专利名称：一步法胚胎玻璃化冷冻保存的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胚胎生物技术，特别是一种胚胎冷冻保存技术。
1972年Whittingham等首先利用小鼠2～8细胞胚胎冷冻保存(传统冷冻方法)成功并移植后获得后代，他们采用二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide:DMSO)为主体抗冻保护剂，浓度为1.5Mol/L，使用降温冷冻仪，以-0.33℃/min的速度降至-30～-35℃，然后再以-1.0℃/min的速度降至-80℃后投入液氮中，整个程序约需3小时。冷冻解冻后胚胎成活率为50～70％。妊娠率为65％，产仔率为48％。
1985年Rall等发明了胚胎玻璃化冷冻方法，他们利用DMSO、乙酰胺(Acetamide)、丙二醇(Propylene glycol)为主体的抗冻保护剂，配制成浓度高达6Mol/L的玻璃化溶液(VS1)，不使用降温冷冻仪，在室温下对小鼠2-细胞、8-细胞和桑椹胚进行冷冻保存，该方法需要分三步降温(22℃下胚胎于25％VS液中平衡15分钟→4℃下于50％VS液中平衡10分钟→4℃下于100％VS液中平衡10分钟)，整个程序需要35分钟，由于所用抗冻保护剂对胚胎的化学毒性较大，冷冻后胚胎的成活率不稳定(46％～95％)，产仔率较低(22％～38％)。
本发明的目的在于提供一种冷冻时间短；成本低；操作简单；无冰晶；适用范围广；胚胎成活率、移植妊娠率、产仔率高。
为达到上述发明目的，1995年以来，发明者筛选了抗冻保护剂，利用化学毒性较小、渗透较快的乙二醇(Ethylene glycol:EG)为主体抗冻保护剂，并与葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)组合，研制成和玻璃化溶液，浓度大于7.0Mol/L，在室温(20～25℃)下，对小鼠桑椹胚～囊胚进行一步法玻璃化冷冻保存。即将胚胎移入含有EDT溶液的塑料细管中平衡0.5或1分钟直接投入液氮，即快速简易玻璃化冷冻保存法。
一步法胚胎玻璃化冷冻保存，其特点在于将葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀释成30％和0.5Mol/L浓度的混合液，然后与乙二醇8∶2(或7∶3或6∶4)(v/v)混合后配制成EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液。
在室温(20～25℃)下，将胚胎移入含有EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液的0.25ml塑料细管中平衡0.5～1分钟，封口后直接投入液氮中冷冻保存。
将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约10秒钟完成解冻程序。
本发明的有益效果在于(1)冷冻时间短改变了传统方法的时间长，即一个冷冻程序3小时缩短为0.5或1分钟；(2)成本低、操作简单传统方法中使用降温冷冻仪(约4万美元/台)冷冻胚胎。本方法在室温(20～25℃)下徒手操作；(3)无冰晶传统冷冻方法有冰晶生成。本方法无冰晶生成，即呈玻璃化状态，可避免冰晶对胚胎的物理性损伤；(4)适用范围广传统冷冻方法需要在实验室内进行。本方法不仅在实验室内，也可在现场操作，特别是在无电和边远牧区更为实用；
(5)胚胎成活率、移植妊娠率、产仔率高与传统的方法相比，本方法冷冻后小鼠胚胎成活率(94～96％)、移植妊娠率(57～75％)和产仔率(52％～66％)，总体水平提高了5～10％。
本发明始于1995年，目的是开发一种操作简单、速度快、成本低、效率高的哺乳动物胚胎玻璃化冷冻方法。由于传统的冷冻方法(Whittingham等，1972)操作时间长、效率低，更不适应边远牧区的胚胎冷冻保存。而Rall等(1985)发明的胚胎玻璃化冷冻保存方法中利用DMSO、乙酰胺等为主体的抗冻保护剂，配制成的玻璃化溶液对胚胎的化学毒性较强，造成解冻后胚胎成活率小高，且实验的重复性不佳。根据上述问题，发明人首先对几种抗冻保护剂进行筛选，通过对胚胎的毒性试验及胚胎细胞膜的通透性测定，证明乙二醇的化学毒性最小且通透性强，其次是丙三醇、丙二醇、DMSO、乙酰胺。为此，发明者以乙二醇为主体抗冻保护剂，添加大分子物质葡聚糖和产生渗透压作用的海藻糖配制成EDT液，其浓度大于7.0Mol/l。为避免其对胚胎的化学毒害作用，胚胎经短时间处理(0.5～1分钟)后，直接投入液氮冷冻保存。这种方法即能使抗冻保护剂乙二醇充分渗透入胚胎细胞内部，又能在冷冻的瞬间形成玻璃化状态；即降低了抗冻保护剂对胚胎的化学毒性，又克服了对胚胎的物理性损伤。冷冻保存后的小鼠桑椹胚～囊胚的成活率达95％以上，并获得了较高的移植妊娠率。本方法对其他家畜如兔、牛和绵羊胚胎的冷冻保存也有同样效果。
