专利名称：胚胎的玻璃化冷冻、简易解冻和直接移植法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种玻璃化胚胎冷冻、解冻和直接移植方法，特别是用于哺乳动物的胚胎冷冻、解冻和移植方法，属胚胎生物技术领域。
背景技术：
1972年Whittingham首次采用二甲基亚砜(DimethylsulfoxideDMSO)为主体抗冻保护剂冷冻保存小鼠的2～8-细胞胚胎获得成功，并移植产下后代。他们所采用的冷冻液浓度为1.5Mol/L，使用程序化降温冷冻仪。冷冻解冻后胚胎成活率为50％～70％，胚胎妊娠率为65％，产仔率48％。程序化冷冻方法自发明以来，经各国研究者反复试验，并对各种冷冻保护剂进行筛选，使胚胎冷冻解冻后存活率达到90％以上，而冷冻程序基本不变，即-6℃植冰后，以-0.33℃/min的速率降至-30～-35℃，平衡后，再以-1.0℃/min的速度降至-80℃后投入液氮，整个过程约3个小时完成，到目前为止该方法仍被使用，称之为常规冷冻法。
常规冷冻的程序复杂、耗时长、效率低，更不适于边远牧区的胚胎冷冻保存和移植。为此，1985年Rall等发明胚胎玻璃化冷冻方法，使冷冻勿需借助冷冻仪，可在室温下进行操作。程序得到极大地简化。后经许多研究者的改进，目前胚胎的玻璃化冷冻方法仅需1分钟左右即可完成一个程序。胚胎冷冻解冻后存活率95％以上，移植妊娠率达60％～70％，产仔率平均为56％。产仔率比传统的程序化冷冻方法提高了8％。
但是，由于玻璃化冷冻液浓度非常高(6Mol/L以上)，胚胎在玻璃化冷冻液中的平衡时间一般不宜超过2分钟，即投入液氮中冷冻保存。因此，对于玻璃化冷冻保存的胚胎，移植前必须将胚胎由冷冻细管中推出，置于一定浓度(0.3～1.0Mol/L)的蔗糖溶液中5分钟左右，以脱除抗冻保护剂，并在显微镜下回收胚胎，将胚胎重新装管后再行移植。解冻过程不仅十分烦琐，且容易丢失胚胎，需要有操作熟练的技术人员。这些条件都制约了玻璃化冷冻方法在生产中的推广应用。
发明内容
本发明的目的是要提供一种胚胎的玻璃化冷冻、简易解冻和直接移植法，以简化胚胎玻璃化冷冻方法的解冻步骤，为使玻璃化冷冻的胚胎移植易于生产中推广应用。
为了达到本发明的目的所采取的技术方案包括以下胚胎的玻璃化冷冻法将冷冻液和解冻液分段装入细管内，每段液体之间都用一段空气隔开，其中在一段冷冻液中置入了经过预处理液处理过的胚胎，然后将细管封口、投入液氮，其特征在于，装入细管内的冷冻液和解冻液各有两段，其装管顺序为首先装入一段解冻液(6)，然后装入一段空气(3)，接着装入一段冷冻液(5)，再装入一段空气(3)，然后再装入一段冷冻液(4)，并在该段冷冻液中置入胚胎，接着再装入一段空气(3)，最后在管端装入一段解冻液(2)并封闭管口；装入细管内的冷冻液与解冻液的体积比值小于或等于1∶5。
上述的胚胎的玻璃化冷冻方法中，所述的冷冻液为EFS30，解冻液为0.3～1Mol/L蔗糖溶液。
上述的胚胎的玻璃化冷冻法中，所述的装入细管中的第二段解冻液(2)的长度为0.4～1.5cm，以0.5cm左右为宜。
上述的胚胎的玻璃化冷冻法中，装管时，按顺序吸入7.5cm长的解冻液-1cm长的空气-0.4cm长的冷冻液-0.5cm长的空气-0.6cm长的冷冻液-1cm长的空气，将胚胎移入0.6cm长的冷冻液节段后，吸入0.5cm长的解冻液后封口，投入液氮冷冻。
