一种rna保存液、包含该保存液的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种RNA保存液、包含该保存液的试剂盒及其应用，属于分子生物学领域，该保存液是浓度为3.8M-5.2M的甜菜碱水溶液，可以根据需要将该保存液制成商业化的试剂盒等；采用本发明的保存液，RNA样品以液态保存于低温条件下，可在-20℃条件下可完整保存至少一年，或在4℃可完整保存一周，可避免反复冰冻溶解对RNA样品造成的物理损害。并且在反转录、PCR等反应体系中不但不影响酶反应效率，还对反应效率和长链RNA的处理均有正面影响，还可用于溶解过度真空干燥保存的RNA。本保存液可以有效地解决RNA溶解、保存及使用时遇到的物理损伤、RNase降解、水解、容器吸附损失及细菌污染等影响，特别是对微量RNA的保存、重复使用及运输具有重大应用价值。
【专利说明】一种RNA保存液、包含该保存液的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种RNA保存液、包含该保存液的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]核糖核酸(RNA，Nuecleic Acid)为细胞的主要成分之一，参与细胞的各种功能活动，是生物学，医学，药学等生命有关学科研究的重要对象。
[0003]在绝大多数涉及RNA表达的研究或医疗应用的诊断预后测定中，均需用高度纯化的RNA作反应的底物。但是，纯化后的RNA极易被核糖核酸酶(即RNase)降解和受冷冻融化过程的影响而断裂。在生物样品中广泛存在并极度稳定的RNase对RNA的水解作用很强，许多RNase对RNA的降解作用不需任何辅助因子，给RNA的纯化、储存和使用带来极大困难。
[0004]实际应用中，用不含RNase的水或加入了 EDTA、柠檬酸钠等螯合剂的水溶解的RNA可在-80 0C的超低温冰箱中保存一年，冻存过程中样品在水溶剂从液态转变为固态，使用时尚需融化成液态，部分RNA在此过程中因相变形成的物理张力的剪切作用而断裂，反复冻融引起不可忽视的损害，如果是微量的RNA样品这种保存方法几乎无法胜任。
[0005]为了解决反复冻融对RNA造成损害的问题，现有技术采用将RNA溶解于甲酰胺的方法。甲酰胺作溶剂可保证纯化后的RNA在_20°C条件下保存一年以上并可反复冻融使用而无降解。溶解于甲酰胺的RNA发生构象变化，RNA分子受到压缩，体积比在水溶剂里小。但是，甲酰胺虽然可以抑制RNase反应，同时也会致使RNA变性，增大溶解难度，直接将甲酰胺溶解的RNA用于酶反应会对反应效率带来不确定的影响，使用前需重新沉淀以去除甲酰胺，极大的限制了其应用。`
[0006]另外，RNA经乙醇沉淀后存放于_20°C可以做到长期保存，但每次使用均需将RNA重新离心洗涤、溶解，给RNA验证引入额外的误差，影响测量的重复性，无助于RNA的反复使用。
[0007]当然，许多其他的化学变性剂被报道或者已经用于保存含有RNA的生物样品，如商业化了的RNAlater、TRIZol等，这些试剂含有酶反应抑制因子和蛋白质变性剂以保证RNA在纯化之前不被降解。这些抑制因子在随后的分离纯化过程中被除掉，不会存留于纯化后的RNA样本中。有时候这些试剂也笼统地被称为RNA保存液，其用途是保护生物样本中的RNA在纯化以前不受降解,而非纯化后RNA的保存。
[0008]综上所述，降解或部分降解的RNA会导致基因表达谱的改变，提取并保证高质量的RNA对准确测定目标基因有重大意义。一种能够有效阻止RNase降解、可避免RNA反复冻融造成的物理损伤并且不影响后续反应效率RNA保存液，对RNA的分子生物学研究和临床上的应用非常重要，也是目前RNA保存迫切需要解决的重要技术难题。
【发明内容】
[0009]本发明的发明目的之一，在于针对上述存在的问题，提供一种可避免RNA反复冻融造成的物理损伤并且不影响后续反应效率的RNA保存液。