下面是本发明的两个实施例实施例一将葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀释成30％和0.5Mol/L浓度的混合液，然后与乙二醇7∶3(v/v)混合后配制成EDT30玻璃化溶液。
在室温20℃下，然后将胚胎移入含有EDT30玻璃化溶液的0.25ml塑料细管中平衡0.5～1分钟，封口后直接投入液氮中冷冻保存。
需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20℃水浴中，约10秒钟完成解冻程序。
实施例二将葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀释成30％和0.5Mol/L浓度的混合液，然后与乙二醇6∶4(v/v)混合后配制成EDT40玻璃化溶液。
在室温25℃下，然后将胚胎移入含有EDT40玻璃化溶液的0.25ml塑料细管中平衡0.5～1分钟，封口后直接投入液氮中冷冻保存。
需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入25℃水浴中，约10秒钟完成解冻程序。
权利要求
1.一步法胚胎玻璃化冷冻保存，其特征在于将葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀释成30％和0.5Mol/L浓度的混合液，然后与乙二醇8∶2(或7∶3或6∶4)(v/v)混合后配制成EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液。在室温(20～25℃)下，将胚胎移入含有EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液的0.25ml塑料细管中平衡0.5～1分钟，封口后直接投入液氮中冷冻保存。需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中，约10秒钟完成解冻程序。
2.如权利要求l所述的一步法胚胎玻璃化冷冻保存，其特征在于将葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀释成30％和0.5Mol/L浓度的混合液，然后与乙二醇7∶3(v/v)混合后配制成EDT30玻璃化溶液。在室温20℃下，将胚胎移入含有EDT30玻璃化溶液的0.25ml塑料细管中平衡0.5～1分钟，封口后直接投入液氮中冷冻保存。需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20℃水浴中，约10秒钟完成解冻程序。
3.如权利要求1所述的一步法胚胎玻璃化冷冻保存，其特征在于将葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀释成30％和0.5Mol/L浓度的混合液，然后与乙二醇6∶4(v/v)混合后配制成EDT40玻璃化溶液。在室温25℃下，将胚胎移入含有EDT40玻璃化溶液的0.25ml塑料细管中平衡0.5～1分钟，封口后直接投入液氮中冷冻保存。需要解冻时，将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入25℃水浴中，约10秒钟完成解冻程序。
全文摘要
本发明涉及一种胚胎生物技术,特别是一种胚胎冷冻保存技术。其特点在于:将葡聚糖(Dextran)和海藻糖(Trehalose)用PBS液稀释成30%和0.5mol/L浓度的混合液,然后与乙二醇8∶2(或7∶3或6∶4)(v/v)混合后配制成EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液。在室温(20～25℃)下,将胚胎移入含有EDT20(或EDT30或EDT40)玻璃化溶液的0.25ml塑料细管中平衡0.5～1分钟,封口后直接投入液氮中冷冻保存。将冷冻保存的细管由液氮中取出后直接浸入20～25℃水浴中,约10秒钟完成解冻程序。
文档编号A01N1/02GK1322467SQ0010628
公开日2001年11月21日 申请日期2000年5月8日 优先权日2000年5月8日
发明者朱士恩, 曾申明, 左琴, 张忠诚 申请人:朱士恩