专利名称：一种大豆WRKY类转录因子GmWRKY6及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域中的与耐逆性相关的WRKY类转录因子及其编码基因与应用，特别涉及来源于大豆的与耐逆性相关的WRKY类转录因子及其编码基因与其在培育耐逆植物品种中的应用。
背景技术：
环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、低温等胁迫因素对植物的生长发育具有重要影响，严重时会造成农作物大规模减产，因此培育耐逆性高的作物是种植业的主要目标之一。目前，应用基因工程技术进行育种已经成为提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物细胞具有多条途径应答环境中的各种逆境胁迫，其中转录因子起着调控耐逆相关效应基因表达的作用。现已在植物中发现了多类与植物耐逆性相关的转录因子，例如EREBP/AP2中的DREB类，bZIP，MYB等等。WRKY是植物特有的转录因子，这类转录因子的特点是具有1-2个WRKYGQK保守结构域和1-2个类锌指元件。迄今仅报道其与植物对病原菌的防卫、衰老、形态发生以及对伤害的应答等相关，还不知其是否与植物对非生物胁迫的耐性相关。
大豆是重要的油料作物，也是植物蛋白质的主要来源，弄清其耐逆机理，进而改善其耐逆性，具有重要的理论及现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于大豆的与耐逆性相关的WRKY类转录因子及其编码基因。
本发明所提供的大豆WRKY类转录因子，名称为GmWRKY6，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.))，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。
其中，序列表中的序列1由184个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第112位-118位氨基酸残基序列为WRKY类转录因子的WRKY保守结构域，自氨基端第122位-153位氨基酸残基序列为锌指结构。
上述大豆WRKY类转录因子的编码基因GmWRKY6是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSC，0.1％SDS的溶液中，在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由917个碱基组成，其编码序列为自5’端第34至第588位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第367到第387位碱基为GmWRKY6中保守的WRKY结构域的编码序列；自5’端第427到第522位碱基为锌指结构的编码序列；自5’端第589至第917位碱基为非翻译区。GmWRKY6的表达受乙烯、低温、高盐和干旱的诱导，并与植物对病原菌的防卫、衰老、形态发生以及对伤害的应答等相关。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增GmWRKY6中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
利用植物表达载体，将本发明的GmWRKY6的编码基因导入植物细胞，可获得对逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。
使用GmWRKY6构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明GmWRKY6的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等双子叶植物。
本发明的GmWRKY6对培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，提高农作物特别是大豆的产量具有重要意义。并且从分子生物学角度证明WRKY家族中的一些成员确实参与植物对非生物胁迫应答的调控，其表达与植物的耐非生物胁迫呈正相关。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
图1A-图1E为GmWRKY6在非生物逆境胁迫下的表达特性图2为GmWRKY6在大豆基因组中的结构图3为含有GmWRKY6的植物表达载体的构建示意4A-图4B为转GmWRKY6拟南芥与野生型植株在盐胁迫下和正常生长条件下的生长比较具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、大豆GmWRKY6编码基因的筛选及其cDNA的克隆1)在大豆EST数据库中进行BLAST检索，聚类到64个包括完整WRKY结构域的WRKY类基因片段，根据这64个WRKY的DNA序列设计64对引物；2)用常规方法从分别以250mM NaCl、干旱、-4℃处理(处理时间为3周)及未处理的(对照)大豆品种科丰1的苗中提取总RNA；3)以上述经不同方法处理的大豆苗的总RNA的逆转录产物为模板，并分别在64对引物的引导下，用RT-RCR方法测定64个WRKY的表达与上述处理的关系，20μl PCR反应体系为1μl一链cDNA、20μM上、下游引物各1μl、2μl10X PCR缓冲液、0.4μldNTP(10mM)和1U Taq DNA聚合酶，用超纯水补充反应体系至20μl。PCR反应条件为先94℃5min；然后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共31个循环；最后72℃延伸10min。