上述的胚胎的玻璃化冷冻法中，装管时，按顺序吸入6cm长的解冻液-1cm长的空气-0.4cm长的冷冻液-0.5cm长的空气-0.8cm长的冷冻液-1cm长的空气，将胚胎移入0.8cm长的冷冻液节段后，吸入1.8cm长的解冻液后封口，投入液氮冷冻。
上述的胚胎的玻璃化冷冻法中，所述的装管时，按顺序吸入8.2cm长的解冻液-0.5cm长的空气-0.3cm长的冷冻液-0.5cm长的空气-0.5cm长的冷冻液-1cm长的空气，将胚胎移入0.5cm长的冷冻液节段后，吸入少许解冻液后封口，投入液氮冷冻。
经过上述的胚胎的玻璃化冷冻法冷冻的胚胎的简易解冻和移植法为，在室温下，将冷冻保存胚胎的细管由液氮中取出后，空气浴4～6s，然后浸入20～25℃水浴中，待内容物融解后，取出细管，来回颠倒甩动细管，使细管内的液体混合均匀后，即实施胚胎移植。
上述的胚胎的简易解冻和移植法中，所述的室温以20～25℃为佳。
由于本发明采用了独特的装管方法，尽量减少了细管内冷冻液节段的长度，增加了解冻液节段的长度，解冻时，待内容物溶解后，使管内的冷冻液和解冻液充分混合，达到稀释冷冻液，脱除抗冻保护剂的效果，所以本发明有如下优点(1)最大限度地简化了胚胎玻璃化冷冻保存方法的解冻程序。本发明采用细管法玻璃化冷冻保存胚胎，解冻时胚胎不需出管脱毒，而是直接在管内使冷冻液和解冻液相混合，以达到稀释冷冻液，同时在管内脱除胚胎内部具有化学毒性作用的抗冻保护剂，所以本解冻方法比传统的解冻方法简单、胚胎不丢失。利用该方法解冻后，胚胎在管内3～12min，都能保证其存活率在95％左右，培养后囊胚孵化率达70％以上，不仅时间上能完全保证完成一个移植过程，而且总体水平比常规冷冻法和其他玻璃化冷冻法效果好、效率高。
(2)解决了冷冻前管内冷冻液和解冻液的合理配置和解冻后管内直接混合，使胚胎脱除抗冻保护剂后即可移植。该方法实现了玻璃化冷冻胚胎在管内脱毒、直接移植，简易方便，可操作性强，有利于在生产中推广。
图1为本发明的装管方法模式图。
实施例在如图1所示的装管方法中，1为棉栓及封口；2为封口液(其成分与6同)；3为空气段；4为含胚胎的冷冻液；5为冷冻液；6为解冻液。
本发明的玻璃化胚胎冷冻方法的发明点在于冷冻液和解冻液在细管内的配置与其他方法不同。由图1可以看出，本装管布置与现有玻璃化胚胎冷冻技术的“5段法”相比，减少了空气节数，也缩短了冷冻液节段的长度，这样可以保证用较多的解冻液来稀释高浓度的冷冻液，完成脱除胚胎内部抗冻保护剂的过程。由于冷冻液节段很短，如果装入胚胎后，在冷冻液移行的过程中，胚胎容易丢失。因此，本发明设计上使含有胚胎的冷冻液段4基本处于细管的后端，尽量减少冷冻液的移行，防止胚胎丢失进入解冻液中，造成胚胎冷冻后由于结晶而死亡。另外，如图所示，布置冷冻液节段“5”的作用是避免在装管时解冻液进入含胚胎的冷冻液节段4，改变该冷冻液浓度；而节段“2”的主要作用是封口时浸润封口粉，使其膨胀，防止封口不严密。
在如图所示的实施例的装管操作中首先在细管的棉栓端吸入约7.5cm长的解冻液(0.3～1Mol/L蔗糖溶液)，然后吸入约0.4cm和约0.6cm(导入胚胎)两段冷冻液，各液体间由空气隔开，基本布满了整个细管，最后封口的解冻液为0.5cm，使液体向前移动时，胚胎脱落、丢失的机会减少。
采用上玻璃化冷冻方法冷冻的胚胎，可以实现细管内解冻和直接移植解冻时，胚胎无需出管脱毒，而是将管内冷冻液和解冻液段经甩动充分混合，以脱除胚胎内部抗冻保护剂，即可实施移植。方法简单，可操作性强，生产中易于推广。