[0010]本发明采用的技术方案是这样的:一种RNA保存液，该保存液是浓度为3.8M-5.2M的甜菜碱水溶液。
[0011]甜菜碱(Betaine,也称Trimethylglycine 或 Oxyneurine),是一种天然次生代谢产物，参与胆碱的氧化代谢和细胞渗透的平衡等多种生化生理功能活动。关于甜菜碱，已经有很多应用。本申请的发明人通过大量实验，得到上述的技术方案。甜菜碱属于惰性很高的化学物质，溶于高纯度的水可形成PH7.8左右的微碱溶液，甜菜碱溶液高度稳定，可在室温或4°C的条件下长期保存而无分解。将3.8M-5.2M的甜菜碱溶液保存于4°C的条件下3年之久后，仍可用于增强PCR扩增，不会引起DNA的降解。含有2.4 M的甜菜碱的PCR浓缩液，在-20°C条件下可稳定保存4年仍能用于扩增单位数的DNA分子。在实际应用中，3.8M-5.2M的甜菜碱溶液可保存在4°C潮湿的环境中，即使保存环境已出现细菌生长，也不影响其重复使用。由于甜菜碱的高渗透性，高浓度的甜菜碱溶液具有明显的抑制细菌生长的作用。而Tris或柠檬酸用作RNA溶解保存液，均 需小心避免细菌污染，否则，细菌可在这些溶液里生长并提供大量的RNase，不利于微量RNA的保存和反复使用。
[0012]在本申请中，我们把浓度大于3.8 M的甜菜碱溶液称为高浓度甜菜碱溶液。本领域公知的，本发明中的溶液浓度单位“M”为“mol/L”。
[0013]实验证明:用3.8M-5.2M的甜菜碱溶液保存的RNA可在_20°C条件下可完整保存至少一年，或在4°C储存可完整保存一周，因此可用冰袋保存，便于邮寄和运输。
[0014]SDS等表面活性剂，可助溶RNA和DNA，一般用于过度干燥的RNA或DNA的溶解。RNA溶解后，在用于酶反应以前，需经进一步纯化以去除SDS等对酶反应的负面影响。甜菜碱可降低GC碱基之间的氢键配对形成的结合力，5M的甜菜碱溶液可完全抵消GC与AT配对的差异，使得核糖核酸之间的联系更为松散，有利于加快核糖核酸的溶解速度和溶解度的提升。3.8M-5.2M的甜菜碱溶液是比水更好的DNA溶剂，可溶解DNA形成高达10 mg/ml的均匀溶液。而在水溶剂中，5mg/ml的DNA溶液已趋近溶解极限。高纯度甜菜碱对RNA和DNA无明显的降解作用，溶解于3.8M-5.2M的甜菜碱溶液的RNA，在-18°C至_26°C的低温保存条件下储藏至少12个月后，与用甲酰胺保存的相同样品比较浓度无改变，经琼脂糖电泳比较显示真核RNA特征性的28s和18s,无降解拖尾。
[0015]Ambion 公司的 The RNA Storage Solution (AM7OOO)含有 ImM 的朽1 樣酸钠，可用于RNA的溶解和保存，但并不能防止反复冰冻融解对RNA造成的损害，并且很难防止细菌在柠檬酸溶液中的生长繁殖。
[0016]在反转录、PCR和RNA链接等反应体系可直接加入达反应总体积40%的3.8M_5.2M甜菜碱溶液而不影响酶反应效率。并因高浓度甜菜碱溶液具有松弛高GC含量引起的RNA链间吸引，减少RNA高级结构的稳定性，对反应效率和长链RNA的处理均有正面影响。高浓度甜菜碱溶液对紫外光谱范围的光波的吸收值极小，不影响测量核酸含量时常用的0D260/0D280/0D230读数，可用实验室通用的紫外分光光度计进行RNA浓度定量。也不影响RiboGreen,Qubit RNA分析的荧光染料与RNA的结合，高浓度甜菜碱溶液中的RNA，其质量和浓度可直接利用于Qubit 2.0突光光度计、Agilent BioAnalyzer 2100分析鉴定。
[0017]作为优选方案:所述甜菜碱水溶液中还加入RNase抑制因子，所加入的RNase抑制因子与甜菜碱水溶液的比例，按体积比计，为1: (100-10000)。
[0018]加入适量的RNase抑制因子可中和微量RNase，进一步的保护RNA不受RNase的降解。