用引物15’-GTTTTCATTTACTACCATATTTA-3’和引物25’-CTAATACAAGATACTTACTT-3’可从经250mM NaCl和干燥处理的大豆材料中扩增到相同的基因，而在相同条件下从经-4℃处理和未处理的大豆材料扩增不到该基因，表明该基因的表达明显受干旱及高盐诱导，受低温抑制，将其命名为GmWRKY6。对该基因进行测序，测序结果表明GmWRKY6具有序列表中序列2的核苷酸序列，由917个碱基组成，其编码序列为自5’端第34至第588位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。序列1中自氨基端第112位-118位氨基酸残基为WRKY类转录因子的WRKY保守结构域，自氨基端第122位-153位氨基酸残基为锌指结构。GmWRKY6是一个WRKY类转录因子。
实施例2、GmWRKY6与植物中同类蛋白的比较将GmWRKY6的氨基酸残基序列与拟南芥及大豆的同类蛋白ATWRKY50(AAL61857)、ATWRKY51(AAL29429)和ATWRKY59(AAL50786)的氨基酸残基序列进行相似性比较，结果如表1所示，表明GmWRKY6与ATWRKY50、ATWRKY51和ATWRKY59的相似性分别为39.3％、38.9％和29.2％。
表1 GmWRKY6与同类蛋白的相似性和多样性百分数
实施例3、GmWRKY6基因在逆境胁迫下的表达特征将大豆品种科丰1的种子种在盆中，生长2星期后，对幼苗分别进行下述胁迫处理(处理时间为3周)干旱处理将大豆幼苗从土中取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，分别在光照条件下干旱培养0.5小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。
盐处理将大豆幼苗的根系置于250mM NaCl溶液中，分别在光照培养0.5小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。
乙烯处理将大豆幼苗的根系置于乙烯中，分别在光照培养0.5小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。
低温处理将小麦幼苗置于4℃培养箱中，分别在光照培养0.5小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。
渗透胁迫处理大豆幼苗的根系置于20％PEG溶液中，分别在光照培养0.5小时、1小时、3小时、6小时和12小时后取样。
取采集的经上述不同方法及不同处理时间处理的植物叶片各1g，置于液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，并用酸性苯酚、氯仿抽提，向上清中加入无水乙醇进行沉淀，最后将沉淀溶于水中得到总RNA。分别以用上述方法提取的不同大豆样品的RNA为模板，以32P-CTP标记的GmWRKY6的cDNA为探针，按常规方法对经干旱、高盐、乙烯和渗透胁迫处理的样品进行Northern分析；用RT-PCR的方法，在引物1和引物2的引导下，对经低温处理的样品进行GmWRKY6的表达分析。结果如图1A-图1E所示，表明GmWRKY6的表达明显受高盐、乙烯以及渗透胁迫诱导，受低温(4℃)抑制。
实施例4、GmWRKY6基因在大豆基因组中的结构用常规方法提取大豆品种科丰1的基因组DNA，将基因组DNA用内切酶Taq I，Hind III，EcoR I，EcoRV，Dra I和BamH I进行完全酶切后，以用32p-CTP标记的GmWRKY6的cDNA为探针，作Southern分析。结果如图2所示，表明GmWRKY6在大豆基因组中可能以单拷贝存在。
实施例5、GmWRKY6的功能鉴定1)以大豆品种科丰1的基因组DNA为模板，在引物1和引物2的引导下，PCR扩增GmWRKY6；2)如图3所示，将GmWRKY6正向插入pBin438(李太元，田颖川，秦晓峰，中国科学(B辑)，1994，24(3)，276-282)植物表达载体的BamH I和Kpn I酶切位点之间；3)将步骤2)构建的含有GmWRKY6的植物表达载体转化拟南芥。结果获得10余个转化植株，经Northern分析，表明其中至少3株中GmWRKY6的表达量很高。耐盐性试验表明在以250mM NaCl处理2周后，再置于正常条件下生长，结果如图4A-图4B所示(图4A为经250mM NaCl处理的植物，图4B为无胁迫处理条件下的植物)，在无胁迫处理条件下，转基因植株和野生型植株均可正常生长，而在高盐环境下，转基因植株的长势明显优于野生型植株，表明GmWRKY6确实可应答非生物胁迫，其表达与植物的耐非生物胁迫呈正相关。
序列表<210>1<211>184<212>PRT<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))<400>1Met Asp Phe Tyr Phe Gly Asn Ser Pro Pro Tyr Pro Asn Asn Tyr Ala1 5 10 15His Asn Ser Leu Asn Met Ala Leu Ser Ser Pro Glu Ile Ala Leu Ser20 25 30Asp Tyr Leu Met Leu Asp Asp Tyr Val Asp His Gln Asp Ser Arg Ser35 40 45Ser Gln Ser Thr Glu Ser Ser Glu Lys Ala Thr Phe Ser Asp Ala Thr50 55 60His Gly Phe Ser Thr Gly Ala Thr Ser Lys Asn Asn Asn Ile Asn Cys65 70 75 