以下是本发明的几个实施例的实际操作方法(1)准备EFS30玻璃化冷冻保存溶液、冷冻预处理液及解冻液①EFS30以乙二醇(Ethylene glycolEG)为主体抗冻保护剂，加入聚蔗糖(Ficoll)和蔗糖(Sucrose)制成的玻璃化溶液。②10％的乙二醇(Ethylene glycolEG)按体积比(v/v)配制10％的EG作为预处理液。③0.5Mol/L的蔗糖(Sucrose)溶液以杜氏磷酸缓冲液(PBS)为基础液配制成0.5Mol/L的蔗糖溶液，作为管内解冻液。
(2)胚胎的装管及冷冻装管时，用0.25ml的塑料细管按图1所示顺序吸入解冻液和冷冻液，然后平行地置于操作台上，待经冷冻预处理液处理过的胚胎移入后，再吸入蔗糖溶液后封口，然后将细管直接投入液氮中冷冻保存。该装管方法各节段长度为参考值，在实际操作中，由于各操作人员手法不一，可能会稍有变动，这并不影响胚胎的存活率和发育率，但必须保证的是，冷冻液与解冻液长度(或体积)的比值小于或等于1∶5，这样混合后混合液中抗冻保护剂的浓度在2.0Mol/L以内，对胚胎毒性小。例如①装管时，按顺序吸入0.5Mol/L的蔗糖溶液(约7.5cm)—空气(约1cm)—冷冻液(约0.4cm)—空气(约0.5cm)—冷冻液(约0.6cm)—空气(约1cm)，将胚胎移入0.6cm长的冷冻液节段后，再吸入0.5cm的蔗糖溶液后封口，然后直接投入液氮中冷冻保存。
②装管时，吸入0.5Mol/L的蔗糖溶液(约6cm)—空气(约1cm)—冷冻液(约0.4cm)—空气(约0.5cm)—冷冻液(约0.8cm)—空气(约1cm)，将胚胎移入0.8cm长的冷冻液节段后，吸入约1.8cm的蔗糖溶液后封口，投入液氮冷冻保存。
③装管时，吸入0.5Mol/L的蔗糖溶液(约8.2cm)—空气(约0.5cm)—冷冻液(约0.3cm)—空气(约0.5cm)—冷冻液(约0.5cm)—空气(约1cm)，将胚胎移入0.5cm长的冷冻液节段后，吸入少许蔗糖后封口，投入液氮冷冻保存。
以上三种装管形式，在各节段长度上各有差异，但解冻后胚胎存活率及培养发育率均不受影响，这就允许在冷冻时操作上的视觉误差，保证了冷冻时的可操作性。但是，如果冷冻液与解冻液的比值大于1∶5时，混合后冷冻液中的抗冻保护剂的浓度依然较高，对胚胎有较大影响，尽管解冻后胚胎存活率不受影响，但胚胎的发育率较低。
(3)解冻室温下(20～25℃效果更佳)，将冷冻保存胚胎的细管由液氮中取出后，空气浴4～6s后，浸入20～25℃水浴中，待内容物融解后，取出细管，拭干表面水珠，然后来回颠倒甩动细管3～4次，使管内的冷冻液与解冻液混合均匀后，即可施行胚胎移植。自胚胎解冻后到移植完毕在5～10分钟完成为宜。
用上述方法对小鼠的桑椹胚进行玻璃化冷冻保存，解冻后混合冷冻液与解冻液，胚胎处于管内的混合液环境中5min，出管检查，胚胎存活率达95.8％(91/95)，培养孵化率达70.5％(67/95)，移植妊娠率100％(11/11)，产仔率58.71％(91/155)。证明这种冷冻解冻方法是简便可行的。
在装管过程中，解冻液2要求尽量短，0.5cm左右，能满足封口要求即可。这样在装管过程中含有胚胎的冷冻液节段在管内移行的距离较短，避免了胚胎的丢失。