[0019]作为优选方案:所述甜菜碱水溶液中还加入螯合剂。所述螯合剂优选为柠檬酸钠或 EDTA。
[0020]螯合剂可螯合部分RNase作用所需要的高价阳离子，均可不同程度的增进前述的甜菜碱溶液对RNA的保护作用。
[0021]作为优选方案:所述甜菜碱水溶液中还加入缓冲剂。所述缓冲剂优选为三羟甲基氨基甲烷，即Tris。
[0022]本发明的目的之二在于提供一种包含上述RNA保存液的试剂盒。更易于商业化应用。
[0023]本发明的目的之三在于，提供一种上述保存液在用于保存含有RNA的样品中的应用。
[0024]作为上述应用的技术方案之一:将纯化后的RNA样品溶解于所述保存液,然后在4°C保存，可保存至少一周。
[0025]作为上述应用的另一个技术方案:将纯化后的RNA样品溶解于所述保存液，然后在-10°c至-28°C环境下以液态形式保存，可保存至少12个月。
[0026]作为优选的技术方案:在_20°C环境下保存。
[0027]作为上述保存液的另一方面的应用:将所述保存液作为RNA溶剂或稀释液。
[0028]发明人通过大量实验发现，相比水溶剂，RNA更易溶解于高浓度甜菜碱溶液，可以更方便快捷地得到均匀溶液，用其作为RNA稀释液可降低因稀释操作带来的误差。本发明的保存液也可溶解冰冻干燥的RNA样品，可在20分钟内溶解过度干燥的RNA样品，形成浓度至少高达9.6 mg/ml的均匀透明液体。
[0029]综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:采用本发明的保存液，RNA样品以液态保存于低温条件下，可在_20°C条件下可完整保存至少一年，或在4°C可完整保存一周。这样，无须解冻RNA样本即可反复使用，避免反复冰冻溶解对RNA样品造成的物理损害。并且在反转录、PCR等反应体系中高达反应总体积40%的甜菜碱溶液不但不影响酶反应效率，而且因高浓度甜菜碱溶液具有松弛高GC含量引起的RNA链间吸引，减少RNA高级结构的稳定性，从而对反应效率和长链RNA的处理均有正面影响。高浓度甜菜碱溶液在紫外光谱范围的光吸收值甚微，不影响核酸含量用常规的0D260/0D280/0D230读数，可用实验室通用的紫外分光光度计进行RNA浓度定量。也不影响RiboGreeruQubit RNA分析的荧光染料与RNA的结合，因此高浓度甜菜碱溶液中的RNA可直接用Qubit 2.0荧光光度计、Agilent 2100 BioAnalyzer 分析。
[0030]另外，相比水溶剂，RNA在本发明的甜菜碱溶液中具有很高的溶解度，即RNA更易溶解于甜菜碱溶液。溶解于本发明的保存液可形成高达9.6 mg/ml的均匀溶液，可以更方便快捷地得到均匀溶液。本发明的保存液还可以作为RNA稀释液，以降低因稀释操作带来的误差，这个特性使其可用于溶解过度真空干燥保存的RNA，从而避免使用SDS等表面活性剂溶液助溶。置于该溶液中核酸可在不用液氮或超低温冰箱的条件保存较长时间而不影响RNA的完整性，从而有效地解决RNA溶解、保存及使用时遇到的物理损伤、RNase降解、水解、容器吸附损失及细菌污染等影响，特别是对微量RNA的保存、重复使用及运输具有重大应用价值。
[0031]【专利附图】
【附图说明】
图1为纯化后的RNA在不同保存液中、在-20°c保存12个月后的结果图；
图2为纯化后的RNA在_20°C低温保存360天后，再用不同的保存液在4°C保存，24及48小时后的RNA状态图；
图3为重复冻融过程造成不同溶剂中RNA物理损伤的比较图；
图4为RNase抑制因子增强甜菜碱溶液对抗RNase A降解能力图；
图5为高浓度的甜菜碱帮助DNA溶解图；
图6为过度干燥的RNA在高浓度甜菜碱溶液中的溶解情况图；
图7为高浓度甜菜碱溶液作为稀释液的效果图；
图8为不同浓度的甜菜碱溶液保存RNA的效果图；
图9为甲酰胺和高浓度甜菜碱溶液对Qubit RNA荧光定量的影响图；
图10为不同体积的5 M甜菜碱溶液和甲酰胺对反转录反应效率的影响图；
