一种大豆MYB类转录因子GmMYB181的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程领域,涉及一种大豆MYB类转录因子GmMYB181的应用。本发明从大豆中克隆了1个在控制株型和生殖器官发育中发挥了重要的调控作用的基因GmMYB181，其序列为SEQ?ID?NO.1。该基因mRNA表达分析表明为花器官特异性表达基因，其表达模式与植株的生殖发育相关，进一步的过量表达GmMYB181的拟南芥的表型变化表明GmMYB181在控制株型和生殖器官发育方面发挥了重要的调控作用。本发明公开了该基因进行植物株型和生殖器官改造的基因工程改良方法。该方法对培育株型和生殖器官改变的植物品种特别是大豆品种具有一定的作用，可以通过定向地改造作物的株型和生殖器官形态，为农作物提高制种效率服务，以及提高农作物特别是大豆的产量服务。
【专利说明】—种大豆MYB类转录因子GmMYBI 81的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，涉及一种大豆MYB类转录因子GmMYBlSl的应用，具体涉及来源于大豆的在花器官中特异性表达并与花器官发育及生长发育相关的MYB类转录因子GmMYB181在植物株型和植物生殖器官改造中的应用。
【背景技术】
[0002]生殖生长是高等植物生活史中最重要的阶段，是植物繁殖后代和种群扩散的手段和基础，也是农业生产获得产品的关键时期。花器官是生殖过程中重要的功能器官，花的发育是植物生殖生长期开始的重要标志，它的发育状况直接影响到果实和种子的形成以及品质。花的发育，即成花过程，是一个复杂而有序的生理活动。植物进入生殖生长期后，营养分生组织形成花序分生组织，花序分生组织逐步形成花分生组织，然后产生花器官原基，花器官原基最终分化成各种花器官，形成一朵完整的花。这一过程受到外界环境诱导和基因网络的严格控制，伴随着一些特异基因的差异性表达。目前已发现许多基因家族与花发育调控密切相关。
[0003]MYB类转录因子广泛存在于植物中，几乎参与了植物发育和代谢的各个方面。基因表达调控方式有多种，主要通过多种转录因子的相互作用来实现对靶基因的精密调控，拟南芥中MYB转录因子被发现是其他调控子的直接靶标基因。MYB类转录因子与其它转录因子家族成员，通过组合调控的方式调节植物次生代谢、调节植物细胞的形成与模式建成，并对外界环境及激素等做出应答。2007年Yang等发现拟南芥中过表达AtMYB24基因会导致植株矮小且花器官发育不良，花药不开裂，花粉无活性。Byongchul等(2002)研究证明AtMYB21的异位表达会导致胚轴细胞伸长缓慢、幼苗致死、转基因植株叶和花瓣变小、心皮形态变异等一系列形态变异，说明MYB参与植物生长发育的调控。由于MYB类转录因子的数量众多，虽然总的来讲参与了植物发育和代谢的各个方面，但是不同的MYB类转录因子各自发挥的生物功能差异非常大，尚无法由已知的MYB类转录因子的生物功能推测新的MYB类转录因子的功能。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供公开一个大豆MYB类转录因子基因GmMYBlSl。
[0005]本发明的另一目的是提供该基因在生殖器官改造中的基因工程应用。
[0006]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0007]大豆基因GmMYB181，核苷酸序列为SEQ ID N0.1。
[0008]本发明所述的大豆MYB类转录因子基因GmMYB 181编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2。
[0009]含有本发明所述的大豆MYB类转录因子基因GmMYB181的表达载体。
[0010]本发明所述的大豆MYB类转录因子基因GmMYB181的基因工程应用。
·[0011]本发明所述的大豆MYB类转录因子基因GmMYBlSl优选在植物株型和/或生殖器官改造中的基因工程应用。
[0012]所述的植物生殖器官优选花器官和果荚形态。
[0013]使用GmMYB181构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、GFP基因等)或者抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物等)的抗性基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。
[0014]携带有本发明GmMYB181的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是烟草、拟南芥、大豆、油菜、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等双子叶植物。
[0015]有益效果:
[0016]本发明提供的大豆MYB类转录因子基因GmMYBlSl在花中特异性表达，该转录因子可能参与大豆花器官的发育调控。35S::GmMYBlSl转基因拟南芥在生长发育过程中出现了一系列的表型变化，与对照植株相比，35S::GmMYB181转基因拟南芥出现花萼卷曲、长角果较短小、植株矮化等性状。这些结果说明GmMYBlSl参与了植物花器官发育的调控，可能在植物的果实及株型的发 育过程中发挥重要作用。本发明公开了该基因进行植物生殖器官改造的基因工程改良方法。该方法对培育生殖器官改变的植物品种特别是大豆品种具有一定的作用，可以通过定向地改造作物的花器和果荚形态，为农作物提高制种效率服务，进而为提高农作物特别是大豆的产量服务。
[0017]利用植物过量表达载体pMDC83-GmMYB181，将本发明的GmMYB181导入植物体内，
可获得生殖器官变异的转基因细胞系及转基因植株。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
[0019]图1为GmMYB181在大豆中的表达特性图。
[0020]GmMYBlSl在大豆不同器官及不同时期果实中的表达分析，分别为:根、莖、叶、花、不同时期荚皮、不同时期种子。
[0021]图2为含有GmMYB181的植物过量表达载体的T-DNA结构示意图。
[0022]图3为转基因拟南芥的PCR鉴定。
[0023]M为DNA分子量DL5000 (Takara) ;1_9为不同的转基因株系；WT为野生型拟南芥(阴性对照)；P:pMDC83-GmMYB181质粒DNA (阳性对照)。
[0024]图4为转基因拟南芥的RT-PCR鉴定。
[0025]M为DNA分子量DL2000 (Takara); 1_9为不同的株系；WT为野生型拟南芥(阴性对照)；P:pMDC83-GmMYB181 质粒 DNA (阳性对照)。
[0026]图5为35S::GmMYB181转基因拟南芥出现花萼卷曲的变异。
[0027]图6为35S::GmMYB181转基因拟南芥和野生型拟南芥的长角果长度比较。
[0028]35S::GmMYB181转基因植株长角果长度要短于对照植株。
[0029]图7为35S::GmMYB181转基因拟南芥的株型变化，出现矮化和侧枝增多的现象。[0030]图8为35S::GmMYB181转基因拟南芥与野生型拟南芥单个长角果种子粒数比较。
[0031]35S::GmMYB181转基因植株单个长角果种子粒数要明显少于野生型拟南芥，在
0.01水平上存在显著差异。
【具体实施方式】
[0032]在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0033]下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0034]在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
[0035]实施例1大豆GmMYB181及其编码基因的克隆与鉴定
[0036]实验材料为大豆(Glycine max(L.)Merr.)地方品种猴子毛，由南京农业大学国家大豆改良中心种质资源研究室提供。本研究通过基因芯片技术从大豆的花中鉴定的多个花器官优势表达基因，选择其中I个编码MYB转录因子的基因片段(Gma.18002.1.Sl_at)进一步研究。将该基因片段进行EST拼接，序列比对发现其为NCBI网站上已命名的基因GmMYB 181 (DQ822906)，设计引物，进一步分离克隆GmMYB181基因cDNA全长序列。具体方法如下:[0037]取大豆的花，置于液氮中研碎，采用植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN DP404)进行总RNA提取。取5 μ g总RNA用反转录试剂盒(Τ0Υ0Β0公司)按试剂盒的方法进行反转录，以得到的cDNA片段为模板，利用SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的扩增GmMYB181开放阅读框的引物进行PCR反应。50μ1 PCR反应体系为:2μ1 cDNA (0.05 μ g)、上、下游引物各 2μ1 (10μΜ)、5μ1 10 X PCR 缓冲液、I μ I dNTP(lOmM)和 2U Taq DNA 聚合酶，用超纯水补足50 μ I。反应在Bio-RAD PTC200型PCR仪上进行，其程序为94°C预变性5min ；94°C变性50s，58°C退火50s，72°C延伸lmin，共32个循环；然后72°C延伸10min，4°C保存。PCR产物经回收、测序后，进行序列分析，结果表明该GmMYBlSl的开放阅读框具有序列表中SEQID N0.1的核苷酸序列，全长为627bp，编码SEQ ID N0.2所示的208个氨基酸。
[0038]实施例2 GmMYB181在大豆不同器官和不同时期果实中的表达特征
