋白液、漂洗液，洗脱液和 玻璃纤维素膜吸附柱。其中，裂解液含有4M的异硫氰酸胍、25mMpH值为7. 5的Tris-HCl、
的β-巯基乙醇；助提剂含有20%的聚乙烯吡咯烷酮和的Tween20 ；去蛋白液含有 0. 3M的异硫氰酸胍、IOmM ρΗ值为7. 5的Tris-HCl、10%的无水乙醇；漂洗液含有IOmM的 PH值为7. 5的Tris-HClUOOmM的NaCl、80%的无水乙醇；洗脱液为ρΗ值7. 5无核酸酶的 无菌蒸馏水；玻璃纤维素膜吸附柱为0. 45 μ m玻璃纤维素膜，Whatman公司，GF/B型，1. 5mL 离心柱。助提剂具体配制方法为称取2克聚乙烯吡咯烷酮(PVPlO)，加蒸馏水进行充分溶 解，然后用尖端剪除0. 5cm的吸头吸取100 μ 1的Tween20，充分搅拌混勻，定容到10ml。其 他试剂配置方法同实施例1。实施例6 本发明所述提取RNA的试剂盒本发明所述提取RNA的试剂盒包括裂解液、助提剂、去蛋白液、漂洗液，洗脱液和 玻璃纤维素膜。其中，裂解液含有3M的异硫氰酸胍、25mM ρΗ值为8. 0的Tris_HCl、1 %的 β-巯基乙醇；助提剂含有10%的聚乙烯吡咯烷酮和2%的Tween20 ；去蛋白液含有0. 3M的 异硫氰酸胍、IOmM ρΗ值为8. 0的Tris_HCl、10%的无水乙醇；漂洗液含有IOmM的ρΗ值为 8. 0的Tris-HCl、IOOmM的NaCl、50 %的无水乙醇；洗脱液为ρΗ值8. 0灭菌的0. 1 %的DEPC 处理水；玻璃纤维素膜为0. 45 μ m玻璃纤维素膜，Whatman公司，GF/B型。配置方法同实施 例4。 实施例7 本发明所述提取RNA的方法 用实施例5所述试剂盒提取RNA。样品加入裂解液和助提剂，充分混勻，室温放置 5min使其充分裂解，然后12，OOOrpm离心IOmin以去除未裂解的细胞残渣。吸取离心后的 上清，加入上清1/2体积RNase-free的无水乙醇，充分混勻。加入到玻璃纤维素膜吸附柱中，12，OOOrpm离心30s，弃流出液。吸附柱中加入去蛋白液，12，OOOrpm离心30s，弃流出液。 然后吸附柱中加入漂洗液，12，OOOrpm离心30s，弃流出液。再加入漂洗液洗涤一次，弃流出 液，然后再12，OOOrpm离心2min以去除残留的乙醇。转移吸附柱到一个干净的RNase-free 的离心管中，在吸附柱中加入洗脱液，室温放置lmin，12，OOOrpm离心lmin，收集流出液。收 集的流出液再加入到吸附柱中重复洗脱一次，收集流出液，流出液即为所提植物RNA。实施例8 本发明所述提取RNA的方法提取仙人掌RNA参照实施例4所述方法，用实施例3所述试剂盒提取仙人掌RNA。称取0. Ig仙 人掌，迅速剪成小块分别放入研钵中，加入Iml裂解液，室温下迅速研磨成勻浆，室温放置 5min后，室温离心IOmin后取上清，在上清液中加入1/2体积的RNase-free的无水乙醇，充 分混勻；把混合液加入到玻璃纤维素膜吸附柱中，12，OOOrpm离心30s，弃流出液；在吸附柱 中加入500 μ 1去蛋白液，室温放置2min，12，OOOrpm离心30s，弃流出液；在吸附柱中加入 500 μ 1漂洗液，12，OOOrpm离心30s,弃流出液，重复漂洗一次，再12，OOOrpm离心2min ；转 移吸附柱到一个干净的RNase-free的离心管中，在吸附柱的中间部位加入100 μ 1洗脱液， 室温放置lmin，12，OOOrpm离心lmin，收集的流出液再加入到吸附柱中重复洗脱一次，收集 流出液，流出液即为所提仙人掌的总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。实施例9 本发明所述提取RNA的方法提取细菌RNA参照实施例4所述方法，用实施例3所述试剂盒提取细菌RNA。离心收集l_2ml 大肠杆菌菌液(IO8 IO9细胞)到一个1.5ml离心管，尽可能去除上清，在细胞沉淀中加 入100 μ 1含有lmg/ml溶菌酶的TE，37 °C温育15min，期间每隔5min涡旋振荡一次；加 入350 μ 1裂解液，充分涡旋混勻，12，OOOrpm离心3min，转移上清到一个新离心管，再加 入上清1/2体积RNase-free的无水乙醇，充分混勻；把混合液加入到玻璃纤维素膜吸附 柱中，12，OOOrpm离心30s，弃流出液；在吸附柱中加入500 μ 1去蛋白液，室温放置2min， 12，OOOrpm离心30s,弃流出液；在吸附柱中加入500 μ 1漂洗液，12，OOOrpm离心30s,弃流 出液，重复漂洗一次，再12，OOOrpm离心2min ；转移吸附柱到一个干净的RNase-free的离 心管中，在吸附柱的中间部位加入100 μ 1洗脱液，室温放置lmin，12，OOOrpm离心lmin，收 集的流出液再加入到吸附柱中重复洗脱一次，收集流出液，流出液即为所提细菌的总RNA。
琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。实施例10 本发明所述提取RNA的方法提取酵母RNA参照实施例4所述方法，用实施例3所述试剂盒提取酵母RNA。收集Iml (约IO7 细胞)处于对数生长期的酵母培养物到1.5ml离心管中，9，OOOrpm离心30s，尽可能去除 上清，加入100 μ 1缓冲液SE (1Μ山梨醇，0. IM Na2EDTA, 14mM β -巯基乙醇)，轻柔吹打充 分重悬细胞；根据酵母量加入约50U lyticase，充分颠倒混勻，37°C温育10-30min消化细 胞壁，中间可颠倒数次帮助消化，然后加入350 μ 1裂解液剧烈涡旋吹打混勻，12，OOOrpm离 心3min，转移上清到一个新离心管，加入上清1/2体积RNase-free的无水乙醇，立即吹打 混勻；把混合液加入到玻璃纤维素膜吸附柱中，12，OOOrpm离心30s，弃流出液；在吸附柱 中加入500 μ 1去蛋白液，室温放置2min，12，OOOrpm离心30s，弃流出液；在吸附柱中加入 500 μ 1漂洗液，12，OOOrpm离心30s,弃流出液，重复漂洗一次，再12，OOOrpm离心2min ；转 移吸附柱到一个干净的RNase-free的离心管中，在吸附柱的中间部位加入100 μ 1洗脱液， 室温放置lmin，12，OOOrpm离心lmin，收集的流出液再加入到吸附柱中重复洗脱一次，收集流出液，流出液即为所提酵母的总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。实施例11 本发明所述提取RNA的方法提取小鼠肝脏和肾脏RNA参照实施例4所述方法，用实施例3所述试剂盒提取小鼠肝脏和肾脏RNA。称取小 鼠肾脏或肝脏组织0. lg，在液氮中迅速研磨成细粉，把研磨好的细粉转入到装有350μ 1裂 解液的1. 5ml离心管中，涡旋振荡成勻浆液，将勻浆液12，OOOrpm离心3min，转移上清到一 个新离心管，加入上清1/2体积RNase-free的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提 取过程，立即吹打混勻；把混合液加入到玻璃纤维素膜吸附柱中，12，OOOrpm离心30s，弃流 出液；在吸附柱中加入500 μ 1去蛋白液，室温放置2min，12，OOOrpm离心30s，弃流出液；在 吸附柱中加入500 μ 1漂洗液，12，OOOrpm离心30s，弃流出液，重复漂洗一次，再12，OOOrpm 离心2min ；转移吸附柱到一个干净的RNase-free的离心管中，在吸附柱的中间部位加入 100 μ 1洗脱液，室温放置lmin，12，OOOrpm离心lmin，收集的流出液再加入到吸附柱中重复 洗脱一次，收集流出液，流出液即为所提肾脏组织的总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测，结果 如图1所示。实施例12 本发明所述提取RNA的方法提取富含多糖多酚次生代谢产物的材料 RNA参照实施例7所述方法，用实施例5所述试剂盒提取富含多糖多酚次生代谢产物 的材料RNA。称取0. Ig新鲜的绿草、芦荟、牡丹、红宝石花、松针、冬青等植物各三份，迅速剪 成小块分别放入研钵中，第一份用实施例7所述方法提取RNA，加入Iml裂解液和100 μ 1助 提剂，室温下迅速研磨成勻浆，第二份加入Iml经典Trizol试剂直接研磨成勻浆，第三份加 入Iml异硫氰酸胍/ β -巯基乙醇裂解法的裂解液直接研磨成勻浆。室温放置5min后，经 典TRIZOL法和异硫氰酸胍/ β -巯基乙醇裂解法按照常规的操作步骤进行RNA的提取。第 三份用实施例7所述方法提取RNA，在上清液中加入1/2倍体积的RNase-free的无水乙醇， 充分混勻；把混合液加入到玻璃纤维素膜吸附柱中，12，OOOrpm离心30s，弃流出液；在吸附 柱中加入500 μ 1去蛋白液，室温放置2min，12，OOOrpm离心30s，弃流出液；在吸附柱中加 Λ 500 μ 1漂洗液，12，OOOrpm离心30s,弃流出液，重复漂洗一次，12，OOOrpm离心2min ；转 移吸附柱到一个干净的RNase-free的离心管中，在吸附柱的中间部位加入100 μ 1洗脱液， 室温放置lmin，12，OOOrpm离心lmin，收集的流出液再加入到吸附柱中重复洗脱一次，收集 流出液，流出液即为所提各种材料的总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。实施例13 本发明所述提取RNA的方法提取丝状真菌RNA参照实施例7所述方法，用实施例5所述试剂盒提取丝状真菌RNA。称取0. Ig丝状 真菌菌丝，在液氮中迅速研磨成细粉，把研磨好的细粉转入到装有500 μ 1裂解液的1. 5ml 离心管中，加入50 μ 1助提剂，涡旋振荡成勻浆液，将勻浆液12，OOOrpm离心3min，转移上 清到一个新离心管，加入上清0. 