图11为5 M甜菜碱溶液中加入不同浓度的Tris对反转录反应效率的影响图；
图12为5 M甜菜碱溶液中加入不同浓度的EDTA对反转录反应效率的影响图；` 图13为不同保存时间对高浓度甜菜碱溶液中溶解的RNA总量的影响图；
图14为不同保存时间对水中溶解的RNA总量的影响图；
图15为RNA降解实验第8天时，miR-92a和miR_92b分子拷贝数变化的比较图；
图16为冰袋保存的RNA经4天时间的转运后RNA样本的电泳图；
图17和图18为图16中样品的RIN值分析图。
[0032]
【具体实施方式】
[0033]下面对本发明作详细的说明。
[0034]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0035]实施例1:温度和浓度对甜菜碱溶液物理状态的影响
甜菜碱易溶于水，溶解饱和度可达5.5M以上。我们对浓度为2.4M - 5.2M的甜菜碱溶液在分子生物学实验室常用的_20°C冰箱中保存条件下的物理状态进行了连续4天的观测。在整个实验的实施过程中，每天对冰箱实际温度进行两次测定(相隔至少8小时)，实际测得的温度在_18°C至_26°C之间。冰箱的频繁使用是解释较大温度差异的一个主要原因。结果显示:3.SM以上浓度的甜菜碱溶液可以液态保持在-20°C的低温条件下，而浓度低于
3.6M的溶液在相同条件下成固态。加入IM的KCl可降低3.6M甜菜碱溶液的凝固点，使其在_20°C冰箱的保存条件下转为液态。不同浓度的甜菜碱溶液在4°C的保存条件下均呈液态。在长达数年的实际使用中，-20C冰箱中保存的3.8M以上浓度的甜菜碱溶液均以液态形式成在，无一例固化。4°C和_20°C低温保存条件是现代生物医学实验室的对生物样品最基本的保存手段之一，与RNA保存有密切关系。我们的测试结果证明高浓度甜菜碱溶液尤其是3.8M-5.2M的甜菜碱溶液具有成为核糖核酸保护剂的潜在能力。具体结果见表1。
[0036]表1:不同甜菜碱溶液浓度在_20°C冰箱中保存120天后的溶液物理状态
【权利要求】
1.一种RNA保存液，其特征在于:所述保存液是浓度为3.8M-5.2M的甜菜碱水溶液。
2.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于:所述甜菜碱水溶液中还加入RNase抑制因子，所加入的RNase抑制因子与甜菜碱水溶液的比例，按体积比计，为1:(100-10000)。
3.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于:所述甜菜碱水溶液中还加入螯合剂。
4.根据权利要求1所述的RNA保存液，其特征在于:所述甜菜碱水溶液中还加入缓冲剂。
5.包含权利要求1至4任意一项所述的RNA保存液的试剂盒。
6.权利要求1至4任意一项所述的RNA保存液在用于保存含有RNA的样品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:将纯化后的RNA样品溶解于所述保存液，然后在4 C保存。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:将纯化后的RNA样品溶解于所述保存液，然后在-10°C至_28°C环境下以液态形式保存。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:在_20°C环境下保存。
10.权利要求1 至4任意一项所述的RNA保存液的应用，其特征在于:将所述保存液作为RNA溶剂或稀释液。
【文档编号】C12N5/10GK103881978SQ201410077772
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月5日 优先权日:2014年3月5日
【发明者】徐凯, 唐放, 李四军, 张耀艺 申请人:成都诺恩生物科技有限公司