[0039]利用实时荧光定量PCR技术，对GmMYB181在大豆各个器官和不同发时期果实中的表达情况进行了研究。大豆实验材料于六月初播种于江浦农场，常规田间管理。收集根、茎、叶；第三片复叶展开时，收集完全盛开的成熟花后；取70々？(开花后7天)、15DAF、25DAF和40DAF的豆荚和种子。材料收集后均液氮速冻，_80°C冰箱保存备用。
[0040]总RNA的提取同实施例1。以大豆组成型表达基因Tubulin(GenBank登陆号为:AY907703)为内参基因，其扩增引物为=Tubulin正向引物序列:5’GGAGTTCACAGAGGCAGAG3’ (SEQ ID N0.7)，Tubulin 反向引物序列:5，CACTTACGCATCACATAGCA3 ’ (SEQ ID N0.8 )。以来自大豆不同组织或器官的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析。GmMYB181的扩增引物为:GmMYB181_qPCR正向引物序列:5，ACACTGGAATGTCTCTGGCTTAAA3，(SEQ ID N0.5)，GmMYB 181-qPCR 反向引物序列:5’ TTACAATGCACATAGCATCTCATTTG3’ (SEQ ID N0.6)。[0041]结果(图1)分析表明，GmMYB181在花中特异性表达，在根、茎、叶和果实中均不表达。[0042]实施例3 GmMYB 181转录因子的功能鉴定
[0043]利用Invitrogen 公司的 Gateway Φ Technology with Clonase?II 试剂盒，将 GmMYB181 重组到植物表达载体 pMDC83 (Curtis et al, 2003, PlantPhysiology.133,462-469)中，转化大肠杆菌DH5 α，转化液涂布于含50mg/L潮霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆。经测序验证后，提取质粒，得到pMDC83-GmMYB181植物过量表达载体(图2)，用冻融法将pMDC83-GmMYB181转入根癌农杆菌菌株EHA105 (BiovectorC0.，LTD)中。将pMDC83-GmMYB181通过农杆菌株EHA105的介导转化拟南芥，在含有50mg/L潮霉素的MS培养基上培养，初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因植株。
[0044]提取初步筛选得到具有潮霉素抗性的转基因拟南芥的基因组DNA，使用基因特异性引物 GmMYB181-BF:SEQ ID N0.9，和 GmMYB181-BR:SEQ ID N0.10 进行 PCR 鉴定。能够扩增出约为700bp大小条带的为阳性转基因拟南芥，扩增不出约为700bp大小条带的为阴性植株(图3)。选择PCR鉴定为阳性的植株，以GmMYB181-BF (SEQ ID N0.9)和GmMYB 181_BR(SEQ ID N0.10)为引物，进行RT-PCR。结果表明GmMYB181可在转基因拟南芥中表达(图4)。将PCR、RT-PCR检测均为阳性的转基因植株命名为35S::GmMYB181转基因拟南芥。
[0045]对35S::GmMYB181转基因拟南芥进行表型观察。在25°C、长日照的生长条件下，与对照相比，35S::GmMYB 181转基因拟南芥出现了稳定的花瓣卷曲突变性状(图5)，说明GmMYBlSl的异源表达能够影响花器官的正常发育。同时还出现了长角果变短小、植株矮化、侧枝增多的现象(图6，图7)。另外发现GmMYBlSl过量表达的转基因拟南芥的长角果不同程度上都短于对照植株的长角果长度，经过对各自单个长角果种子粒数的统计，发现转基因种子粒数/长角果明显少于对照的种子粒数/长角果，说明转基因植株长角果变短的同时也伴随每角果粒数变少的性状(图8)。此表型变化表明GmMYB181的过量表达有可能造成转基因拟南芥的产量降低，这为将来通过基因敲除手段，获得产量提高的转基因植株，尤其是转基因大豆提供了依据。
【权利要求】
1.大豆MYB转录因子基因GmMYB181，其特征在于核苷酸序列为SEQID N0.1。
2.权利要求1所述的大豆MYB转录因子基因GmMADS2编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID N0.2。
3.含有权利要求1所述的大豆MYB转录因子基因GmMYB181的表达载体。
4.权利要求1所述的大豆MYB转录因子基因GmMYB181的基因工程应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于权利要求1所述的大豆MYB转录因子基因GmMYB181在植物株型改变和生殖器官改造中的基因工程应用。
6.根据权利要求5所述的`应用，其特征在于所述的植物生殖器官为花和果荚形态。
【文档编号】A01H5/00GK103667317SQ201310713697
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】喻德跃, 薛茜, 黄方, 阚贵珍, 王慧 申请人:南京农业大学