5倍体积的RNase-free的无水乙醇，立即吹打混勻；把混合 液加入到玻璃纤维素膜吸附柱中，12，OOOrpm离心30s，弃流出液；在吸附柱中加入500 μ 1 去蛋白液，室温放置2min，12，OOOrpm离心30s，弃流出液；在吸附柱中加入500 μ 1漂洗液， 12，OOOrpm离心30s，弃流出液，重复漂洗一次，再12，OOOrpm离心2min ；转移吸附柱到一个 干净的RNase-free的离心管中，在吸附柱的中间部位加入100 μ 1洗脱液，室温放置lmin， 12，OOOrpm离心lmin，收集的流出液再加入到吸附柱中重复洗脱一次，收集流出液，流出液 即为所提丝状真菌菌丝的总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行 若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
权利要求
一种提取RNA的方法，包括步骤1样品与裂解液混匀，离心，所述裂解液含有浓度为10～50mmol/L，pH值6.5～8.0的Tris HCl、3～5mol/L异硫氰酸胍和1％β 巯基乙醇；步骤2取步骤1所得上清，与1/2体积RNase free的无水乙醇混匀，与0.45μm玻璃纤维素膜结合；步骤3用去蛋白液和漂洗液洗涤所述玻璃纤维素膜，所述去蛋白液含有浓度为5～50mmol/L，pH值6.5～8.0的Tris HCl、0.1～0.5mol/L异硫氰酸胍和5％～20％的无水乙醇，所述漂洗液含有浓度为5～50mmol/L，pH值6.5～8.0的Tris HCl、50～200mmol/LNaCl和50％～80％的无水乙醇；步骤4洗脱所述玻璃纤维素膜上吸附的RNA。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述裂解液含有浓度为25mmol/L，pH值7.5 的Tris-HCl、4mol/L异硫氰酸胍和1 % β -巯基乙醇。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，步骤1还包括所得上清与助提剂混勻， 离心，所述助提剂含有浓度为5 20%的聚乙烯吡咯烷酮和0. 5 2%的Tween20。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述助提剂含有浓度为20%的聚乙烯吡 咯烷酮和的Tween20。
5.一种提取RNA的试剂盒，包括裂解液、去蛋白液、漂洗液，其中，所述裂解液含有浓度 为10 5(kimol/L，pH值6. 5 8. 0的Tris_HCl、3 5mol/L异硫氰酸胍和β-巯基乙 醇，所述去蛋白液含有浓度为5 50mmol/L，pH值6. 5 8. 0的Tris_HCl、0. 1 0. 5mol/ L异硫氰酸胍和5 % 20 %的无水乙醇，所述漂洗液含有浓度为5 50mmol/L，pH值6. 5 8. 0 的 Tris-HCl、50 200mmol/LNaCl 和 50% 80%的无水乙醇。
6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，还包括0.45 μ m玻璃纤维素膜。
7.根据权利要求5或6所述试剂盒，其特征在于，所述裂解液含有浓度为25mmol/L，pH 值7. 5的Tris-HCl、4mol/L异硫氰酸胍和1% β-巯基乙醇。
8.根据权利要求5-7任意一项所述试剂盒，其特征在于，还包括助提剂，所述助提剂含 有浓度为5 20%的聚乙烯吡咯烷酮和0. 5 2%的Tween20。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述助提剂含有浓度为20%的聚乙烯吡 咯烷酮和的Tween20。
10.根据权利要求5-9任意一项所述试剂盒，其特征在于，还包括洗脱液，所述洗脱液 为RNase-free的低盐高pH值的溶液。
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，公开了一种提取RNA的方法和试剂盒。提取RNA的方法为样品与裂解液混匀，离心收集上清与1/2体积无水乙醇混匀，结合于0.45μm玻璃纤维素膜后，用去蛋白液和漂洗液洗涤，最后洗脱吸附的RNA。上述方法，还包括裂解细胞与助提剂混匀，离心去除多糖多酚类物质。提取RNA的试剂盒包括裂解液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液，还包括助提剂。本发明所述方法简单快捷，不使用有毒试剂，适用范围广，加入助提剂有效去除多糖多酚类物质，分离高质量RNA。本发明所述试剂盒不含有毒试剂、适用范围广，针对富含多糖多酚的植物材料提取RNA效果优于国外试剂盒，而且成本低，适用于广大的实验室和科研工作。
文档编号C12N15/10GK101935648SQ20101028163
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者李艳萍 申请人:原平皓(天津)生物技术有限公司