在实际操作，上述实施例中的冷冻液(EFS30)和解冻液浓度(0.3-1.0Mol/L)可以换成其他的冷冻液(如EFS40等)或其他的解冻液浓度(如0.8Mol/L的蔗糖，甚至其他糖，如岩藻糖)，不影响本发明的实现。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.一种胚胎的玻璃化冷冻法，是将冷冻液和解冻液分段装入细管内，每段液体之间都用一段空气隔开，其中在一段冷冻液中置入了经过预处理液处理过的胚胎，然后将细管封口、投入液氮，其特征在于，装入细管内的冷冻液和解冻液各有两段，其装管顺序为首先装入一段解冻液(6)，然后装入一段空气(3)，接着装入一段冷冻液(5)，再装入一段空气(3)，然后再装入一段冷冻液(4)，并在该段冷冻液中置入胚胎，接着再装入一段空气(3)，最后在管端装入一段解冻液(2)并封闭管口；装入细管内的冷冻液与解冻液的体积比值小于或等于1∶5，或混合后混合液中抗冻保护剂的浓度在2.0Mol/L以内。
2.根据权利要求1所述的胚胎的玻璃化冷冻法，其特征在于，装入细管中的第二段解冻液(2)的长度为0.4～1.5cm。
3.根据权利要求1或2所述的胚胎的玻璃化冷冻法，其特征在于，装管时，按顺序吸入7.5cm长的解冻液-1cm长的空气-0.4cm长的冷冻液-0.5cm长的空气-0.6cm长的冷冻液-1cm长的空气，将胚胎移入0.6cm长的冷冻液节段后，吸入0.5cm长的解冻液后封口，投入液氮冷冻。
4.根据权利要求1或2所述的胚胎的玻璃化冷冻法，其特征在于，装管时，按顺序吸入6cm长的解冻液-1cm长的空气-0.4cm长的冷冻液-0.5cm长的空气-0.8cm长的冷冻液-1cm长的空气，将胚胎移入0.8cm长的冷冻液节段后，吸入1.8cm长的解冻液后封口，投入液氮冷冻。
5.根据权利要求1或2所述的胚胎的玻璃化冷冻法，其特征在于，装管时，按顺序吸入8.2cm长的解冻液-0.5cm长的空气-0.3cm长的冷冻液-0.5cm长的空气-0.5cm长的冷冻液-1cm长的空气，将胚胎移入0.5cm长的冷冻液节段后，吸入少许解冻液后封口，投入液氮冷冻。
6.一种采用权利要求1所述的胚胎的玻璃化冷冻法冷冻的胚胎的简易解冻和移植法，其特征在于，在室温下，将冷冻保存胚胎的细管由液氮中取出后，空气浴4～6s，然后浸入20～25℃水浴中，待内容物融解后，取出细管，来回颠倒甩动细管，使细管内的液体混合均匀后，即实施胚胎移植。
7.根据权利要求7所述的胚胎的简易解冻和移植法，其特征在于，所述的室温以20～25℃为佳。
全文摘要
本发明公开了一种玻璃化胚胎冷冻、解冻和直接移植方法，属胚胎生物技术领域。技术方案包括将冷冻液和解冻液分段装入细管，每段液体用空气隔开，其中一段冷冻液中置入了胚胎，后封口细管、投入液氮，特征是，装入细管内的冷冻液和解冻液各有两段，冷冻液与解冻液的体积比小于或等于1∶5，或混合后混合液中抗冻保护剂的浓度在2.0Mol/L以内。本发明的简易解冻和移植法为，在室温下，将冷冻保存胚胎的细管由液氮中取出，空气浴4～6s，20～25℃水浴，取出细管，来回颠倒甩动细管，使冷冻液混合均匀，即移植胚胎。本发明极大地简化了胚胎玻璃化冷冻后的解冻程序，实现了胚胎在管内脱毒、直接移植，简易方便，可操作性强，利于推广应用。
文档编号C12N5/06GK1654635SQ20051000491
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月28日 优先权日2005年1月28日
发明者朱士恩, 杨中强, 侯云鹏 申请人:中国农业大学