80Lys Asn Gly Ile Asn Glu Asn Lys Gly Gly ValGly Pro Arg Ile Ala85 90 95Phe Arg Thr Lys Ser Glu Leu Glu Ile Met Asp Asp Gly Tyr Lys Trp100 105 110Arg Lys Tyr Gly Lys Lys Ser Val Lys Ser Ser Pro Asn Leu Arg Asn115 120 125Tyr Tyr Lys Cys Ser Ser Gly Gly Cys Ser Val Lys Lys Arg Val Glu130 135 140Arg Asp Arg Asp Asp Tyr Ser Tyr Val Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Val145 150 155 160His Asn His Glu Ser Pro Phe Thr Thr Tyr Tyr Ser Pro Ile Ser Phe165 170 175Val His Ser Asp Thr Thr Phe Lys180
<210>2<211>917<212>DNA<213>大豆属大豆(Glycine max(L.))<400>2gttttcattt actaccatat ttagttatca gcaatggact tctactttgg aaactctcct 60ccttatccca ataattatgc tcataattct cttaatatgg ctctatcttc ccctgagatt 120gcactatccg attatctcat gctcgatgac tatgttgatc atcaagattc tcgatcatca 180caaagcaccg agtcatctga aaaagcaacc ttcagtgatg ccactcacgg attcagtact 240ggtgcaacct ctaagaataa taacataaac tgcaaaaatg ggattaatga aaacaaaggt 300ggagtgggtc caaggatcgc gtttagaacc aaatcagagc ttgagatcat ggatgatgga 360tacaagtgga ggaagtacgg caagaagtcc gtgaagagca gtcccaatct aaggaactac 420tacaaatgtt caagtggagg atgcagtgtg aagaaaaggg tggaaaggga tagagatgac 480tacagctacg tgataacaac atatgaaggt gtgcacaatc atgagagccc atttaccaca 540tactacagcc ccatctcctt cgtacattct gatactactt tcaaatgaca ccaacttcaa 600acccttttgg gcatttacac ctccctagct taattatgtg ccaagaaaaa gcttggaaga 660ttcgatcgag caggggaagc tatgtatcat tgcattgtct aatcaatcat aatttatttt 720catgctgtaa taggttgaag agagtttcta tacctttttt tggttccacg tttaatatat 780ctctcaatta aaaatcagcc tttgctagtt catgtaacaa ggaacatgat tctccatgtg 840taaagttgtt caaatcttaa aagtaagtat cttgtattag gattagagta tctctcttgt 900actctgttta ataataa91权利要求
1.一种大豆WRKY类转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述序列表中SEQ ID №1的自氨基端第112位-137位氨基酸残基序列为WRKY类转录因子的WRKY保守结构域。
3.编码权利要求1或2所述大豆WRKY类转录因子的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于它具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.含有权利要求3或4所述大豆WRKY类转录因子基因的植物表达载体。
6.含有权利要求3或4所述大豆WRKY类转录因子基因的细胞系。
7.含有权利要求3或4所述大豆WRKY类转录因子基因的宿主菌。
8.扩增权利要求3或4所述基因中任一片段的引物。
9.权利要求1或2所述的大豆WRKY类转录因子在培育抗逆性提高的植物中的应用。
10.权利要求3或4所述的大豆WRKY类转录因子基因在培育抗逆性提高的植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种大豆WRKY类转录因子GmWRKY6及其编码基因与应用。其目的是提供一种大豆WRKY类转录因子GmWRKY6及其编码基因与其在培育耐逆植物品种中的应用。该大豆WRKY类转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的蛋白质。本发明的GmWRKY1对培育耐逆植物品种特别是耐逆大豆品种，提高农作物特别是大豆的产量具有重要意义。
文档编号C12N15/29GK1814620SQ20051000520
公开日2006年8月9日 申请日期2005年2月1日 优先权日2005年2月1日
发明者陈受宜, 张劲松, 田爱国, 何锶洁, 杜保兴 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所